自从2009年法国学者Vaurijoux等^[1]首次报道借助图像分析系统半自动检测双着丝粒体(dicentrics, dic)估算塞内加尔达喀尔辐射事故受照者的生物剂量以来，来自欧美的学者利用细胞遗传工作站(染色体自动扫描分析系统)自动分析dic，并建立基于每细胞dic数的剂量-效应曲线，系统研究了影响基于dic自动分析的因素及将其应用于快速和高通量估算剂量的可行性^[2]。最近，欧美学者利用包括图像流式细胞术在内的新技术或新平台已实现基于dic自动分析的快速、高通量的生物剂量估算，以满足应对发生大规模核辐射事件时医学应急响应的需要^[3-4]。但是，国内的相关研究有限，目前有基于⁶⁰Co γ射线离体照射人外周血半自动分析dic构建剂量-效应曲线的报道^[5]，dic半自动和人工分析估算生物剂量比较的研究鲜见报道。为此，本研究利用⁶⁰Co γ射线离体照射人外周血构建基于dic半自动和人工分析的剂量效应曲线，并对所构建曲线进行验证，探讨与人工分析相比dic半自动分析估算剂量的优势及主要影响因素，为国内同行开展dic半自动分析估算剂量工作提供参考。

1.血样采集：在签属知情同意书的前提下采集两名成年健康男性外周血10 ml，肝素抗凝，平均分装至8个无菌照射管内备用。献血者均无吸烟、有毒、有害化学物质和近期射线接触史。

2.照射条件：采用中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所二级标准剂量学实验室⁶⁰Co γ射线治疗机进行照射，在室温下进行单次照射，剂量点分别为0、0.5、1、2、3、4、5和6 Gy，剂量率为0.27 Gy/min，剂量误差为± 1%。照射结束后将血液样品置37℃温箱中静置2 h修复。

3.细胞培养、收获和制片：分别吸取各剂量点血液0.5 ml，加入含有20%胎牛血清(美国GIBCO公司)的4.5 ml RPMI1640培养液中[100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、0.05 μg/ml秋水仙素和0.2 mg/ml植物血凝素(美国Sigma-Aldrich公司)]，37℃恒温培养52 h收获细胞。用0.075 mol/L氯化钾(KCl)在37℃条件下低渗10 min，新鲜配制的甲醇:冰醋酸(V :V=3:1)预固定、固定细胞、滴片和姬姆萨染色。

4.染色体畸变分析

(1) dic半自动分析：按照高通量染色体自动扫描系统(Metafer 4，V3.13.2，德国Carl ZEISS公司)操作指南对染色体标本片进行全玻片自动中期相寻找及高倍图像采集(采集的高倍图像数≥100)，对采集到的高倍图像使用DCScore软件(德国Carl ZEISS公司)进行dic自动分析，导出人工确认前软件给出的dic和分析细胞数(自动分析)；对软件检测到的所有dic由人工根据经验确认，剔除假阳性dic后，再导出软件给出经过人工确认的dic数和分析细胞数(半自动分析)。结果以每细胞dic数表示。同时通过计算人工确认前后的dic假阳性率，分析该指标与照射剂量的关系。

(2) dic或dic+r人工分析：使用上述Metafer 4系统采集到的高倍图像，用Ikaros软件(德国Carl ZEISS公司)对图像进行核型分析，每例标本仅计数(46±1)条染色体的中期相。记录dic和着丝粒环(ring, r)数，观察到的畸变由两名经验丰富的阅片者审核后给出，结果以每细胞dic或dic+r数表示。

5.剂量-效应曲线的拟合：按照国际上公认的免费专业剂量-曲线刻度软件CABAS说明^[6]，将自动、半自动和人工分析得到的每细胞dic或dic+r数、分析细胞数和对应的照射剂量，分别输入至该软件，拟合出相应的剂量曲线。拟合的最佳方程为二次线性方程，即Y=C+αD+βD²，Y为每细胞dic或dic+r数；D为照射剂量，Gy；C为本底畸变率，%；α为线性系数；β为线性平方系数。

6.剂量-效应曲线的验证：利用河南省职业病防治研究院毒理室2014—2019年期间参加全国生物剂量能力考核留存的12份样品的染色体标本片进行dic自动、半自动分析，将检测到的每细胞dic数、分析细胞数和当年人工分析得到的dic或dic+r数与相应分析细胞数分别代入拟合的dic半自动和人工曲线估算剂量，并与样品的实际照射剂量和当年度利用GB/T 28236-2011标准^[7]推荐曲线估算剂量进行比较，验证新拟合曲线估算剂量的可行性。

7.统计学处理：采用SPSS 21.0软件进行统计分析。分析前对数据进行正态性及方差齐性检验，各组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。剂量-效应关系采用Spearman相关性分析。P < 0.05为差异有统计学意义。估算剂量的相对偏差=│估算剂量-照射剂量│/照射剂量×100%。dic假阳性率=│人工确认前的dic数-人工确认后的dic数│/人工确认前的dic数×100%。

1.自动分析检测到的dic假阳性率与照射剂量的关系：图 1为DCScore软件(德国CARL ZEISS公司)检测到的dic阳性和主要假阳性类型。γ射线诱发的dic假阳性率有随照射剂量的增加而降低的趋势(4.18%~99.67%)，且照射剂量>2和3 Gy时，假阳性率分别 < 30%与20%(图 2)。

注:B~H为外周血淋巴细胞假阳性dic 图 1 DCScore软件检测人外周血淋巴细胞dic的阳性和假阳性表现A.外周血淋巴细胞阳性dic；B.长臂接触的染色体；C.短臂接触的染色体；D.短臂和长臂接触的染色体；E.长臂交叉的亚中部着丝粒染色体；F.长臂交叉的端部着丝粒染色体；G.长臂扭转的染色体；H.单体断裂的染色体 Figure 1 Positive and false positive dic detected by DCScore in peripheral blood lymphocytes A. Positive dic of peripheral blood lymphocytes; B. Touching long arm of chromosomes; C. Touching short arm of chromosomes; D. Touching short and long arm of chromosomes; E. Cross long arm of submetacentric chromosome; F. Cross long arm of telocentric chromosomes; G. Twisted chromosome; H. Chromatid break chromosome

图 2 自动检测人外周血细胞dic假阳性率与照射剂量的关系 Figure 2 Relation of false positive rate of dic detected by DCScore and radiation doses

2.半自动和人工分析检测的每细胞dic或dic+r数及剂量-效应曲线的拟合：0~6 Gy ⁶⁰Co γ射线照射血样后半自动和人工分析检测到的每细胞dic数见表 1。可见，半自动和人工分析检测到的畸变数均随照射剂量的增加而升高(r≥0.972，P < 0.01)。

表 1(Table 1)

表 1 不同剂量不同分析方法检测的每细胞dic数 Table 1 Number of dic per cell obtained by different detection methods in peripheral blood lymphocy tesirradiated with different doses 剂量(Gy) 半自动分析 人工分析 细胞数 每细胞dic数 细胞数 每细胞dic数 0 10 000 0.000 2 2 000 0.000 5 0.5 3 968 0.026 5 2 300 0.043 5 1 2 141 0.068 2 1 500 0.103 3 2 1 586 0.185 4 606 0.397 7 3 1 203 0.384 0 566 0.839 2 4 1 022 0.579 3 361 1.429 4 5 957 0.838 0 350 2.140 0 6 862 1.114 9 279 3.000 0 r值 0.984 0.972   注：dic.双着丝粒体

表 1 不同剂量不同分析方法检测的每细胞dic数 Table 1 Number of dic per cell obtained by different detection methods in peripheral blood lymphocy tesirradiated with different doses

应用CABAS软件对基于半自动和人工分析检测到的每细胞dic或dic+r数进行拟合剂量曲线，由表 2可以看出，3条曲线回归方程的回归系数检验P值均 < 0.01，R²≥0.998，均具有较为理想的拟合度。而0~6 Gy ⁶⁰Co γ射线照射血样后基于人工分析dic和dic+r拟合的曲线有较好的一致性(ICC=0.992，P < 0.001)。此外，人工分析检测到的dic产额大约是半自动分析的2倍。

表 2(Table 2)

表 2 不同分析方法拟合外周血dic或dic+r的剂量-效应回归方程 Table 2 Regression equations of dose effect curves of dic or dic+r based on different analysis methods 方法 对象 剂量-效应曲线 χ2值 df P值 R2值 半自动 dic Y1=0.024 628D2+0.044 228D+0.000 195 4 4.726 7 5 < 0.01 0.998 人工 dic Y2=0.077 959D2+0.038 983D+0.000 520 4 4.160 7 5 < 0.01 0.999 dic+r Y3=0.084 976D2+0.038 535D+0.000 516 6 4.501 7 5 < 0.01 0.999   注：Y1、Y2.每细胞dic数；Y3.每细胞dic+r数；D.照射剂量，Gy；df.自由度；R2为相关系数

表 2 不同分析方法拟合外周血dic或dic+r的剂量-效应回归方程 Table 2 Regression equations of dose effect curves of dic or dic+r based on different analysis methods

3.两种方法估算剂量的验证与准确性比较

(1) 半自动分析曲线的验证：将自动分析检测到12份考核样品人工确认前后的每细胞dic数，代入基于γ射线照射拟合的回归方程Y₁估算剂量。结果显示，dic人工确认前，照射剂量为0.7 Gy估算的剂量为1.67 Gy，与实际照射剂量相对偏差138.57%；照射剂量为1~2 Gy(1.4、1.7和1.9 Gy)，估算剂量的相对偏差在40.71~28.42%之间(1.97、2.33和2.44 Gy)；照射剂量>2 Gy时估算的剂量相对偏差均≤20.48%；>3 Gy时估算剂量的相对偏差均≤11.11%。dic人工确认后估算的剂量与实际照射剂量的相对偏差均≤±10%，接近于真实照射剂量。提示基于dic半自动分析拟合的剂量曲线可以用于辐射事故受照者的剂量估算和临床分类诊断，特别是在发生大规模核辐射事故受照人员较多时，可用人工确认前检测的dic数据估算剂量，对受照者区分出不同的受照剂量区间，做出更快速的初步分类诊断。

(2) 人工分析曲线的验证：将人工分析检测到12份考核样品的每细胞dic数和dic+r数，分别代入γ射线照射拟合的回归方程Y₂、Y₃和GB/T 28236-2011标准推荐曲线(Y=0.080 398D²+0.034 037D+0.007 351 2)^[7]估算剂量。基于每细胞dic数拟合的曲线(Y₂)估算的剂量与实际照射剂量的相对偏差除1份样品(照射剂量为0.7 Gy)为-25.71%外，其他样品均≤±11.36%，接近于真实照射剂量。而基于每细胞dic+r数拟合的曲线(Y₃)与Y₂曲线估算的剂量差异无统计学意义(P>0.05)，具有较好的一致性(ICC>0.999，P < 0.001)，说明基于每细胞dic和dic+r数拟合的曲线用于剂量估算是可行的，进一步验证了仅计数dic估算剂量亦具有可行性。国家标准推荐曲线估算的剂量与实际照射剂量之间差异无统计学意义(P>0.05)，但Y₃曲线估算剂量的相对偏差似优于国家标准推荐曲线，且两条曲线估算的剂量间差异有统计学意义(χ²=-2.688，P < 0.05)。

(3) 两种方法估算剂量准确性及与真实照射剂量的比较：半自动分析和人工分析方法估算的剂量与真实照射剂量三者间比较差异无统计学意义(2.51±1.09、2.53±1.13、2.53±1.09，P>0.05，表 3)，而半自动、人工分析dic估算的剂量和真实照剂量间两两比较差异亦均无统计学意义(P>0.05)。进一步说明基于dic半自动和人工分析拟合的剂量曲线均能较为准确地估算剂量。

表 3(Table 3)

表 3 12份考核样品半自动和人工分析估算剂量均值与真实照射剂量的比较 Table 3 Comparison of the mean dose estimated by semi- automatic and manual analysis with the real dose of 12 standard samplesanalyses in twelve proof samples 样品 真实剂量 半自动分析 人工分析 1 1.4 1.51 1.37 2 2.8 2.59 2.80 3 3.9 4.10 4.02 4 1.9 1.88 2.04 5 1.7 1.74 1.75 6 2.8 2.61 2.55 7 3.6 3.70 3.63 8 2.2 2.07 2.45 9 2.8 2.81 2.74 10 2.1 2.20 1.92 11 0.7 0.63 0.52 12 4.5 4.31 4.53

表 3 12份考核样品半自动和人工分析估算剂量均值与真实照射剂量的比较 Table 3 Comparison of the mean dose estimated by semi- automatic and manual analysis with the real dose of 12 standard samplesanalyses in twelve proof samples

4.半自动和人工分析用时比较：用Metafer 4系统采集的200个高倍图像，分别用DCScore和Ikaros软件进行dic半自动和人工分析，比较两种计数方法所用时间。由于两种分析均需要借助染色体扫描系统进行全玻片自动中期相寻找及高倍图像采集，所需时间同为25 min。对系统采集的200个高倍图像平均按150个图像可供人工分析，依据每个图像包含dic数不同，本实验室分析1个图像所用时间一般在0.5~1.5 min，每个图像平均按1 min计算，人工分析平均需要用时150 min，人工分析总计需要175 min；而dic自动分析和对候选dic的人工确认分别只需要用时1和2 min，半自动分析总计需要28 min。人工分析所用时间是半自动分析的6.25倍(175/28)，除去前面相同操作时间，半自动分析可将人工工作效率提高75倍(150/2)。

有关dic半自动和人工分析估算剂量的比较国外学者已开展了较为系统的研究。欧洲学者分别利用¹³⁷Cs和⁶⁰Co γ射线照射人外周血^{[1, 8]}，使用Metafer 4(V. 3.5.101)染色体扫描分析系统自动采集高倍图像，对采集到的图像分别用Ikaros软件和DCScore软件进行dic人工和半自动分析，利用两种方法检出的每细胞dic数拟合剂量-效应曲线并估算剂量。两种分析方法拟合的曲线均符合线性平方模型，半自动分析检出的dic产额大约是人工分析的1/2，对46例达喀尔辐射事故受照者和离体模拟照射外周血估算剂量的验证结果显示，两种方法估算的剂量基本一致，dic半自动分析可代替人工分析估算剂量，并可将估算剂量的效率提高4~6倍^[8]。本研究利用⁶⁰Co γ射线照射人外周血基于dic半自动和人工分析拟合的曲线和对曲线的验证得到基本一致结果，而且本研究基于dic半自动分析拟合曲线的与dic产额相关的线性平方系数(β)与国外报道的β值(0.021 7和0.022 7)类似^{[1, 8]}，高于国内学者的相关报道(0.018 1)^[5]。此外，本研究对12份考核样品的初步验证结果显示，dic半自动分析估算剂量的相对偏差均≤±10%，似优于人工分析估算剂量的相对偏差(≤±25.71%)。说明本研究构建的基于dic半自动分析的剂量-效应曲线可较为准确估算剂量，并可明显提高剂量估算和技术人员工作的效率。此外，与半自动分析相比，人工分析需要在显微镜下或高倍染色体图片中寻找dic，费时费力，还可能造成漏检，半自动分析软件会标出检测到的dic，只需要人工识别出真阳性的dic并剔除假阳性dic，而且有经验或经过短期培训的分析者较容易区分出真、假阳性dic，可较为准确估算剂量^[9]。可见dic半自动分析还更有利于推广应用。

目前，国内对辐射事故受照者生物剂量估算和全国生物剂量能力考核大都是采用人工分析dic+r方法估算剂量^[10]，而按照国际原子能机构(IAEA)推荐的仅计数dic方法估算剂量的报道较少^[11]。最近，李爽等^[12]报道了通过计数不同结构类型dic拟合剂量-效应曲线，发现基于经典型、经典+单端型和所有类型dic拟合的曲线估算剂量无差异，计数经典型dic估算生物剂量是可行的，还可在一定程度上提高生物剂量估算的水平和效率。本研究基于人工计数dic拟合曲线估算的剂量得到类似结果，而且分别基于计数dic和dic+r拟合的曲线估算剂量的差异无统计学意义，进一步验证了计数dic代替计数dic+r估算生物剂量是可行的，而且仅计数dic代替dic+r估算剂量可以克服着丝粒环和无着丝粒环不易区分而造成估算剂量误差，进而还可提高染色体畸变的分析效率^{[4, 12]}。此外，本研究基于人工分析dic+r拟合曲线估算剂量的相对偏差优于国家标准推荐曲线，两条曲线估算的剂量间差异有统计学意义，显示有条件的实验室建立各自的曲线可更准确估算剂量。

国外有报道表明，DCScore软件检出的dic假阳性率与照射剂量呈负相关，在0~5 Gy照射剂量范围内检出的dic假阳性率在99%~10%之间，照射剂量>2 Gy的假阳性率均不超过20%^[8]，本研究结果类似。生物剂量估算的最重要实用价值是在发生核辐射事故时对受照者进行尽早和快速的临床分类诊断。为了探讨不经人工确认前软件自动检出包含假阳性dic用于剂量估算和临床分类诊断的可行性，本研究尝试用软件检出未经人工确认的dic数估算剂量。结果显示，除了照射剂量低于1 Gy(0.7 Gy)估算的剂量相对偏差大不适用于分类诊断外，照射剂量为1.4、1.7和1.9 Gy估算的剂量可区分出轻度或中度偏轻骨髓性急性放射病，用于分类诊断有可行性，而照射剂量大于2 Gy估算的剂量已较为准确，可满足临床分类诊断的需要。提示利用目前版本Metafer 4(V3.13.2)系统自动检测dic估算的剂量，在一定照射剂量条件下用于临床分类诊断是可行性的。

关于dic自动分析估算剂量在辐射应急响应分类诊断中应计数的细胞数，美国学者Ryan等^[13]通过调整Metafer系统中期相寻找算法和提高DCScore软件自动检测dic的灵敏度，在不需要人工干预去除假阳性dic的情况下，自动检测150个左右的细胞估算的剂量就能较好地区分出照射剂量为0.5~3.0 Gy的模拟X射线或γ射线照射。认为dic自动分析作为检测工具可有效的应用于发生大规模核辐射事故时快速的临床分类诊断。本研究也尝试自动检测100~200个细胞估算剂量，显示照射剂量>2 Gy时估算的剂量用于临床分类诊断有可行性(资料未显示)，如本研究照射剂量为3.6 Gy的考核样品仅检测到84个细胞估算的剂量已较为准确。因此，通过调整染色体自动扫描系统相关参数设置提高dic检测的灵敏度、增加照射剂量点和模拟不同的辐射场景，探讨不同照射剂量和辐射场景条件下可应对临床分类诊断自动而非人工干预需要分析的细胞数，实现真正意义的自动和快速估算剂量，将是下一步的主要工作目标。

综上所述，本研究构建的⁶⁰Co γ诱发基于半自动和人工分析dic拟合的剂量-效应曲线，可以较为准确地估算出考核样品的受照剂量；与人工分析相比，dic半自动分析可明显提高生物剂量估算的效率；在一定照射剂量范围内，自动而非人工干预检测dic估算的剂量用于临床分类诊断是可行的。未来，在进一步探讨dic自动分析的影响因素和优化相关条件的基础上，提高基于dic自动分析估算剂量的效率和水平，以更好应对核辐射医学应急生物剂量估算的需要。

利益冲突  无

作者贡献声明  韩林负责染色体畸变分析、数据整理和论文撰写；陆雪负责染色体标本制备和数据整理；李杰和李爽负责染色体畸变自动与人工分析工作；王平负责数据整理和统计分析；刘青杰和吕玉民负责项目整体设计、论文撰写指导及修改