2026, Vol. 46
核质桥(nucleoplasmic bridge, NPB)是双核细胞中连接两个主核的异常结构，由DNA错误修复、染色体重排或端粒融合等机制形成[1-3]。研究表明，核质桥在放射工作人员和氡暴露人群中的发生率显著高于健康人群[4-5]，且在0~8 Gy范围内呈现良好的剂量-效应关系，因此被视为估算辐射生物剂量的有效指标[5-6]。核质桥其自发率低(约0.56 × 10-3)[6]，本底干扰小，在核事故患者的生物剂量评估中已得到实际应用，如南京“5.7”辐射事故中通过NPB+融合-马蹄-环形畸变(FHC)分析成功对患者进行了剂量估算[7]。此外，刘青杰团队针对不同放射源建立了基于核质桥的剂量-效应曲线[8]，进一步拓展了其应用范围。
近年来，人工智能技术推动了染色体畸变和微核的自动化分析发展[9-10]。Sun等[11]已通过自动化方法评估微核、染色体等指标以反映DNA损伤，但核质桥作为关键生物剂量计的剂量-效应研究，仍处于全人工检测阶段。利用自动化分析构建核质桥剂量-效应曲线鲜有报道，这无疑是实现辐射生物剂量大规模、快速精准评估亟待突破的关键环节。因此，本研究旨在评估在双核细胞中实现核质桥自动化扫描与分析的可行性，并据此构建基于核质桥发生率的剂量-效应关系曲线，为大规模意外受照人群的生物剂量估算提供技术支撑。
材料与方法1. 主要仪器和试剂：染色体扫描分析系统(Metafer，德国MetaSystems Hard & Software GmbH公司)；X射线辐照仪(XCELL225，美国KUBTEC公司)；人外周血细胞培养基(杭州德适生物科技有限公司)；细胞松弛素B(上海麦克林生化科技股份有限公司)。
2. 对象与血样采集：①半自动化分析核质桥方法验证。招募志愿者34人(20男14女，年龄22~60岁)。纳入标准：适龄人群，无烟酒嗜好，半年内无有毒有害化学物质接触史、无射线接触史、无急慢性疾病史，近1个月无病毒感染史。无菌条件下肝素钠抗凝管采集志愿者肘静脉血2 ml。②拟合剂量-效应曲线。招募4名成年健康志愿者(2男2女，年龄25~35岁)，纳入标准：非放射工作人员，无烟酒嗜好，半年内无有毒有害化学物质接触史、无射线接触史、无急慢性疾病史，近1个月无病毒感染史。肝素钠抗凝管采集志愿者肘静脉血，每人8管，每管3 ml。③验证曲线。招募2名成年健康志愿者(1男1女，年龄25~35岁)，肝素钠抗凝管采集志愿者肘静脉血，每人1管，每管3 ml。
本研究经重庆市疾病预防控制中心伦理委员会审核批准(批准号：KY-2023-004-1)，招募者均签署知情同意书。
3. 离体照射条件：①对核质桥分析方法验证样本。使用X射线辐照仪离体照射，X射线管靶角40°，源靶距61.9 cm，通过调节限束器使得辐照区域为边长为20 cm的正方形区域内，X射线管电压224.8 keV，采用辐照配套剂量监测仪控制设定4.0 Gy，剂量率1.00 Gy/min，实际照射时间为3 min 1 s，实际接受剂量4.007 Gy。②剂量-效应曲线的抗凝血样。委托中国计量院采用60Co γ射线辐照仪(源活度为1.85×1014 Bq)照射，照射剂量分别为0、0.25、0.5、1、2、3、4和5 Gy，剂量率为0.85 Gy/min。③验证剂量-效应曲线血样。委托中国计量院 60Co γ射线照射，2份离体血样分别受照剂量为1.80、3.80 Gy，剂量率为0.85 Gy/min。照射后将样本放于37℃恒温培养箱中静置2 h修复。
4. 胞质分裂阻滞微核实验(CBMN)标本制备：依照GBZ/T 328—2023放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞细胞微核检测方法与受照剂量估算标准[12]第4章进行微量全血培养。按照细胞收获仪、制片染色一体机操作指南收获双核细胞悬液。
5. 核质桥分析：本研究扫描分析软件模块自动完成10倍镜下每个视野的扫描，每视野双核淋巴细胞图片使用VGG-16网络训练法建立卷积神经网络(CNN)模型训练识别核质桥[13]，包括去掉裸核、单核、多核、异形核和杂质等，筛选出包浆完整的双核细胞，并识别出双核中的核质桥。将这些检测后的图像数据进行分类输出展示，包括正常双核细胞、含核质桥的双核细胞和杂质等。自动检测完成后，进行人工核质桥的复核(半自动化分析)，即人工复核双核间是否有桥状核质连接，且核质桥的宽度应窄于其主核直径的1/4，染色特性与主核一致，有时在双核之间可观察到不止一个核质桥。检测结果以自动检测和人工复核的每细胞核质桥数表示。
6. 曲线拟合与统计学处理：采用Microsoft Excel 2020软件进行统计分析。数据经正态性检验符合正态分布，以 x±s表示，组间比较采用独立样本t检验；偏态资料以M(Q1，Q3)描述，组间比较采用Mann-Whitney U秩和检验。P < 0.05为差异有统计学意义。对于60Co γ射线诱导的核质桥与受照射剂量之间的剂量-效应关系符合二次多项式。将不同剂量点和对应分析得到的每细胞核质桥数代入公式(1)中的D和y值，Excel软件根据该二次多项式推算出a、b、c 3个值，拟合成剂量-效应曲线。
| $ y=a D^2+b D+c $ | (1) |
式中，y为每细胞核质桥数，×10-3；a、b为回归系数；c为每细胞核质桥本底数，×10-3；D为吸收剂量，Gy。
结果1.半自动化与人工分析比较
(1) 半自动化分析核质桥方法验证：经人工复核分析后，软件分析双核淋巴细胞和核质桥检测情况见表 1，具有代表性的真阳性和假阳性核质桥实例分别详见图 1。这些结果说明软件可以较好地识别双核淋巴细胞，但是软件自动分类的核质桥假阳性较高，为保证分析准确性，目前该软件核质桥分类任需要人工复核。
|
表 1 软件分析双核淋巴细胞和核质桥检测情况(%) Table 1 Software analysis of binuclear lymphocytes and nucleoplasmic bridges (%) |
|
注：A表示一个核质桥；B表示核质桥宽的直径小于主核1/4计算为一个核质桥；C表示两个核质桥；D、E、F分别为大小核、裸核、相邻核都不统计为核质桥，为假阳性 图 1 真阳性核质桥(A-C)和假阳性核质桥(D-E) Figure 1 True (A-C) and false (D-F) positive detection results of nucleoplasmic bridges |
(2) 基于软件分析识别双核细胞和核质桥相关技术参数：对34例样本分别进行半自动化和人工分析，每例分析2 000个双核淋巴细胞，半自动和人工分析每样本平均用时分别为0.45(0.40，0.52) h和2.00(1.10，3.90) h(每天工作6 h)，差异有统计学意义(P＜0.001)。检出的人工分析组每细胞核质桥数为(13.9±1.83)×10-3，半自动化分析组每细胞核质桥数为(15.8±2.02)×10-3，两组差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.半自动检测的每细胞核质桥数及剂量-效应曲线的拟合：随着剂量的增高，可分析的双核细胞也逐渐减少；但随着剂量增加，每细胞核质桥数逐渐增加，且一个细胞内出现两个核质桥的概率也随着剂量增加而增加，但未见到一个细胞内出现3个及以上桥的情况(表 2)。
|
|
表 2 细胞松弛素B阻断法核质桥分析结果 Table 2 Nucleoplasmic bridge analysis using the cytokinesis-block method with cytochalasin B |
在0~5 Gy剂量范围内，对γ射线诱导的核质桥与受照剂量之间呈二次多项式关系。当照射剂量≥1 Gy时，每细胞核质桥数的标准误较照射剂量＜1 Gy时明显增高。拟合每细胞核质桥数与照射剂量间的剂量-效应的二次项回归方程为y=0.391 7×10-3D2+3.225 8×10-3D+0.175 8×10-3(R2=0.999)，见图 2。
|
图 2 0 ~ 5 Gy剂量范围内60Co γ射线照射核质桥率与剂量间的剂量-效应关系 Figure 2 Dose-response curve of nucleoplasmic bridge rate and 60Co γ-ray irradiation dose within the dose range of 0-5 Gy |
3.剂量-效应曲线验证：每样本分析10 000个双核细胞，软件辅助人工复核检测出核质桥81和165个，估算两样本生物剂量分别为1.98和3.42 Gy，95%CI分别为1.56~2.34和3.11~3.95，见表 3。估算剂量与实际照射剂量进行比较，相对偏差均≤10%，说明该拟合曲线可以较准确估算辐射受照剂量。
|
|
表 3 核质桥半自动化分析剂量-效应曲线的验证 Table 3 Validation of dose-response curve for semi-automated analysis of nucleoplasmic bridges |
讨论
本研究对半自动分析核质桥的检测效果进行了系统评估。在时间效率方面，半自动化分析可大幅提升核质桥检测效率，将分析时间缩短至人工分析方法的9.3%。在检测质量方面，半自动化分析检测准确性与传统人工分析方法相当，均能可靠地反映样本中核质桥的真实水平。本研究结果具有重要的实践意义：该方法在保证检测质量的前提下，可有效减轻技术人员的工作负担，有利于大规模样本的筛查和分析。“双着丝粒体+着丝粒环”是国际原子能机构(IAEA)认可的生物剂量估算“金标准”[14-15]，多项实验证实，核质桥频率与其形成相似，和辐射剂量也呈线性关系，可用于生物剂量估算[16-18]。然而，在方法验证中自动化分析仍存在局限性：假阳性率43.3%较高；当照射≥1 Gy时，标准误增加40%~50%。因此，当前研究重点集中于优化“人工复核-自动化识别”联合流程及剂量-效应曲线建模。
随着近年来人工智能在图像处理的快速发展，通过自动化分析来估算生物剂量已经是近年来的发展趋势。国际标准化组织(ISO)均已将染色体畸变、微核等生物剂量估算方法相关自动化分析逐步纳入到标准条款中[19-20]，虽仍没有详细的条款，但一些研究中强调了自动化分析中重复性、特异性、灵敏度等指标作为质量控制参数。在利用自动化分析核质桥估算生物剂量方面尚没有国内与国际的自动化相关标准或条款。目前，自动化分析核质桥仅用于评估照射后细胞的DNA损伤[11]。本研究基于核质桥已有剂量计特点和软件辅助人工分析，建立了半自动检测核质桥方法及剂量-效应曲线。剂量曲线建立中，随着辐射剂量增加，培养体系中双核细胞数量呈现剂量依赖性减少，这与既往研究报道的辐射抑制细胞增殖效应一致[18]。值得注意的是，虽然可分析细胞数量减少，但核质桥发生率却呈剂量依赖性增加。特别地，在较高剂量组(≥1 Gy)观察到单个细胞内出现两个核质桥的概率显著增加，但未发现3个及以上核质桥的情况，这可能提示核质桥形成存在细胞生物学上限。同时，核质桥本底水平很低，自发率0.56×10-3，非常接近“双着丝粒体+着丝粒环”的人群本底数据0.58×10-3[8]；但随剂量增加核质桥异常率却不如染色体畸变与微核异常率增长快，因此，核质桥在低剂量组中(＜1 Gy)敏感性可能低于染色体和微核。最后，当照射剂量≥1 Gy时，每细胞核质桥数的标准误显著增大，这可能反映高剂量照射下细胞应答异质性增加，辐射诱导的复杂染色体损伤模式，高剂量组可分析细胞数减少可能放大统计波动。因此，为控制不确定度，本二次多项式模型更适合剂量范围内的剂量-效应关系，不易外推。同时值得注意的是，本研究中4 Gy X射线和γ射线照射人外周血后，每细胞核质桥数存在显著差异(γ射线：19.65 ± 3.17，X射线：13.90 ± 1.83)。这一现象可能源于以下实验因素：①射线特性的差异影响。正如国际放射防护委员会(ICRP)建议所述，建立剂量-效应曲线时需对不同射线种类分别建模。本实验采用的X射线存在不可避免的X射线管角度依赖性，34管血样照射时X射线管角度存在微小差异，可能导致样本受照剂量分布不均，降低有效生物剂量，从而使核质桥形成率低于γ射线。②与γ射线实验的对比。γ射线诱导的双链断裂更复杂难修复，易通过易错非同源性末端结合形成错误染色体末端融合，导致更多核质桥。X射线的损伤较易被同源重组修复，减少核质桥形成[21]。
本研究通过半自动分析方法，统计两个验证样本中分别检测到的核质桥数，且估算结果满足国际原子能机构(IAEA)关于生物剂量估算准确性的要求(通常要求相对偏差 < 30%)，表明本研究建立的剂量-效应曲线具有较好的临床应用可靠性。未来研究可进一步扩大样本量，验证该曲线在不同辐射类型和照射条件下的适用性。
本研究半自动化核质桥分析技术相较于传统染色体畸变和微核自动分析方法展现出技术优势和创新性。首先，该技术采用深度学习算法实现高通量智能识别，检测通量远超人工检测效率，且重复性优。其次，通过高分辨率成像技术，可精准区分真实核质桥，解决了传统二维染色体分析和黑白微核分析的局限性。该半自动化技术为核质桥成为放射生物学和毒理学研究的新一代标准化工具创造可行性。
综上所述，本研究自动扫描和辅助人工检测核质桥技术的运用，使得半自动检测核质桥有望作为一种新型辐射生物剂量估算技术可以更快普及和推广。
利益冲突 无
作者贡献声明 吴梦云负责实施研究、论文撰写；李炜负责指导实验；张华东负责论文修改；袁方负责材料支持；谭秀洪负责实验技术
| [1] |
Çayır A, Coskun M, Coskun M. Micronuclei, nucleoplasmic bridges, and nuclear buds induced in human lymphocytes by the fungicide signum and its active ingredients(boscalid and pyraclostrobin)[J]. Environ Toxicol, 2014, 29(7): 723-732. DOI:10.1002/tox.21789 |
| [2] |
Caradonna F. Nucleoplasmic bridges and acrocentric chromosome associations as early markers of exposure to low levels of ionising radiation in occupationally exposed hospital workers[J]. Mutagenesis, 2015, 30(2): 269-275. DOI:10.1093/mutage/geu068 |
| [3] |
Thomas P, Umegaki K, Fenech M. Nucleoplasmic bridges are a sensitive measure of chromosome rearrangement in the cytokinesis-block micronucleus assay[J]. Mutagenesis, 2003, 18(2): 187-194. DOI:10.1093/mutage/18.2.187 |
| [4] |
田雪蕾, 陆雪, 封江彬, 等. 放射工作人员外周血淋巴细胞核质桥水平及其影响因素分析[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2020, 40(2): 94-98. Tian XL, Lu X, Feng JB, et al. Analysis of nuclear cytoplasmic bridge levels in peripheral blood lymphocytes of radiation workers and their influencing factors[J]. Chin J Radiol Med Prot, 2020, 40(2): 94-98. DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2020.02.004 |
| [5] |
Meenakshi C, Sivasubramanlan K, Venkatraman B. Nucleoplasmic bridges as a biomarker of DNA damage exposed to radon[J]. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen, 2017, 57(16): 81422-81428. DOI:10.1016/j.mrgentox.2016.12.004 |
| [6] |
赵骅, 陆雪, 陈德清, 等. 60Co γ射线诱导人外周血淋巴细胞核质桥的剂量-效应关系研究[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2014, 34(4): 259-262. Zhao H, Lu X, Chen DQ, et al. Study on the dose-response relationship of 60Co gamma ray induced nuclear cytoplasmic bridging in human peripheral blood lymphocytes[J]. Chin J Radiol Med Prot, 2014, 34(4): 259-262. DOI:10.3760/cma/j.issn.0254-5098.2014.04.005 |
| [7] |
戴宏, 刘玉龙, 王优优, 等. 南京"5.7"192Ir源放射事故患者的生物剂量估算[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2016, 36(5): 350-354. Dai H, Liu YL, Wang YY, et al. Biological dose estimation of patients in the"5.7" 192 Ir source radiation accident in Nanjing[J]. Chin J Radiol Med Prot, 2016, 36(5): 350-354. DOI:10.3760/cmA.j.issn.0254-5098.2016.05.008 |
| [8] |
Cai TJ, Li S, Lu X, et al. Dose-effect relationships of 12C6+ ions-induced dicentric plus ring chromosomes, micronucleus and nucleoplasmic bridges in human lymphocytes in vitro[J]. Int J Radiat Biol, 2021, 97(5): 657-663. DOI:10.1080/09553002.2021.1900945 |
| [9] |
韩林, 陆雪, 李杰, 等. 双着丝粒体半自动与人工分析估算生物剂量的比较研究[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2020, 40(11): 826-831. Han L, Lu X, Li J, et al. Comparative study on semi-automatic and manual analysis of dual centromere for estimating biological dose[J]. Chin J Radiol Med Prot, 2020, 40(11): 826-831. DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2020.11.003 |
| [10] |
吴梦云, 李炜, 张华东, 等. 人工智能识别60Co γ射线照射诱导人外周血微核的剂量-效应曲线建立[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2024, 44(1): 7-12. Wu MY, Li W, Zhang HD, et al. Establishment of dose-response curve for artificial intelligence recognition of 60Co gamma ray irradiation induced micronuclei in human peripheral blood[J]. Chin J Radiol Med Prot, 2024, 44(1): 7-12. DOI:10.3760/cma.j.cn112271-20230522-00156 |
| [11] |
Sun C, Vallotton P, Fenech M, et al. Automated detection of nucleoplasmic bridges for DNA damage scoring in binucleated cells[C]. 20th International Conference on Pattern Recognition, Piscatuay: IEEE, 2010.
|
| [12] |
国家卫生健康委员会. GBZ/T 328—2023放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞细胞微核检测方法与受照剂量估算标准[S]. 北京: 中国标准出版社, 2023. National Health Commission of thePeople's Republic of China. GBZ/T 328-2023 Standard for the method of micronucleus detection in lymphocytes on occupational health examination for radiation workers and exposure dose estimation[S]. Beijing: Standards Press of China, 2023. |
| [13] |
Simonyan K, Zisserman A. Very deep convolutional networks for large-scale image recognition[J]. Comp Sci, 2015, 4(10): 14. DOI:10.48550/arXiv.1409.1556 |
| [14] |
Vinnikov VA, Belyakov O. Radiation exposure biomarkers in the practice of medical radiology: Cooperative research and the role of the International Atomic Energy Agency (IAEA) Biodosimetry/Radiobiology Laboratory[J]. Health Phys, 2020, 119(1): 83-94. DOI:10.1097/HP.0000000000001266 |
| [15] |
McKenna MJ, Robinson E, Taylor L, et al. Chromosome translocations, inversions and telomere length for retrospective biodosimetry on exposed US[J]. Atomic Veterans Radiat Res, 2019, 191(4): 311-322. DOI:10.1667/RR15240.1 |
| [16] |
Ray FA, Robinson E, McKenna M, et al. Directional genomic hybridization: inversions as a potential biodosimeter for retrospective radiation exposure[J]. Radiat Environ Biophys, 2014, 53(2): 255-263. DOI:10.1007/s00411-014-0513-1 |
| [17] |
Hada M, Zhang Y, Feiveson A, et al. Association of inter- and intrachromosomal exchanges with the distribution of low and high LET radiation-induced breaks in chromosomes[J]. Radiat Res, 2011, 176(1): 25-37. DOI:10.1667/RR2433.1 |
| [18] |
Jamebozorgi I, Mahjoubi F, Pouryaghoub G, et al. Micronucleus, nucleoplasmic bridge, and nuclear budding in peripheral blood cells of workers exposed to low level benzene[J]. Int J Occup Environ Med, 2016, 7(4): 227. DOI:10.15171/ijoem.2016.785 |
| [19] |
International Organization for Standardization. ISO 17099-2024 Performance criteria for laboratories using the cytokinesis-block micronucleus (CBMN)assay in peripheral blood lymphocytes for biological dosimetry[S]. Geneva: ISO, 2024.
|
| [20] |
International Organization for Standardization. ISO 19238-2023 Performance criteria for service laboratories performing biological dosimetry by cytogenetics-Dicentric assay[S]. Geneva: ISO, 2023.
|
| [21] |
Neumaier T, Swenson J, Pham C, et al. Evidence for formation of DNA repair centers and dose-response nonlinearity in human cells[J]. Proceed Nat Academ Sci USA, 2012, 109(2): 443-448. DOI:10.1073/pnas.1117849108 |