外周血淋巴细胞微核率作为反映电离辐射损伤的敏感指标之一[1],已纳入《放射工作人员职业健康管理办法》的必检项目[2]。淋巴细胞微核率与生物剂量间有一定的量效关系,是生物剂量估算的主要指标之一[3]。目前淋巴细胞微核分析主要采用人工在显微镜下阅片分析,即在高倍显微镜下分析每份样本中1 000个转化淋巴细胞中的微核,费时费力。随着技术进步,2009年Decordier等[4]建立了胞质分裂阻滞微核(CBMN)的自动图像分析方法,目前该方法主要用于药物开发早期基因毒性分析的初步筛选、工业毒理学及生物监测领域[5-6]和快速、高通量的辐射生物剂量估算等[7-8]。但微核自动分析应用于放射工作人员体检的研究尚鲜见报道。为了提高微核检测的工作效率,本研究选取2019年度参加河南省职业病防治研究院职业健康体检的2 005例放射工作人员为观察对象,利用高通量染色体自动扫描系统进行微核自动检测及分析其影响因素,探讨微核自动分析方法用于放射工作人员体检微核检测的可行性。
资料与方法1.研究对象:采用整群抽样方法,选择2019年河南省省直医院放射工作人员及部分企业2 005例放射工作人员为观察对象,按工种将放射工作人员分为放射诊断、放射治疗、核医学、介入放射学和工业应用5组。采集年龄、性别、工种和放射工龄等在内的基本信息,并收集年有效剂量。
2.仪器与试剂:高通量染色体自动扫描系统(Metafer 4)为德国Carl ZEISS公司产品,该系统包含微核自动扫描分析软件;CX31显微镜为日本奥林巴斯株式会社产品;RGD-3B型热释光剂量仪、GR-200 A型LiF (Mg,Cu,P)热释光探测器购自北京防化研究院;PTW精密程序退火炉购自德国PTW-Freiburg公司;RPMI 1640淋巴细胞培养液购自青岛莱佛生物有限公司。甲醇、冰乙酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司。Giemsa染色液购自广州达晖生物技术股份有限公司。
3.个人剂量监测方法:依据GBZ 128-2016《职业性外照射个人剂量监测》标准[9],采用热释光剂量方法进行监测。详见文献[10]。
4.外周血微量全血培养与微核标本制备:在知情同意的情况下(河南省职业病防治研究院伦理审查批号:201902),采集上述观察对象3 ml外周血样品,采用本实验室微量全血常规培养法制备外周血淋巴细胞微核标本片[11]。
5.微核分析
(1) 人工分析:在普通光学显微镜(×100,油镜)下,每例观察1 000个胞浆完整、已转化的淋巴细胞,记录淋巴细胞中的微核数,结果以微核率(×10-3)表示。
(2) 微核自动分析:应用高通量染色体自动扫描系统中微核自动扫描分析软件,在10倍物镜下对淋巴细胞进行自动扫描,并同步捕获2 000个转化的淋巴细胞。扫描结束后软件给出自动检测的含微核的细胞,人工去除假阳性微核,自动检测到微核的假阳性率为94.56%±4.14% (69.00%~100.00%),然后将软件给出的经过人工确认的微核数和分析细胞数等数据导出,结果以微核率(×10-3)表示。自动扫描系统每次可批量扫描80张玻片,设定相关程序后,无需人员操作自动完成细胞的扫描和捕获。图 1显示的为阳性和假阳性微核。
6.统计学处理:数据采用SPSS 21.0软件进行分析。微核率采用p±sp描述,两组或多组间微核率比较采用非参数检验(Kruskal-Wallis H检验);计量资料符合正态分布者,如年龄、年有效剂量等,采用x±s描述,组间均数比较经方差齐性检验采用单因素方差分析;不符合正态分布者,如工龄,用中位数和范围进行统计描述,组间比较采用非参数检验;采用多重线性回归分析进行年龄、性别、工种、工龄、年有效剂量对微核率的影响大小分析;采用组内相关系数(ICC)比较人工分析与自动分析微核率结果的一致性,其中ICC>0.75为一致性较好,0.40~0.75为一般,< 0.40为一致性较差。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1.基本情况:在2 005例观察对象中,男性1 176名,女性829名,平均年龄为(37.28±9.49)岁(22.0~84.0岁),放射工龄中位数为8年,范围1~65年。按工种将放射工作人员分为5组,各组放射工作人员基本情况见表 1。5组在性别、工龄方面分别存在明显差异(F=29.737, χ2=78.720,P < 0.05)。
2.不同放射工种的自动分析微核率:自动检测2 005例放射工作人员的微核率为(0.92±0.02)×10-3。按工种的不同将放射工作人员分为放射诊断、放射治疗、核医学、介入放射学和工业应用5组,不同工种间微核率的差异有统计学意义(χ2=11.054,P < 0.05)。组间两两比较,介入放射学组的微核率明显高于放射诊断、放射治疗及核医学组(χ2=5.568、5.334、7.689,P < 0.05)。见表 2。
3.不同工龄的自动分析微核率:按照工龄的四分位数,将放射工作人员分为工龄“ < 5”、“5~”、“10~”和“20~”年4组,4组间微核率的差异无统计学意义(P>0.05,表 3),但Pearson相关分析显示,工龄与微核率呈正相关(r=0.050,P < 0.05),放射工作人员微核率有随着工龄增加有升高趋势。
4.人均年有效剂量与自动分析微核率的关系:收集放射工作人员年有效剂量资料,在剔除剂量缺失和失真的人员后剩余728人,年有效剂量均值为(0.46±0.73)mSv/年,分析年有效剂量与微核率的关系。结果显示,不同工种放射工作人员的人均年有效剂量间的差异有统计学意义(F=3.496,P < 0.05),其中介入放射学组放射工作人员的人均年有效剂量明显高于其他组(P < 0.05)。
不同工种放射工作人员的工龄间差异有统计学意义(χ2=11.593,P<0.05),但不同工种放射工作人员微核率间的差异没有统计学意义(P>0.05)。在医学应用放射工作人员中,不同工种放射工作人员的年有效剂量、工龄及微核率间的差异都有统计学意义(F=3.026, χ2=11.582、8.878,P<0.05)。Pearson相关分析结果显示,年有效剂量与微核率呈正相关(r=0.106,P<0.05),随着年有效剂量的增加微核率有升高趋势。详见表 4。
5.微核率影响因素相关分析:以2 005名放射工作人员自动分析微核率为因变量,以年龄、性别、放射工种、放射工龄为自变量,进行多重线性回归分析(R=0.079,P<0.05)。结果显示,放射工种和放射工龄对微核率水平有影响(t=2.451、2.688,P < 0.05, 表 5)。
6.自动与人工分析检出微核率及检测效率比较:从2 005名放射工作人员微核样本中,按照系统抽样方法,抽取微核标本200例,采用显微镜阅片法进行人工分析,并对自动和人工检测方法检出的微核率和用时进行比较分析。结果显示,自动分析与人工分析检测的微核率分别是(0.91±0.02)×10-3和(1.35±0.08)×10-3,自动分析检测得到的微核率明显低于人工分析(χ2=24.690,P<0.001,表 6)。自动分析与人工分析微核率的组内相关系数ICC为0.713(P < 0.001),两种分析方法有一致性。自动分析及人工分析的检测总用时长分别为1 125及5 854 min,自动分析平均用时(5.63±1.06)min明显要少于人工分析(29.26±2.17)min,差异有统计学意义(t=-140.555,P<0.05),自动分析可将检测效率提高5倍以上。
讨论
在辐射生物剂量估算研究领域,目前国际上利用CB微核自动分析已构建了全自动、快速和高通量且已实现商业化的生物剂量估算系统(RABiT-II),以应对发生大规模核辐射事故时的医学应急需要[12]。在工业毒理和遗传毒性研究领域,国外有学者利用不同浓度化学物质(如多菌灵和环磷酰胺)诱导微核,探讨CB微核自动分析用于遗传毒性监测的可行性,发现自动和人工分析检测到的微核率是一致的,且自动分析能明显提高检测效率,微核自动分析是较为理想的化学物质遗传毒性监测方法[5]。但微核自动分析用于评价低剂量电离辐射的遗传毒性效应鲜见报道。本研究尝试用微核自动分析检测放射工作人员的微核率变化,评价其用于放射工作人员微核检测的可行性。结果显示,不同工种间自动分析检出的微核率差异具有统计学意义,其中介入放射学组微核率明显高于其他组,自动分析检出的微核率与放射工龄、放射工种有一定相关性。虽然自动分析检测的微核率明显低于人工分析,但两者检出的微核率有一致性,而且自动分析可明显提高微核的检测效率。这些结果与本实验室早先和最近报道的人工分析放射工作人员微核[11, 13]和天津市放射工作人员人工微核分析结果[14]基本一致。此外,本研究自动分析检出微核率的变化趋势与国内外文献报道的对放射工作人员非稳定性染色体畸变分析的结果基本一致,即放射工种、工龄和暴露剂量等是影响放射工作人员非稳定染色体畸变的主要因素[15-17],而微核主要来自于非稳定性染色体畸变。说明自动分析的微核率能反映放射工作人员的微核情况,用于放射工作人员职业健康检查具有可行性。
不同工种放射工作人员接触电离辐射的方式、群体受照剂量、辐射防护方法及措施等方面都有一定差异。本研究年有效剂量监测结果显示,不同放射工种的年有效剂量不同,介入放射学组的年有效剂量明显高于其他组,与国内诸多文献报道基本一致[18-19], 也与本研究观察到的介入放射学组微核率明显高于其他各组以及本课题组最近对医疗行业放射工作人员染色体畸变的分析结果基本一致[15]。分析其原因,可能与介入放射学需要在射线或其他影像导向监护下近台操作、辐射防护措施不同于其他工种等有关;另一方面,也与近年来医院介入科室工作开展量逐年增加,低剂量辐射累积量增多有关。因此,介入放射工作人员辐射防护问题仍是重中之重。
放射工龄、年有效剂量可间接反映放射工作人员的累积剂量。本研究观察到的不同放射工龄组间微核率未显示差异,可能与不同工龄间不同工种放射工作人员所占的比例不同有关。此外,不同工种的微核率未显示随人均年有效剂量的增加有升高趋势,尤其是放射治疗组年有效剂量低于核医学组,但放射治疗组微核率高于核医学组,分析其原因可能与放射治疗组的放射工龄高于核医学组有关。
单因素相关分析结果显示,放射工种、放射工龄、年有效剂量与微核率间存在相关关系,但多重线性回归分析结果显示,放射工种、放射工龄是微核率的影响因素,表明放射工种和放射工龄可能是通过影响放射工作人员的累积剂量影响了微核率的变化,这一推测与国外报道的累积剂量对非稳定性染色体畸变有明显影响的结果相符[20-21]。本研究结果显示,年有效剂量不是微核率的影响因素,这与本实验室人工分析结果一致[13],但作为累积剂量的一个主要影响因素,年有效剂量可能与放射工种、放射工龄间存在交互作用,共同影响累积剂量,导致微核率的变化。放射工种、放射工龄、年有效剂量间对微核影响的交互作用,在以后的研究中值得进一步探讨。
综上所述,本文自动分析微核检测结果与人工检测结果基本相符,即放射工种和工龄是影响微核率的主要因素,医学应用放射工作人员的微核率有随年有效剂量的增加有升高趋势。提示自动分析检出的微核率亦能够反映慢性低剂量辐射的遗传损伤水平,而且可大幅度提高检测效率。因此,自动分析用于放射工作人员微核检测有可行性。未来在进一步探讨本底值、分析细胞数和暴露剂量等因素对微核自动分析影响的基础上,优化完善外周血淋巴细胞微核自动检测方法。预期可作为低剂量暴露辐射人群健康风险评估的快速和高通量的筛查方法,可明显提高放射工作人员细胞遗传学指标健康监护的检测效率,在国内有较为广泛的推广应用前景和实用价值。
利益冲突 无
作者贡献声明 王平负责数据整理与分析、论文撰写;李杰和韩林负责微核标本的自动和人工分析工作;轩月兰负责个人剂量监测;王喜爱和王兆男负责微核标本的制备;吕玉民负责项目整体设计、论文撰写指导与修改
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