2. 江苏省疾病预防控制中心放射防护所, 南京 210009
2. Department of Radiation Protection, Jiangsu Provincial Center of Disease Control and Prevention, Nanjing 210009, China
2014年5月,江苏省南京市某园区发生一起192Ir放射源丢失事故,拾源者“王”受到较大剂量的非均匀性意外照射,临床诊断为外照射轻度骨髓型急性放射病、Ⅳ度急性放射性皮肤损伤,受照后短期内采集外周血进行常规染色体畸变分析,估算的生物剂量为1.51 Gy[1]。为了观察电离辐射远后效应和筛选回顾性剂量估算方法,2018年5月江苏省疾病预防控制中心组织对事故患者“王”受照后4年的医学随访,中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所负责生物剂量学随访相关工作。本研究分析了非稳定性染色体畸变(双着丝粒+着丝粒环)(dic+r)、微核(micronu- cleus,MN)、核质桥(nucleoplasmic bridge,NPB),采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridi-zation,FISH)技术及G显带(G banding)方法检测染色体易位等细胞遗传学指标,并参照相关剂量效应曲线进行生物剂量估算,并与事故后短期内的生物剂量进行比较。
材料与方法1.常规染色体标本的制备及分析:抽取“王”外周血3 ml至肝素抗凝试管中,取700 μl肝素抗凝外周血,加入到含20%胎牛血清、0.2%植物凝血素(phytohemagglutinin,PHA)及终浓度为0.04 μg/ml秋水仙素的RPMI 1640培养基中,37℃温箱培养56 h收获细胞,制备细胞悬液,用于常规染色体、荧光原位杂交、G显带标本的制备[2]。滴片、姬姆萨染色,在光学显微镜下放大1 000倍观察,选择染色体(46±1)条、分散良好、长度适中的中期分裂相,分析1 000个中期分裂相,记录双着丝粒染色体及着丝粒环的数量。
2.胞质分裂阻滞微核及核质桥标本的制备及分析:取400 μl肝素抗凝外周血加入到培养基中,37℃温箱培养44 h后加入终浓度10 μg/ml的松胞素B(cytochalasin-B,Cyt-B),混匀后继续避光培养至72 h收获细胞。光学显微镜下(×400,×1 000)观察分析6 000个胞膜完整、界限清晰的双核细胞,记录微核、核质桥的数量[3]。
3.荧光原位杂交标本的制备及分析:取染色体细胞悬液进行蒸汽滴片,50℃烤箱中老化30 min,加入10 μl直接荧光标记的1号全染色体探针杂交液,封片后在73℃水浴锅中变性3 min,将玻片放入湿盒置于37℃温箱中杂交过夜,洗脱后自然干燥,加入10 μl 4′, 6-二脒基2-苯基吲哚(DAPI)染液,避光作用10 min,在荧光显微镜下放大1 000倍观察,分析1 000个染色体中期分裂相,按文献[2]方法记录染色体易位的数量。
4.G显带标本的制备及分析:取染色体细胞悬液进行蒸汽滴片,置于60℃烤片机上过夜。将玻片放入37℃水浴预温的0.02%胰蛋白酶溶液中,消化时间约为3 min 30 s;漂洗2次后姬姆萨染色,放大1 000倍观察,分析150个中期分裂相,按文献[2]方法记录染色体易位的数量。
5.剂量估算:双着丝粒+着丝粒环、微核、核质桥、易位所应用的剂量效应曲线公式见表 1。将分析得到的(双着丝粒+着丝粒环)数/细胞、微核数/细胞、核质桥数/细胞、易位数/细胞及其95%可信区间的上下限代入对应的已建立的剂量-效应曲线,估算受照剂量。计数资料(率)用发生率±标准误(p±Sp)表示。
结果
1. 3种细胞遗传指标随时间衰减的情况:在光学显微镜下分析了1 000个染色体中期分裂相,观察到41个双着丝粒+着丝粒环;分析了6 000个双核淋巴细胞,观察到188个微核及12个核质桥。与事故受照人员受照后5、40、280 d的结果进行比较,照后4年的染色体双着丝粒+着丝粒环、微核、核质桥的发生率呈现下降趋势(表 2)。与受照后5 d相比,受照后40、280 d和4年双着丝粒+着丝粒环发生率分别降低了50%、69%和77%,微核发生率分别降低了60%、82%和81%,核质桥发生率分别降低了47%、75%和94%。
2.利用5种细胞遗传学方法进行回顾性剂量重建:以染色体双着丝粒+着丝粒环、微核、核质桥为指标,根据相应的剂量曲线,照射后4年的样本估算剂量结果分别为0.56(0.45,0.68)Gy、0.45(0.36,0.54)Gy、0.41(0.10,0.71)Gy(表 3),均低于事故后短期利用相应指标估算的剂量,进而计算出照后4年的剂量校正系数分别为2.70、3.27、3.17。双着丝粒+着丝粒环、微核、核质桥估算剂量的修正系数与时间的变化规律符合幂函数模型,回归方程见表 4。
用1号全染色体探针进行荧光原位杂交后,在荧光显微镜下分析了1 000个染色体中期分裂相,观察到16个与1号染色体有关的染色体易位,根据公式FG=Fp/2.05fp(1-fp)(FG为全基因组畸变率,Fp检测到的易位率,fp为1号全染色体探针在全基因组中所占份额),换算成全基因组染色体易位率为0.103/细胞,估算的剂量为1.45(1.00,1.79)Gy(表 3)。接近事故后短期内利用非稳定性染色体畸变估算的剂量,95%可信区间范围增大。
用G显带方法分析了150个中期分裂相,观察到11个染色体易位。由于目前尚无G显带方法分析易位的剂量效应曲线,故应用荧光原位杂交技术分析易位的剂量-效应曲线,估算的剂量为1.21(0.81,1.65)Gy(表 3)。该估算的剂量接近事故后短期内利用非稳定性染色体畸变估算的剂量,95%可信区间范围增大。
讨论电离辐射的远后效应是指在机体受到较大剂量的电离辐射后,在较长一段时间后(通常为半年以上甚至数十年)出现的机体病理变化。对放射事故人员进行系统全面的医学随访,不但能做好患者的医疗保健工作,还能长期观察患者的远后效应,并针对出现的各种症状及时采取对症治疗。本文报道的南京事故患者“王”在受照后经过长达1年多的治疗好转出院,目前恢复良好。本研究应用5种细胞遗传学方法,分析了“王”受照后第4年的非稳定性染色体畸变、微核、核质桥、染色体易位等生物学指标,并估算了生物剂量。
辐射生物剂量估算方法中,最常用的是人外周血淋巴细胞染色体畸变分析,其中非稳定性染色体畸变(双着丝粒+着丝粒环)对辐射具有较强的特异性,估算剂量准确,已得到国际原子能机构(International Atomic Energy Agency, IAEA)的推荐,被称为辐射生物剂量估算“金标准”[5],在国内外多次核和辐射事故中发挥重要作用。本研究应用染色体畸变分析估算的受照后第4年的剂量为0.56 Gy,事故发生后第5、40及280天应用该方法估算的剂量分别为1.51、1.00和0.77 Gy[6]。此病例外周血中双着丝粒+着丝粒环的发生频率呈现进行性下降,事故发生后第5天双着丝粒+着丝粒环发生率为0.179/细胞,且随着时间的推移,双着丝粒+着丝粒环的发生率继续下降,受照后4年的发生率为0.041/细胞。Ramalho等[7]对巴西Goiania 137Cs源事故中受照剂量超过1 Gy的21人进行了定期随访观察,发现“双+环”的频率下降一半的时间为照射后90~220 d,平均为130 d。本实验室对忻州事故受照人员的随访也证实了上述结果[8]。戴宏等[6]报道的事故受照人员“双+环”频率衰减至一半的时间为40 d左右[6],比上述报道的时间短很多,这可能与该人员是受到极度不均匀照射有关。金璀珍[9]提出“双+环”估算剂量在受照后6~8周内较为准确,因此在进行回顾性剂量重建时,需根据“双+环”随时间衰减的规律,测算出一个修正系数,才能够估算出事故发生时的剂量,但修正系数的计算尚需大量资料证实。
人外周血淋巴细胞胞质分裂阻滞微核(cytokinesis-block micronucleus, CBMN)分析也应用于事故患者生物剂量估算。胞质分裂阻滞分析最初用于检测双核细胞中的微核。随着细胞组学研究的进展,该方法还可分析双核细胞的核质桥,可反映细胞的损伤程度[10]。本研究应用胞质分裂阻滞分析,以微核为指标估算的生物剂量为0.45 Gy,以核质桥为指标估算的生物剂量为0.41 Gy,与事故发生后第5天相比显著下降。微核及核质桥的数量在受照后的衰减速度较快,40 d后已经不能准确估算实际受照剂量。
根据受照后4年的估算剂量与戴宏等[1, 6]的结果,计算出非稳定性染色体畸变、微核、核质桥的修正系数,并发现修正系数具有随受照后时间增加而上升的规律,在受照后1年内上升较快,随后上升缓慢并趋于平稳。应用修正系数重新进行剂量估算后,非稳定性染色体畸变的估算结果与事故发生后5 d的结果非常相近,微核、核质桥的估算结果则高于当时的结果,且不确定度范围增加。表明应用修正系数校正后,非稳定性染色体畸变方法在一定时间范围内可用于回顾性剂量估算,但仍需进一步研究从而提高修正系数的准确性,而微核及核质桥方法不推荐用于回顾性剂量估算。
本研究应用荧光原位杂交技术对染色体易位进行检测,估算的生物剂量为1.45 Gy,与事故发生后5 d的结果(1.51 Gy)相近,并无明显下降。由于本研究仅用1号全染色体探针,在同样分析1 000个染色体中期分裂相的情况下,检测到的易位数量较双着丝粒+着丝粒环的数量少,故以易位为指标估算剂量的变动范围(1.00~1.79 Gy)比以双着丝粒+着丝粒环为指标估算剂量的变动范围(1.40~1.61 Gy)要宽。易位属于稳定性染色体畸变,机体受照后可在体内长期存在,在数十年内保持稳定。Huber等[11]应用荧光原位杂交技术对切尔诺贝利核事故后5年的受照人员提供了回顾性剂量估算资料。刘伟等[12]用1号、4号全染色体探针进行荧光原位杂交分析,对22名早年从事探伤人员进行剂量重建,估算的生物剂量与物理剂量基本一致,提示应用荧光原位杂交技术可用于核和辐射事故后的回顾性剂量重建。刘双梅等[13]检测介入放射人员的易位率,结果表明介入放射工作人员的染色体易位率显著高于对照组,且易位率随工龄增加而增加,提示应用荧光原位杂交技术检测染色体易位还可对长期小剂量受照人员进行剂量重建。本研究组应用荧光原位杂交技术对山西忻州事故患者受照后16年进行回顾性剂量重建,估算的剂量为0.76 Gy,而事故后短期内估算的生物剂量为2.30 Gy[8],提示在进行事故后10年以上受照人员的回顾性剂量重建时,需要使用剂量修正系数[14],但仍需积累大量资料。
本研究还应用G显带方法检测染色体易位,但由于本实验室并未建立G显带的剂量效应曲线,估算剂量时应用的是荧光原位杂交技术分析染色体易位的剂量效应曲线,与事故发生后5 d估算的剂量相比,估算的剂量也比较接近,因此应用G显带方法检测染色体易位也可用于回顾性剂量重建,但还需要更多的研究证实。G显带方法是根据每条染色体带纹特征从而识别单条染色体,一般可显示染色体的320条带纹,高分辨显带方法可以得到更多的带纹,可能提高易位的识别率。与荧光原位杂交技术检测染色体易位相比,本研究中应用G显带方法对易位染色体的检出率相对较低,可能由于对染色体细微结构异常识别能力较低造成。Wang等[15]应用荧光原位杂交与G显带方法对2008年太原事故人员进行随访,结果显示,受照后5年,对受照剂量最大者(3.5 Gy)两种方法检出的易位率一致,但剂量相对低的两例受照者G显带方法检出的易位率高于荧光原位杂交方法,他们认为,荧光原位杂交方法可能对受照剂量相对较高或有复杂易位时的检测更敏感,而G显带方法可能更适合对受照剂量相对较低时的易位畸变检测。李进等[16]应用荧光原位杂交技术和G显带分析医用诊断X射线工作者的染色体易位,G显带法可以检测到染色体倒位,而荧光原位杂交技术能分析出其他染色体在靶染色体上发生的插入,但不能识别倒位。
综上所述,根据事故发生后4年的随访结果,荧光原位杂交技术及G显带方法分析染色体易位估算的剂量与事故当时估算的剂量基本一致,适用于回顾性剂量估算。而双着丝粒+着丝粒环估算的剂量明显低于事故当时估算的剂量,需应用修正系数进行校正。随着放射源管理制度的不断完善及辐射防护技术的逐渐提高,放射损伤事故案例比较少见,且不同事故类型不同,各具特点。因此,应对每起事故进行深入总结,对事故患者进行长期随访,为辐射事故应急、放射医学及辐射防护等领域积累科学依据。
利益冲突 无
作者贡献声明 陆雪、赵骅负责实验操作、论文撰写;王进、李爽、田雪蕾、王福如负责协助实验操作、数据分析;田梅、余宁乐、刘青杰负责指导课题设计、论文修改
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