中华放射医学与防护杂志  2026, Vol. 46 Issue (9): 818-825   PDF    
引用本文
唐杰, 王俊杰, 李春晓. 肠道菌群代谢物异丁酸/异戊酸对结直肠癌荷瘤小鼠X射线照射后CD8+ T细胞功能的影响[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2026, 46(9): 818-825, DOI: 10.3760/cma.j.cn112271-20260301-00072.
肠道菌群代谢物异丁酸/异戊酸对结直肠癌荷瘤小鼠X射线照射后CD8+ T细胞功能的影响
唐杰 , 王俊杰 , 李春晓     
北京大学第三医院肿瘤放疗科, 北京 100191
收稿日期: 2026-03-01
基金项目: 国家自然科学基金（82473246，82573446）；北京市自然科学基金（7232207）；北京大学第三医院重点项目（人才A类：BYSY2022044）
通信作者: 李春晓，Email: chunxiaoli@pku.edu.cn
[摘要] 目的 探讨肠道菌群代谢物异丁酸/异戊酸（IBA/IVA）对结直肠癌放疗后机体CD8+ T细胞功能及抗肿瘤效应的影响。方法 采用雌性C57BL/6N小鼠，共20只，构建MC38结直肠癌皮下荷瘤模型，根据随机数字表将小鼠随机分为对照组、IBA/IVA组、照射组及照射联合IBA/IVA组，每组5只。单次10 Gy X射线照射，照射后给予IBA/IVA混合物灌胃处理，1次/2 d，共计7次。灌胃总剂量为38.05 mg/kg，其中IBA 17.6 mg/kg，IVA 20.45 mg/kg。21 d后取脾脏和肿瘤引流淋巴结（dLNs），采用流式细胞术检测效应CD8+ T细胞（CD44hiCD62Llo）的比例、CD8+ T细胞中颗粒酶B（GZMB）、干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）以及T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3（TIM-3）的表达水平，并取肿瘤组织进行体积和质量评估。结果 与对照组相比，照射显09著提高了dLNs [（5.12±0.53）% vs.（6.68±0.48）%，q=10.76，P < 0.05]和脾脏[（3.56±0.53）% vs.（6.20±0.72）%，q=11.97，P < 0.05]中效应CD8+ T细胞的比例，但IBA/IVA处理显著抑制了dLNs [照射组vs.照射联合IBA/IVA组=（6.68±0.48）% vs.（4.22±0.25）%，q=16.96，P < 0.05]和脾脏[照射组vs.照射联合IBA/IVA组=（6.20±0.72）% vs.（4.46±0.35）%，q=7.89，P < 0.05]中效应CD8+ T细胞的比例。同时，照射组脾脏（q=14.00、14.86、4.24、7.36，P < 0.05）与dLNs（q=11.22、21.66、11.58、9.36，P < 0.05）中CD8+ T细胞的GZMB、IFN-γ及TNF-α表达较对照组显著升高，TIM-3表达水平降低。而照射联合IBA/IVA组脾脏（q=12.24、16.31、7.42、13.93，P < 0.05）与dLNs（q=11.47、21.96、13.71、23.78，P < 0.05）中，GZMB、IFN-γ及TNF-α表达水平均较照射组显著下降，TIM-3表达水平增高。相较于照射组，照射联合IBA/IVA组小鼠的肿瘤生长明显加速，第21天肿瘤体积[（185.08±34.90）mm3 vs.（813.15±112.85）mm3，q=7.33，P < 0.05]和质量[（0.20±0.04）g vs.（0.89±0.12）g，q=7.57，P < 0.05]显著增大。结论 IBA/IVA可抑制照射诱导的CD8+ T细胞活化及效应功能，减少效应CD8+ T细胞比例和GZMB、IFN-γ和TNF-α等抗肿瘤细胞因子的表达，上调TIM-3的表达，从而削弱照射的抗肿瘤效应并促进肿瘤进展，对调控放疗期间的肠道代谢环境具有潜在的临床意义。
[关键词] 异丁酸    异戊酸    肠道菌群    放射    T细胞    
The influence of gut microbiota metabolites isobutyric acid and isovaleric acid on the function of CD8+ T cells following X-ray irradiation in colorectal cancer-bearing mice
Tang Jie , Wang Junjie , Li Chunxiao     
Department of Radiotherapy Oncology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China
Fund programs: National Natural Science Foundation of China (82473246 and 82573446); Beijing Natural Science Foundation (7232207); Key Project of Peking University Third Hospital (Talent Category A: BYSY2022044)
Corresponding author: Li Chunxiao, Email: chunxiaoli@pku.edu.cn
[Abstract] Objective To investigate how the gut microbial metabolites isobutyric acid and isovaleric acid (IBA/IVA) influence CD8+ T cell function and the antitumor efficacy of irradiation (IR) in a murine colorectal cancer model. Methods A subcutaneous MC38 colorectal cancer model was established in 20 female C57BL/6N mice, which were randomly assigned using a random number table to four groups: Vehicle, IBA/IVA, IR, and IR combined with IBA/IVA (n=5 in each group). A single dose of 10 Gy radiation was administered to the tumors. Post-irradiation, mice were treated with an IBA/IVA mixture via oral gavage every other day for a total of 7 administrations. The total dosage was 38.05 mg/kg, comprising 17.6 mg/kg of IBA and 20.45 mg/kg of IVA. At 21d post-irradiation, spleens and draining lymph nodes (dLNs) were collected. Flow cytometry was used to quantify the proportion of effector CD8+ T cells (CD44hiCD62Llo), and the expression of granzyme B (GZMB), interferon-γ (IFN-γ), tumor necrosis factor-α (TNF-α), and T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3 (TIM-3) in CD8+ T cells. Tumor volume and weight were also evaluated. Comparisons between two groups were performed using the independent-samples t-test. Results Compared with the Vehicle group, IR markedly increased the proportion of effector CD8+ T cells in the dLNs [(5.12 ± 0.53)% vs. (6.68 ± 0.48)%, q=10.76, P < 0.05] and spleen [(3.56 ± 0.53)% vs. (6.20 ± 0.72)%, q=11.97, P < 0.05]; however, IBA/IVA treatment significantly inhibited the increase in dLNs [IR vs. IR + IBA/IVA = (6.68 ± 0.48)% vs. (4.22 ± 0.25)%, q=16.96, P < 0.05] and spleen [IR vs. IR + IBA/IVA = (6.20 ± 0.72)% vs. (4.46 ± 0.35)%, q=7.89, P < 0.05]. In the IR group, the expression of GZMB, IFN-γ, and TNF-α in CD8+ T cells from both spleens (q=14.00、14.86、4.24、7.36, P < 0.05) and dLNs (q=11.22, 21.66, 11.58, 9.36, P < 0.05)was significantly upregulated, while TIM-3 expression was downregulated compared with Vehicle group. Conversely, in the IR + IBA/IVA group, the expression levels of GZMB, IFN-γ, and TNF-α were significantly lower, whereas TIM-3 expression level was higher, compared with the IR group in both spleens (q=12.24, 16.31, 7.42, 13.93, P < 0.05) and dLNs (q=11.47, 21.96, 13.71, 23.78, P < 0.05). In addition, the IR + IBA/IVA group exhibited accelerated tumor growth compared with the IR group, with significantly greater tumor volume [(813.15 ± 112.85) mm3 vs. (185.08 ± 34.90) mm3, q=7.33, P < 0.05] and weight [(0.89 ± 0.12) g vs. (0.20 ± 0.04) g, q=7.57, P < 0.05] at 21d (P < 0.05). Conclusions IBA/IVA impair the IR-induced activation and effector function of CD8+ T cells, reducing the proportion of effector CD8+ T cells and the expression of anti-tumor cytokines (GZMB, IFN-γ, TNF-α), and promoting TIM-3 expression. These findings suggest that modulation of the intestinal metabolic environment during IR may help preserve radiotherapy-induced antitumor immunity.
[Key words] Isobutyric acid    Isovaleric acid    Gut microbiota    Radiotherapy    T cell    

放疗是超过50%癌症患者的主要治疗手段之一[1]，但放疗后肿瘤复发仍是目前亟待解决的难题[2]。肠道微生物群及其代谢物，尤其是短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)，在调控放射敏感性与免疫应答中起关键作用[3-4]。支链SCFAs约占总SCFAs的5%，异丁酸(isobutyric acid，IBA)和异戊酸(isovaleric acid，IVA)均为支链SCFAs，其在人体肠道中的浓度大致相同[5]。CD8+ T细胞通过分泌颗粒酶B(granzyme B，GZMB)、干扰素γ(interferon-γ，IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等分子介导抗肿瘤免疫，是评估免疫应答强度的核心标志物[6-7]。尽管直链SCFAs丁酸盐已被证实可增强CD8+ T细胞功能[8]，但IBA/IVA对CD8+ T细胞及放疗疗效的影响仍不清楚。本研究通过建立小鼠皮下荷瘤模型，在10 Gy X射线照射后补充IBA/IVA混合溶液，检测CD8+ T细胞内GZMB、IFN-γ、TNF-α及免疫检查点分子T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3)的表达变化，旨在揭示IBA/IVA在放射免疫调控中的作用。

材料与方法

1. 主要试剂与仪器：单克隆抗体(CD45-PECF594、CD4-FITC、CD8-APC、CD44-BV421、CD8-APC/Cy7、TNF-α-BV650、IFN-γ-PE、CD3-BV510、CD62L-BV650、GZMB-FITC、TIM-3-PE/Cy7)、Fix/Perm缓冲液购自美国Biolegend公司；RPMI 1640培养基、1%青霉素-链霉素购自美国Corning公司；离子霉素、佛波酯购自德国Sigma公司；CD4-PECy7(RM4-5)单抗、高尔基体阻断剂、流式细胞仪购自美国Beckton Dickinson公司；IBA购自上海吉至生化科技有限公司；IVA购自上海阿摩尔生物科技有限公司；胎牛血清购自美国Gemini公司；直线加速器Trilogy购自美国Varian公司。

2. 细胞培养：小鼠MC38结直肠癌(colorectal cancer, CRC)细胞系购自中国医学科学院基础医学细胞中心，在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中，37℃、5% CO2培养箱中培养。

3. 小鼠荷瘤模型构建：SPF级C57BL/6N小鼠，雌性，6~8周龄，体重18~22 g，购于北京大学医学部实验动物科学部，动物许可证号[SYXK(京)2021-0064]。饲养在(20 ± 5)℃、湿度(50 ± 10)%、昼夜明暗交替为12 h的标准动物饲养室内。接种肿瘤时，先用1%戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉小鼠，然后对右肩胛骨处皮肤备皮，将含1×106个MC38细胞/100 μl的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)皮下注射。隔天观察小鼠肿瘤生长情况。在荷瘤后第七天、肿瘤体积达到约100 mm3时建模成功。每两天使用游标卡尺测量肿瘤大小并计算体积，计算公式为：V=ab2×0.5，a为长度，b为宽度[9]。

4. 照射条件与给药方法：根据随机数字表将20只小鼠随机分为对照组、IBA/IVA组、照射组及照射联合IBA/IVA组，每组5只。照射组和照射联合IBA/IVA组小鼠麻醉后，左侧卧位固定于治疗板上。机架角270°，单野照射，射野大小为1.5 cm×1.5 cm，使射野下缘紧贴小鼠背部肿瘤。在小鼠肿瘤表面放置1.5 cm厚补偿器。源皮距(SSD)100 cm，6 MV X射线单次照射，剂量率为600 cGy/min。该剂量为诱导小鼠强效全身抗肿瘤免疫的最佳辐射剂量[10]。随后，照射联合IBA/IVA组与IBA/IVA组小鼠经口灌胃给予IBA与IVA的混合溶液。该混合溶液以PBS为溶剂配制，其中IBA和IVA浓度均为40 mmol/L，pH约为7.2。给药频率为1次/2 d，共计7次。灌胃总剂量为38.05 mg/kg，其中IBA 17.6 mg/kg、IVA 20.45 mg/kg，对照组小鼠以相同体积的PBS进行灌胃。

5. 流式细胞术检测

(1) 荷瘤第21天后小鼠安乐死，取脾脏和引流淋巴结(draining lymph nodes，dLNs)，将组织剪碎至1 mm3以下，使用胶原酶IV(0.5~1 mg/ml)+ DNase I(50~100 U/ml)消化液，37℃震荡消化20~30 min，经300 μm尼龙网过滤制备单细胞悬液。加入1 ml红细胞裂解液，裂解1~3 min。加入2 ml PBS终止裂解；300 × g离心5 min；使用含1% 牛血清蛋白的PBS重悬，以避免非特异性抗体结合。在避光条件下使用荧光抗体进行染色，并在流式细胞仪上进行分析。

(2) 表面标志物染色：单细胞悬液再次300 × g离心3 min后，加入流式抗体，表面抗体用量为0.2~0.5 μg每106个细胞，染色体系总量为50 μl，冰上孵育20 min。对于胞内的细胞因子染色，细胞密度1×106个/ml，加入离子霉素500~1 000 ng/ml、佛波酯10 ng/ml和高尔基体阻断剂，37℃刺激5 h，随后加入表面染色抗体溶液，使用抗体品牌匹配的Fix/Perm Buffer套装穿孔并固定，然后加入相应荧光抗体进行染色。

6.粪便代谢组及肠道菌群分析：数据来源于已发表研究[11-12]。其中，Yachida等[11]的研究提供了CRC患者及健康对照的粪便代谢组及宏基因组数据；Weir等[12]的研究提供了部分SCFAs在总SCFAs中的相对比例信息。相关数据均从原文补充材料中获取。

本研究对上述数据进行整理与再分析，包括提取与支链SCFAs(IBA，IVA)相关代谢物并比较CRC患者与健康对照之间的差异；分析不同分期CRC患者粪便中特征代谢物变化；整合菌群丰度数据并比较CRC患者与健康对照之间的差异。所有分析均基于原始研究提供的标准化数据进行，未涉及新的测序或动物/人体实验。

7.统计学处理：数据采用GraphPad Prism 10.0软件绘图，FlowJo 10.8软件分析流式数据。符合正态分布、方差齐的实验数据采用x ± s表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间采用单因素方差分析，而后选择LSD法进行组间的两两比较，涉及双因素变量数据采用双因素方差分析，事后检验采用Tukey多重比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

1. IBA/IVA及相关菌群在CRC患者粪便中显著升高：为探讨IBA/IVA在CRC患者中的临床相关性，对健康人群和CRC患者粪便代谢组数据进行了再分析，示于图 1。与健康人群相比，CRC患者粪便代谢谱发生了显著改变，并且在不同分期的CRC患者中存在差异(图 1A)。与健康人群相比，Ⅲ/Ⅳ期CRC患者粪便中IVA的浓度显著升高[(3 745.76±3 363.28)nmol/g vs.(5 662.15±4 767.62)nmol/g，F=3.89，P < 0.05，图 1B]。同时，SCFAs的结构比例也在CRC发展过程中发生改变。另一项分析了主要SCFAs占总SCFAs的相对比例，CRC组IBA[(1.9±0.15)% vs.(2.6±0.22)%，t=2.63，P < 0.05]、IVA[(4.7±0.38)% vs.(6.9±0.90)%，t=2.52，P < 0.05]及戊酸[(5.6±0.50)% vs.(8.6±0.60)%，t=3.84，P < 0.05]比例显著升高，而典型抗炎代谢物丁酸盐比例显著下降[(40.5±1.70)% vs.(30.8±1.60)%，t=4.16，P < 0.05，图 1C]。支链SCFAs(IVA)以及氨基酸代谢产物(如3-苯丙酸、3-氨基异丁酸)均在CRC患者粪便中增高(图 1A)，表明CRC患者肠道中蛋白质发酵过程增强。

注：a与健康人群相比，F=3.89，P < 0.05；b与健康人群相比，t=2.63、2.52、3.84、4.16，P < 0.05 图 1 健康人群和不同分期CRC患者粪便中代谢物与菌群差异  A.  代谢物差异热力图；B.  粪便中IVA绝对浓度变化；C.  SCFAs相对比例变化；D.  部分菌群差异热力图 Figure 1 Differences in fecal metabolites and microbiota between healthy individuals and CRC patients at different stages A. Heatmap of differential metabolites; B. Changes of the fecal IVA concentrations; C. Changes of the relative proportion of SCFAs; D. Heatmap of the differential abundance of gut microbiota

在菌群层面，基于宏基因组数据的分析，可观察到如具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum，包括subsp. animalis等亚种)等蛋白水解能力较强的菌群在CRC组中相对富集(图 1 D)。与此同时，丁酸产生菌，如普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)和直肠真杆菌(Eubacterium rectale)在CRC组中显著减少。

2. IBA/IVA减少了放疗后dLNs和脾脏中效应CD8+ T细胞的比例：照射组小鼠dLNs和脾脏中效应CD8+ T细胞比例均较对照组显著增加(q=10.76、11.97，P < 0.05，表 1)。然而，dLNs和脾脏中照射联合IBA/IVA组中效应T细胞的比例较照射组明显下降(q=16.96、7.89，P < 0.05，表 1)，提示IBA/IVA抑制了照射诱导的T细胞活化与分化。双因素方差分析显示，脾脏和dLNs中照射主效应(F=66.63、159.40，P < 0.05)、IBA/IVA主效应(F=206.40、73.07，P < 0.05)及dLNs中二者交互作用(F=6.72，P < 0.05)均有统计学意义，脾脏中交互作用不显著。

表 1 IBA/IVA对照射后小鼠脾脏和引流淋巴结中效应CD8+ T细胞比例的影响(x ± s) Table 1 Proportions of effector CD8+ T cells in the spleen and draining lymph nodes after irradiation with IBA/IVA (x ± s)

3. IBA/IVA抑制了放疗后脾脏中CD8+ T细胞的功能：与对照组相比，照射组小鼠脾脏内CD8+ T细胞GZMB、IFN-γ及TNF-α(q=14.00、14.86、4.24，P < 0.05，表 2)的表达显著上调，表明放疗具有免疫激活效应。然而，与照射组相比，照射联合IBA/IVA组中GZMB、IFN-γ及TNF-达显著降低(q=12.24、16.3、17.42，P < 0.05，表 2)。双因素方差分析显示，GZMB、IFN-γ和TNF-α的照射主效应(F=109.30、60.60、7.85，P < 0.05)、IBA/IVA主效应(F=75.54、85.16、35.81，P < 0.05)及二者交互作用(F=12.62、50.08、2.07，P < 0.05)均有统计学意义。

表 2 IBA/IVA对照射后小鼠脾脏中CD8+ T细胞功能的影响，GZMB、IFN-γ及TNF-α阳性细胞比例(x ± s) Table 2 Effects of IBA/IVA on CD8+ T-cell function in the spleen after irradiation: Proportions of GZMB-, IFN-γ-, and TNF-α-Positive Cells(x ± s)

4. IBA/IVA抑制了放疗后dLNs中CD8+ T细胞的功能：与对照组相比，照射组肿瘤dLNs内CD8+ T细胞的GZMB、IFN-γ及TNF-α表达均显著上升(q=11.22、21.66、11.58，P < 0.05，表 3)。但照射联合IBA/IVA组中GZMB、IFN-γ及TNF-α三种关键效应分子的表达水平均较照射组显著下降(q=11.47、21.96、13.71，P < 0.05，表 3)，呈现出与脾脏中相同的变化趋势。双因素方差分析显示，GZMB、IFN-γ和TNF-α的照射主效应(F=43.63、242.50、38.34，P < 0.05)，IBA/IVA主效应(F=46.96、251.80、69.18，P < 0.05)及二者交互作用(F=21.32、37.12、29.05，P < 0.05)均有统计学意义。

表 3 IBA/IVA对照射后小鼠引流淋巴结中CD8+ T细胞功能的影响，GZMB、IFN-γ及TNF-α阳性细胞比例(x ± s) Table 3 Effects of IBA/IVA on CD8+ T-cell function in draining lymph nodes after irradiation: proportions of GZMB-, IFN-γ-, and TNF-α-Positive Cells(x ± s)

5. 放疗后添加IBA/IVA促进了脾脏和dLNs中CD8+ T细胞TIM-3的表达：dLNs和脾脏中照射组TIM-3的表达水平较对照组明显下降(q=9.36、7.36，P < 0.05，表 4)，但dLNs和脾脏中照射联合IBA/IVA组TIM-3的表达水平较照射组出现显著上调(q=23.78、13.93，P < 0.05，表 4)。TIM-3表达的上调提示CD8+ T细胞可能处于耗竭或功能受限状态，这与前述抗肿瘤细胞因子表达下降的结果相一致。双因素方差分析显示，脾脏和dLNs中照射主效应(F=37.19、31.55，P < 0.05)、IBA/IVA主效应(F=420.90、148.50，P < 0.05)以及dLNs中二者交互作用(F=10.63，P < 0.05)均有统计学意义，脾脏中交互作用不显著。

表 4 IBA/IVA对照射后小鼠引流淋巴结中CD8+ T细胞功能的影响，TIM-3阳性细胞比例(x ± s) Table 4 Effects of IBA/IVA on CD8+ T-cell function in draining lymph nodes after irradiation: proportions of TIM-3-Positive cells(x ± s)

6. 放疗后添加IBA/IVA促进了肿瘤生长：与照射组相比，照射联合IBA/IVA组小鼠肿瘤生长速度明显加快，第21天时照射联合IBA/IVA组的肿瘤体积和质量均显著大于照射组(q=7.33、7.57，P < 0.05，表 5)，表明IBA/IVA部分抵消了照射的肿瘤控制效果。双因素方差分析显示，肿瘤体积和质量的照射主效应(F=94.29、94.55)、IBA/IVA主效应(F=206.2、157.90)及二者交互作用(F=9.05、7.42)均有统计学意义。

表 5 各组小鼠受照21 d后肿瘤体积和质量比较(x ± s) Table 5 Comparison of Tumor Volumes and Weight in Mice at 21 d Post-irradiation(x ± s)

讨论

放疗可通过多种机制重塑免疫系统。研究表明，中低剂量(如 < 12 Gy)的放疗能够增强CD8+ T细胞活性，促进CD8+ T细胞募集至肿瘤微环境中，并上调GZMB、IFN-γ及TNF-α等细胞因子的表达，从而促进局部抗肿瘤免疫反应[13-14]。本研究结果与上述观点一致，证实了放疗对CD8+ T细胞功能的正向调节作用。

肠道微生物组及其代谢物受疾病状态及饮食结构影响显著。与来源于膳食纤维发酵的丙酸盐、乙酸盐和丁酸盐等直链SCFAs不同，IBA、IVA等支链SCFAs主要来源于肠道内支链氨基酸的蛋白水解发酵。高脂、高蛋白饮食可导致小鼠粪便中支链SCFAs含量显著增加[15-16]。IBA与IVA结构高度相似，仅相差一个碳原子，二者来源与产生菌基本一致并具有相近的理化性质和组蛋白脱乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)抑制活性[17]，在高蛋白饮食人群中常同步升高、存在伴生关系[18-19]。但目前关于IBA/IVA体内干预剂量尚缺乏统一标准。本研究参考既往SCFAs及支链SCFAs动物研究[20]，并结合预实验安全性结果，采用IBA与IVA各40 mmol/l的混合溶液进行灌胃。在约5 ml/kg的灌胃体积下，折算后IBA和IVA的实际质量剂量分别约为17.6和20.45 mg/kg。该剂量设计旨在安全范围内模拟肠道支链SCFAs升高状态，而非作为药物治疗剂量。

目前学界关于SCFAs在肿瘤中的作用尚存争议。以丁酸盐为例，它既可通过激活GPR109a增强CD8+ T细胞对胃癌细胞的毒性，从而限制胃癌的发展[21]，也可通过抑制HDACs促进IL-10+ Treg细胞活性，从而增强免疫抑制[22]。相较于直链SCFAs，目前关于支链SCFAs的研究较少。仅个别研究提示，IBA可能通过结合ROCK1促进PD-L1表达，进而增强CRC的免疫逃逸[23]。本研究聚焦于照射背景下IBA/IVA对脾脏和dLNs中CD8+ T细胞功能的影响。效应T细胞(CD44hiCD62Llo)通过释放细胞毒性分子发挥抗肿瘤作用[24]，是抗肿瘤免疫的核心执行者，其在脾脏和dLNs中的高比例通常意味着较强的外周活化与增殖能力，是肿瘤浸润淋巴细胞的重要来源。而TIM-3升高通常提示CD8+ T细胞可能处于功能受限状态。外源性补充IBA/IVA显著降低了放疗后脾脏及dLNs中三种抗肿瘤细胞因子的表达水平，并升高了TIM-3的表达水平，提示IBA/IVA可能通过抑制外周CD8+ T细胞功能，部分抵消了放疗激发的抗肿瘤免疫效应。

本研究还存在一定局限性。首先，采用IBA与IVA 1∶1摩尔比混合给药，虽能模拟CRC患者肠道中支链SCFAs整体升高的代谢状态，但未设置单独给药组，因此尚无法明确二者各自对CD8+ T细胞功能的独立贡献，也无法判断二者之间是否存在协同或拮抗作用。未来仍需通过IBA单独组、IVA单独组及联合组的比较，进一步阐明两种代谢物的相对作用及相互关系。其次，本研究采用的皮下荷瘤模型虽能够减少肠道菌群等复杂变量的干扰，但原位癌模型在模拟肠道微环境中有着更为显著的优势，未来可以利用该模型进一步深入探讨IBA/IVA对局部肿瘤微环境的影响。此外，目前照射对支链SCFAs的影响尚未充分评估，后续可以开展相关临床研究，收集CRC患者照射前后粪便代谢组学及宏基因组数据，系统性地评估照射对IBA/IVA及相关菌群变化的影响。最后，本研究主要从体内免疫表型层面证明IBA/IVA可抑制放疗后CD8+ T细胞效应功能，但尚未进一步解析其直接分子机制。后续需通过体外T细胞功能实验、代谢通量分析及关键通路干预实验进一步验证。

综上所述，本研究表明肠道菌群代谢物IBA/IVA浓度的升高会抑制照射诱导的CD8+ T细胞活化及细胞因子产生，从而削弱放疗疗效并促进肿瘤生长。这一发现提示，肠道菌群代谢稳态可能是决定放疗敏感性的重要因素。抗生素的使用或照射本身均可能导致肠道菌群失调[25]，进而改变代谢物谱。饮食-肠道微生物群-宿主三角关系是一个具有前景的治疗方向[26]，放疗期间进行针对支链SCFAs的饮食管理(如限制高蛋白/高脂饮食以减少支链SCFAs的产生)或调节菌群(如益生菌干预)，可能成为提高放疗疗效的新策略。利用合成生物学构建靶向递送工程菌，或设计能特异性在肿瘤微环境中消耗支链SCFAs的前药，都是改善放疗疗效的远期可行方向。但未来仍需深入探究IBA/IVA影响T细胞功能的具体分子机制及关键信号通路，为临床转化提供理论依据。

利益冲突   无

作者贡献声明  唐杰负责实验设计及操作、数据分析和论文撰写；王俊杰指导论文修改；李春晓负责实验设计、指导论文撰写

参考文献
[1]
Piffko A, Yang K, Panda A, et al. Radiation-induced amphiregulin drives tumour metastasis[J]. Nature, 2025, 643(8072): 810-819. DOI:10.1038/s41586-025-08994-0
[2]
Mahvi DA, Liu R, Grinstaff MW, et al. Local cancer recurrence: The realities, challenges, and opportunities for new therapies[J]. CA Cancer J Clin, 2018, 68(6): 488-505. DOI:10.3322/caac.21498
[3]
Yang Q, Wang B, Zheng Q, et al. A review of gut microbiota-derived metabolites in tumor progression and cancer therapy[J]. Adv Sci (Weinh), 2023, 10(15): e2207366. DOI:10.1002/advs.202207366
[4]
Wong CC, Yu J. Gut microbiota in colorectal cancer development and therapy[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2023, 20(7): 429-452. DOI:10.1038/s41571-023-00766-x
[5]
Russell WR, Gratz SW, Duncan SH, et al. High-protein, Reduced-carbohydrate weight-loss diets promote metabolite profiles likely to be detrimental to colonic health[J]. Am J Clin Nutr, 2011, 93(5): 1062-72. DOI:10.3945/ajcn.110.002188
[6]
Hoekstra ME, Vijver SV, Schumacher TN. Modulation of the tumor micro-environment by CD8(+) T cell-derived cytokines[J]. Curr Opin Immunol, 2021, 69: 65-71. DOI:10.1016/j.coi.2021.03.016
[7]
Sun L, Su Y, Jiao A, et al. T cells in health and disease[J]. Signal Transduct Target Ther, 2023, 8(1): 235. DOI:10.1038/s41392-023-01471-y
[8]
Bachem A, Clarke M, Kong G, et al. Microbiota-derived butyrate promotes a foxo1-induced stemness program and preserves cd8(+) t cell immunity against melanoma[J]. Immunity, 2025, 58(11): 2799-2813 e8. DOI:10.1016/j.immuni.2025.10.004
[9]
Wang H, Franco F, Tsui YC, et al. CD36-mediated metabolic adaptation supports regulatory T cell survival and function in tumors[J]. Nat Immunol, 2020, 21(3): 298-308. DOI:10.1038/s41590-019-0589-5
[10]
Poleszczuk J, Enderling H. The optimal radiation dose to induce robust systemic anti-tumor immunity[J]. Int J Mol Sci, 2018, 19(11): 3377. DOI:10.3390/ijms19113377
[11]
Yachida S, Mizutani S, Shiroma H, et al. Metagenomic and metabolomic analyses reveal distinct stage-specific phenotypes of the gut microbiota in colorectal cancer[J]. Nat Med, 2019, 25(6): 968-976. DOI:10.1038/s41591-019-0458-7
[12]
Weir TL, Manter DK, Sheflin AM, et al. Stool microbiome and metabolome differences between colorectal cancer patients and healthy adults[J]. PLoS One, 2013, 8(8): e70803. DOI:10.1371/journal.pone.0070803
[13]
Meng Y, Mauceri HJ, Khodarev NN, et al. Ad.Egr-tnf and local ionizing radiation suppress metastases by interferon-beta-dependent activation of antigen-specific CD8+ T cells[J]. Mol Ther, 2010, 18(5): 912-920. DOI:10.1038/mt.2010.18
[14]
Lynch C, Pitroda SP, Weichselbaum RR. Radiotherapy, immunity, and immune checkpoint inhibitors[J]. Lancet Oncol, 2024, 25(8): e352-e362. DOI:10.1016/S1470-2045(24)00075-5
[15]
Choi BS, Daniel N, Houde VP, et al. Feeding diversified protein sources exacerbates hepatic insulin resistance via increased gut microbial branched-chain fatty acids and MTORC1 signaling in obese mice[J]. Nat Commun, 2021, 12(1): 3377. DOI:10.1038/s41467-021-23782-w
[16]
Diether NE, Willing BP. Microbial fermentation of dietary protein: An important factor in diet(-)microbe(-)host interaction[J]. Microorganisms, 2019, 7(1): 19. DOI:10.3390/microorganisms7010019
[17]
Zhu Z, Han Z, Halabelian L, et al. Identification of lysine isobutyrylation as a new histone modification mark[J]. Nucleic Acids Res, 2021, 49(1): 177-189. DOI:10.1093/nar/gkaa1176
[18]
Macfarlane GT, Macfarlane S. Bacteria, colonic fermentation, and gastrointestinal health[J]. J AOAC Int, 2012, 95(1): 50-60. DOI:10.5740/jaoacint.sge_macfarlane
[19]
Le Gall G, Guttula K, Kellingray L, et al. Metabolite quantification of faecal extracts from colorectal cancer patients and healthy controls[J]. Oncotarget, 2018, 9(70): 33278-89. DOI:10.18632/oncotarget.26022
[20]
Luu M, Pautz S, Kohl V, et al. The short-chain fatty acid pentanoate suppresses autoimmunity by modulating the metabolic-epigenetic crosstalk in lymphocytes[J]. Nat Commun, 2019, 10(1): 760. DOI:10.1038/s41467-019-08711-2
[21]
Yu X, Ou J, Wang L, et al. Gut microbiota modulate cd8(+) t cell immunity in gastric cancer through butyrate/gpr109a/hopx[J]. Gut Microbes, 2024, 16(1): 2307542. DOI:10.1080/19490976.2024.2307542
[22]
Mann ER, Lam YK, Uhlig HH. Short-chain fatty acids: Linking diet, the microbiome and immunity[J]. Nat Rev Immunol, 2024, 24(8): 577-595. DOI:10.1038/s41577-024-01014-8
[23]
Lin Q, Wang H, Chen W, et al. Isobutyric acid promotes immune evasion in colorectal cancer via increased pd-l1 expression[J]. Cancer Med, 2024, 13(21): e70397. DOI:10.1002/cam4.70397
[24]
Wang R, Liu Z, Fan Z, et al. Lipid metabolism reprogramming of cd8(+) t cell and therapeutic implications in cancer[J]. Cancer Lett, 2023, 567: 216267. DOI:10.1016/j.canlet.2023.216267
[25]
Haak BW, Lankelma JM, Hugenholtz F, et al. Long-term impact of oral vancomycin, ciprofloxacin and metronidazole on the gut microbiota in healthy humans[J]. J Antimicrob Chemother, 2019, 74(3): 782-786. DOI:10.1093/jac/dky471
[26]
Moraitis I, Guiu J, Rubert J. Gut microbiota controlling radiation-induced enteritis and intestinal regeneration[J]. Trends Endocrinol Metab, 2023, 34(8): 489-501. DOI:10.1016/j.tem.2023.05.006