2019, Vol. 39
2. 济南市第四人民医院肿瘤放疗科 250031;
3. 山东省肿瘤防治研究院 山东省肿瘤医院肿瘤放疗科, 济南 250117
2. Department of Radiation Oncology, Jinan Fourth People's Hospital, Jinan 250031, China;
3. Department of Radiation Oncology, Shandong Cancer Hospital and Institute, Jinan 250117, China
目前，放射治疗的不良反应仍然不可避免，不仅影响患者的生活质量，甚至会中断放疗，降低疗效[1]。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是绿茶的主要成分，对正常组织放射损伤具有防治作用，但具体机制仍不清楚[2]。为此，本研究探讨EGCG对放射性食管炎动物模型新西兰兔的影响，分析其与相对分子质量67×103层粘连蛋白受体(67LR)的相关性。
材料与方法1.实验动物：普通级健康雄性新西兰兔，体重(2.14±0.07)kg，8~10周龄，购自扬州仪征安立卯生物科技有限公司。动物许可证号：SCXK(苏)2016-0013。饲养环境为温度22~25℃, 湿度55%~65%。
2.药品与试剂：EGCG，纯度：95%，购自宁波禾普生物技术有限公司(配置成浓度为440 μmol/L的EGCG盐溶液)、兔白细胞介素1β(IL-1β)、兔白细胞介素6(IL-6)；兔转移趋化生长因子β1(TGF-β1)和兔肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒均购自武汉Cusabio公司；磷酸盐缓冲液(PBS，南京生兴生物公司)；免疫组织化学试剂盒购自丹麦Dako公司。
3.主要仪器：SDS-PAGE电泳仪及湿法转膜仪(美国Bio-Rad公司)；Tanon5200化学发光检测系统(上海Tanon科技有限公司)；放疗加速器(美国瓦里安公司)。
4.模型分组和处置：雄性新西兰兔30只，用随机数表法分为3组，每组10只，分别为空白组、生理盐水组与EGCG组。生理盐水组与EGCG组新西兰兔用4%的戊巴比妥钠(1.5 ml/kg)耳缘静脉麻醉后，仰卧位固定治疗床上。采用瓦里安直线加速器6 MV X射线，对新西兰兔颈部食管进行单次照射。照射野为颈部1/2处往膈肌食管裂口6 cm，颈部正中4 cm，深度为皮下1.5 cm，照射剂量率为2 Gy/min，源皮距100 cm，单次照射30 Gy[3]。空白组不进行照射。
照射后第2天分别对EGCG组、生理盐水组进行EGCG和生理盐水给药。EGCG的给药浓度为440 μmol/L，每天3次，间隔6 h，每次10 ml，给药后禁食水30 min，连续5 d。生理盐水给药剂量、次数、时间间隔同上。给药方法为大鼠灌胃针给药。
5.标本采集与处理：分别于照射前及照射后每日取血清，分别取空白组、生理盐水组与EGCG组新西兰兔血液各2 ml。采血管置于冷冻离心机12 000 r/min，离心半径8 cm，4℃离心10 min，取上清做(ELISA)检测。采血时间点为造模前1 d，给药当天开始每天各取1次，给药5 d后麻醉处死新西兰兔，完整剥取食管，一半固定于4%多聚甲醛24 h以上，脱水，包埋，修整后4 μm切片，剩余样本放在液氮罐暂存后保存至-80℃。
6.食管组织病理观察：取食管组织石蜡切片，脱蜡，苏木素-伊红染色。脱水封片后，显微镜镜检，图像采集分析。染色结果为细胞核蓝色，细胞质红色。评分标准参考文献[4]。食管组织损伤程度分为0分：无损伤；1分：轻度坏死脱落；2分：中度坏死脱落；3分：重度坏死脱落。炎症细胞浸润深度分为0分：无炎症细胞浸润；1分：仅固有层和黏膜下层有少量炎症细胞浸润；2分：固有层和黏膜下层有中量炎症细胞浸润；3分：固有层和黏膜下层有大量炎症细胞浸润，肌层和外膜层均有炎症细胞浸润。
7.食管组织免疫组织化学分析：取食管组织石蜡切片，烘片2 h，脱蜡水化，微波修复，过氧化氢溶液孵育，封闭。加入50 μl稀释的一抗覆盖组织，4℃过夜。冲洗除液后加入二抗，4℃孵育50 min。二氨基联苯胺(DAB，丹麦Dako公司)底物显色。苏木素复染，乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。67LR免疫组织化学染色的阳性信号呈棕黄色颗粒，显色强时为棕褐色颗粒。每张组织切片摄取3个视野(×100)，运用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对图片进行分析计算吸光度(A)值。
8. Western blot检测：按试剂盒说明书提取蛋白，Bradford蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)进行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜、封闭，一抗(按1:1 000稀释比例)4℃孵育过夜，和相应二抗(1:5 000稀释)室温孵育2 h，之后使用增强型化学发光系统(ECL)进行化学发光，按照试剂盒说明书操作。于Tanon凝胶成像仪下拍照，计算蛋白量。重复3次，取均数。
9.用ELISA法测定新西兰兔血清IL-1β、IL-6、TGF-β及TNF-α水平：取出保存的兔血清，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，酶标仪450 nm波长检测吸光度，计算新西兰兔血清IL-1β、IL-6、TGF-β及TNF-α水平。
10.统计学处理：用SPSS 17.0软件包对数据进行分析，分析前对数据进行正态性及方差齐性检验，符合的计量资料以x±s表示，非正态分布资料进行对数转换。各组间比较用单因素方差分析，其后两两比较应用LSD检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1.一般情况及体重变化：各组新西兰兔进食及活动情况正常，照射前、照射后、用药结束后空白组、生理盐水组、EGCG组同一时间点体重差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.食管组织病理变化评分比较：图 1为各组的典型表现。在镜下可见空白组食管组织形态结构完好，无水肿、出血和炎性细胞浸润等情况；生理盐水组食管黏膜鳞状上皮层坏死脱落，黏膜充血、糜烂，产生脓肿，固有层、黏膜下层甚至肌层可见大量炎性细胞浸润；EGCG组炎细胞浸润较少，出血也较生理盐水组有一定程度的减少。空白组、生理盐水组、EGCG组食管组织损伤评分分别为0、2.10±0.74、1.60±0.70；炎症细胞浸润分别为0、1.90±0.57、1.20±0.42；最终食管组织病理变化程度评分分别为0、3.90±1.10、2.80±0.92。各组间两两比较差异均有统计学意义(t=10.54、7.56、2.97，P < 0.05)。
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图 1 各组新西兰兔食管组织的病理观察HE染色×100 A.空白组；B.生理盐水组；C. EGCG组 Figure 1 The pathological changes in esophagus tissue of rabbit with HE staining ×100 A. blank group; B. saline group; C. EGCG group |
3.血清IL-1β、IL-6、TGF-β及TNF-α水平比较：如图 2所示，相对于空白组，照射后随时间延长生理盐水组IL-1β、IL-6、TGF-β及TNF-α表达明显升高，而EGCG组对各炎症因子的表达均有抑制作用。以IL-1β为例，照射后各观测时间3组差异均存在统计学意义(F=82.35~236.32，P < 0.05)，从给药第2天起，EGCG组与生理盐水组比较，差异有统计学意义(t=2.25~7.13，P < 0.05)。
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注：给药后1~5 d，同一时间点3组间比较，FIL-1β=82.35~236.32，P < 0.05；FIL-6=23.66~236.04，P < 0.05；FTGF-β=97.11~149.61，P < 0.05；FTNF-α=68.24~127.98，P < 0.05；与生理盐水组比较，at=2.25、4.45、6.18、7.13，P < 0.05；bt=2.10、8.27、11.69、13.67，P < 0.05；ct=4.90、8.91、9.89、7.59，P < 0.05；dt=4.17、4.50、4.56、7.62，P < 0.05 图 2 各组动物血清炎症因子的表达随时间的变化A. IL-1β；B.IL-6；C.TGF-β；D.TNF-α Figure 2 Time responses of serum inflammatory factors in each group after irradiation A. IL-1β; B.IL-6; C.TGF-β; D.TNF-α |
4.食管组织67LR蛋白表达水平的比较：空白组、生理盐水组及EGCG组的食管组织67LR表达吸光度(A)值分别为178.40±20.58，7 072.90±870.34，1 551.30±308.11，3组间差异有统计学意义(F=468.48，P < 0.05)，EGCG组与生理盐水组差异有统计学意义(t=23.16，P < 0.05)。图 3示各组67LR蛋白的阳性表达情况。空白组食管组织67LR蛋白无明显表达，而生理盐水组高表达，EGCG组阳性表达介于两组之间。
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图 3 各组新西兰兔67LR蛋白的表达免疫组织化学染色×100 A.空白组；B.生理盐水组；C. EGCG组 Figure 3 Expression of 67LR protein in esophagus tissue of each group with immunohistochemistry assay ×100 A. blank group; B. saline group; C. EGCG group |
空白组、生理盐水组及EGCG组应用Western blot进行67LR表达量分析，结果分别为0.34±0.04、1.26±0.07、0.69±0.07，差异有统计学意义(F=585.38，P < 0.05)；两组间比较差异有统计学意义(t=13.17、33.94、20.77，P < 0.05，图 4)。
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注：1.空白组；2.生理盐水组；3.EGCG组 图 4 Western blot检测3组67LR蛋白表达水平 Figure 4 Western blot assay of the 67LR protein level in the three groups |
讨论
放射性食管炎的生物学机制十分复杂，包括炎症、凋亡、免疫等多项进程。辐射的生物效应主要引起细胞双螺旋结构复制紊乱，导致细胞信息传递障碍而丧失正常功能。主要病理变化是上皮细胞和血管损伤变化及炎症细胞浸润等，晚期可出现纤维化[5]。临床上表现为患者放疗后开始出现的吞咽困难、吞咽疼痛及胸骨下疼痛，是肺癌放疗时重要的剂量限制性因素之一[6]，但目前在国际上没有公认的防治放射性食管炎的有效药物。
EGCG具有抗炎、抗氧化、抗突变、抗病毒等多种功能[2, 7-8]。细胞实验发现EGCG可与细胞表面受体67 LR结合，诱导Toll样蛋白相互作用蛋白(TLLIP)表达，从而负性调节脂多糖诱导的Toll样受体(TLR)信号通路，该通路在固有免疫及受体相关激酶介导的炎症反应中发挥重要作用，通过抑制下游多种炎症及凋亡通路，进一步抑制前炎症因子释放，减轻放射导致的正常细胞损伤的发生及发展[9-10]。
本研究通过动物实验探讨了在急性放射性食管损伤中EGCG能否通过67LR的表达，减轻放射性食管炎的损伤程度，起到防护放射性食管炎的作用。结果显示，30 Gy X射线单次照射新西兰兔食管部位，导致食管组织放射性损伤明显，多种检测手段发现损伤部位食管壁67LR表达明显升高，而且伴随着血液中的炎症因子IL-1β、IL-6、TGF-β及TNF-α随着时间的延长明显增加。当给予EGCG治疗后，新西兰兔食管的炎症损伤明显减轻，而且67LR及各炎症因子表达也明显降低。这表明EGCG对新西兰兔放射性食管炎损伤有一定的治疗作用。其作用机制可能是通过与67LR的结合，负性调节放射性食管炎症通路，抑制炎症因子的产生，阻断放射导致的炎症级联反应。从炎症因子的变化来看，EGCG给药当天的检测结果表明，相对于生理盐水组，EGCG组炎症因子相对降低，且随着时间的延长，炎症因子差异性显著增加，这提示EGCG的起效迅速，且持续应用减轻炎症的功效愈加明显。在前期开展EGCG治疗放射性损伤的临床研究中，该结果也得到佐证[11-12]。目前的研究多关注EGCG抗氧化作用，其降低放疗产生的大量活性氧[13-15]，从而减轻细胞损伤，但具体机制尚不清楚。不同于以往研究，本研究从EGCG作用的靶点出发，初步发现了照射后新西兰兔正常食管组织损伤时也同样高表达67LR，而EGCG可能是其发挥抗放射性损伤的一个作用靶点。另外，发现了EGCG对TGF-β表达的抑制，此标志物是食管发生纤维化的预测因子，提示EGCG也可能被用于防治放射导致的食管纤维化，延缓病情发展，需进一步研究证实。另外，与既往研究不同的是，既往研究EGCG放射防护作用的给药方式往往是腹腔注射，但在临床应用时，此给药方法实施困难，本研究尝试了局部给药的方法，增加其临床应用的可行性。
综上所述，EGCG可以有效减轻食管病理放射性损伤，降低炎性因子水平，可能与EGCG与67LR作用有关。本研究旨在为临床应用EGCG防治放射性食管损伤提供理论基础，同时初步探索其治疗的机制。不足之处是缺乏EGCG对67LR下游通路的验证，对放射损伤的观测时间较短，对晚期损伤没有进行评估，这些将在下一步研究中进行。
利益冲突 所有研究者未接受其他机构提供的不当利益，在此对研究的独立性和科学性予以保证
作者贡献声明 朱婉琦分析数据撰写论文；贾丽负责论文修改；陈冠璇、李晓琳协助部分实验的完成；邢力刚协助部分实验的完成、论文修改；赵汉玺设计研究方案、开展实验；于金明设计研究方案，指导实验
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