2026, Vol. 46
2. 四川省肿瘤医院·研究所 肿瘤精准放疗四川省重点实验室 肿瘤临床医学研究中心 四川省癌症防治中心 电子科技大学附属肿瘤医院放疗中心, 成都 610041;
3. 中国工程物理研究院应用电子学研究所, 绵阳 621900;
4. 先进激光与高功率微波全国重点实验室, 绵阳 621900
2. Department of Radiation Oncology, Sichuan Clinical Research Center for Cancer, Sichuan Cancer Hospital and Institute, Affiliated Cancer Hospital of University of Electronic Science and Technology of China, Chengdu 610041, China;
3. Institute of Applied Electronics, CAEP, Mianyang 621900, China;
4. National Key Laboratory on Advanced Laser and High Power Microwave, Mianyang 621900, China
超高剂量率放疗(ultra-high dose rate radiotherapy，FLASH-RT)是指射线照射剂量率≥40 Gy/s的放疗技术，其展示出独特的FLASH效应，即在保持有效肿瘤杀伤的同时，显著降低了正常组织的辐射损伤[1]。目前，FLASH-RT的临床前和临床试验正在全球多个中心展开[2]，已成为当前肿瘤放疗领域的研究热点。
空间分割放疗(spatially fractionated radiation therapy, SFRT) 是一种新型非均匀剂量分布的放疗技术，其核心在于将靶区剂量分割为高(峰)低(谷)不平的剂量分布, 相较于均匀剂量照射，SFRT不仅能在递送更高剂量的同时减少对正常组织的伤害, 还能通过旁观者效应、免疫激活等生物学机制增强抗肿瘤效果[3-4]。
上述两种技术各具优势，联合应用能否产生协同效应是当前亟待探究的问题，目前相关报道十分缺乏。本研究自制了一种可实现小束放疗(minibeam radiation therapy, MBRT)的挡铅板，借助国产小型FLASH电子线直线加速器，成功实现了FLASH-RT联合SFRT (MBRT)照射，通过构建小鼠荷瘤模型，初步评估了FLASH-SFRT的抗瘤效果及安全性。
材料与方法1.实验动物：雌性无特定病原级BALB/c小鼠及雄性C57小鼠，6~7周龄，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2024-0003。在实验动物中心分笼饲养，每笼5只，温度为20~24℃，相对湿度为(55±5)%，12 h光暗循环。实验开始前小鼠适应性饲养7 d，给予自然光线，实验期间始终自由饮水进食。该研究经过四川省肿瘤医院实验动物福利伦理委员会批准(编号：SCCHEC-04-2025-003)。
2. 细胞培养：小鼠乳腺癌细胞株4T1-luc细胞购于成都百迪生物科技有限公司，细胞培养条件为DMEM(高糖)培养基+ 10%胎牛血清+ 1%双抗(成都百迪生物科技有限公司)，在37℃，5% CO2无菌孵箱中培养。当乳腺癌4T1细胞铺满培养瓶底部约80%时进行传代，使用1 ml 0.25%胰酶消化1 min后，使用2 ml完全DMEM培养基终止消化。300×g离心5 min，收集细胞沉淀，2 ml完全DMEM培养基重悬，分装至两个新培养瓶中，每瓶补加4 ml完全DMEM培养基。
3. 移植瘤模型的构建：使用无血清培养基将4T1细胞制成单细胞悬液, 调整细胞浓度至1×107 /ml。每只小鼠接种0.1 ml于大腿根部。隔天观察并用游标卡尺测定肿瘤大小，根据公式：体积=(长径×短径2)/2，计算肿瘤体积。待肿瘤长至300~400 mm3大小后按随机数表法将小鼠分为4组，每组6只。其中对照组不照射，CONV-RT组(5 Gy，0.5 Gy/s)、SFRT组[15 Gy(峰)，2 Gy(谷)，0.5 Gy/s]和FLASH-SFRT组[15 Gy(峰)，2 Gy(谷)，200 Gy/s]进行单次照射。
4. 照射方式及剂量监测：所有实验均采用绵阳中玖闪光医疗科技有限公司的FLASH电子线直线加速器垂直照射，能量9 MeV，射野均为12 mm × 20 mm，源皮距(SSD)51 cm，于靶深度体积2 mm处标定剂量。各照射组除剂量及剂量率不同之外，其余物理参数均相同。SFRT所用的挡铅板中的钻孔排列形成5 × 5方形矩阵，孔径为1 mm，中心孔间距为2 mm。照射前，小鼠腹腔注射三溴乙醇(25 μl/g)麻醉，固定并精准调整射野至小鼠大腿区域。使用EBT4胶片(美国Ashland公司)测量照射区域的辐射剂量，胶片读出使用Epson Expression 1200XL扫描系统(日本Seiko Epson公司)，采用Epson SCAN2及MatLab R2024b软件对胶片进行处理和量化分析，并根据SFRT组9 × 9 mm方阵的净光密度值(测得的光学密度值减去胶片本底值)计算其平均剂量[5]。见图 1。
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注：SSD.源皮距；PTW RW3.水等效固体模体材料 图 1 CONV-RT(A)及SFRT与FLASH-SFRT(B)的剂量标定、动物照射示意图 Figure 1 Dose calibration and animal irradiation schematic of CONV-RT (A), SFRT and FLASH-SFRT (B) |
5. 组织病理学检测：股骨及皮肤取下后使用4%多聚甲醛固定24 h。股骨使用EDTA脱钙液处理3~4周。股骨和皮肤组织进行石蜡包埋切片后，分别使用苏木精-伊红溶液(HE)和Masson法进行染色。使用数字化全景扫描仪(瑞士Roche公司，VENTANA DP 200系统)进行扫描，采用ImageViewer软件观察切片并保存。ImageJ-win64软件用于半定量皮肤的胶原纤维容积分数，胶原纤维容积分数(%)=胶原纤维面积/组织总面积× 100%。
6. 统计学处理：使用GraphPad Prism 9.5软件对数据进行统计分析并绘图。Kolmogorov-Smirnov检验数据正态性，Levene检验数据方差齐性。符合正态分布的变量以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，进一步两两比较采用LSD法。使用Log-rank法比较小鼠生存期组间差异。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1. FLASH-SFRT模型的物理学及剂量学参数：挡铅板厚1 cm，孔径1 mm，中心间距为2 mm。在12 mm × 20 mm射野下，CONV-RT在2 mm深度测得稳定的5 Gy剂量(图 2A)。在10.2、17.0和29.0 mm处分别达到CONV-RT最大剂量的100%、90%、50%(图 2B)。此外，在2、4、6 mm深度时，CONV-RT并未出现明显的剂量衰减(图 2C, D)。在MBRT挡铅板下，使点阵区域(9 × 9 mm)的平均剂量为5 Gy，与CONV-RT的剂量保持一致。此时，其形成的峰剂量约为15 Gy，谷剂量约为2 Gy，峰谷比约为7.5(图 2E)。由于挡铅板的遮挡，在1.8、8.6、19.8 mm处分别达到SFRT及FLASH-SFRT最大剂量的100%、90%、50%(图 2F)。此外，在2、4、6 mm深度时，SFRT及FLASH-SFRT出现了一定的剂量衰减，平均剂量分别为5、4.8、4.6 Gy(图 2G, H)。
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图 2 不同深度下FLASH-SFRT模型及CONV-RT的剂量学及物理学参数A. 2 mm深度处CONV-RT的剂量热图；B. CONV-RT的百分深度剂量；C、D. 2、4、6 mm深度时CONV-RT在中心水平、垂直剖面上的剂量分布；E. 2 mm深度处SFRT及FLASH-SFRT的剂量热图；F. SFRT及FLASH-SFRT的百分深度剂量；G、H. 2、4、6 mm深度时SFRT及FLASH-SFRT在中心水平、垂直剖面上的剂量分布 Figure 2 Dosimetric and physics parameters of FLASH-SFRT and CONV-RT at different depths. A. Dose heatmap of CONV-RT at a 2 mm depth; B. PDD of CONV-RT; C, D. Dose distribution of CONV-RT on central horizontal and vertical profiles at depths of 2, 4, and 6 mm; E. Dose heatmap of SFRT and FLASH-SFRT at a depth of 2 mm; F. Percentage depth dose of SFRT and FLASH-SFRT; G, H. Dose distribution of SFRT and FLASH-SFRT on central horizontal and vertical profiles at depths of 2, 4, and 6 mm |
2. 不同照射方式对肿瘤生长及小鼠生存的影响：照射后前7 d，3个照射组肿瘤平均体积增长缓慢，表现出明显的肿瘤抑制效果。照后第6天，CONV-RT组肿瘤体积为(483.7±115.1)mm3，SFRT组为(438.8±105.4)mm3，FLASH-SFRT组为(405.0±98.0)mm3，明显低于对照组的(807.3±65.8)mm3。照后8、10、12 d，各照射组的肿瘤平均体积较对照组的差异更大(t=2.81~7.62，P＜0.05)。照后第12天，SFRT组为(960.6±172.4)mm3，FLASH-SFRT组为(931.7±243.3)mm3，均明显小于CONV-RT组的(1 246.3±240.1)mm3(t=2.34、2.26，P＜0.05)，表现出较常规剂量率照射更出色的抗肿瘤能力(图 3)。
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注：CONV-RT.常规剂量率照射；SFRT.常规空间分割照射；FLASH-SFRT.超高剂量率空间分割照射；a与对照组相比，t=2.81~7.62，P＜0.05；b与CONV-RT组相比，t=2.34、2.26，P＜0.05 图 3 不同照射处理后不同时间点的小鼠的肿瘤体积 Figure 3 Tumor volume of mice at different time points after different irradiation treatments |
于照后第12天处死小鼠，取出肿瘤，CONV-RT组肿瘤质量为(2.0±0.5)g，SFRT组为(1.7±0.4)g，FLASH-SFRT组为(1.7±0.3)g，均低于对照组的(3.2±0.7)g，差异具有统计学意义(t=2.91、4.16、4.41，P＜0.05)。
3.安全性研究：对照组、CONV-RT组、SFRT组及FLASH-SFRT组均未观察到照射区明显的皮肤脱落、白化、脱屑、红斑等情况(图 4)。皮肤Masson染色结果显示，各照射组未出现明显的皮肤角化、溃疡等损伤。半定量化各组胶原纤维容积，也未观察到明显差异(P＞0.05)。小鼠股骨HE染色结果显示，各照射组均未见明显骨髓不良反应。此外，各组小鼠质量差异无统计学意义(P＞0.05)，显示出良好的安全性。
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注：CONV-RT.常规剂量率照射；SFRT.常规空间分割照射；FLASH-SFRT.超高剂量率空间分割照射 图 4 各组小鼠皮肤(Masson染色)及骨髓(HE染色)镜下观察×10 Figure 4 Mice skin (Masson staining) and femur (HE staining) of different radiation groups ×10 |
讨论
FLASH-RT和SFRT是目前肿瘤放疗领域非常前沿的两种放疗方式，两者均采用非常规照射，在保证抗肿瘤效应的同时降低了放疗不良反应。尽管两种技术的治疗潜力已得到证实，但将FLASH-RT与SFRT结合能否在极短时间内最大程度保护正常组织并提高治疗效果, 或者是否会出现新的生物学效应，目前并不清楚。两种技术的最佳剂量学参数(如剂量率、剂量、分割次数、峰谷剂量比)及物理学参数(如孔径大小、中心孔距)也尚未确定，而实现超高剂量率的同时将光束形成峰谷交替的剂量分布也充满挑战。目前，仅国外报道了FLASH-RT与SFRT成功结合的案例，所使用的加速器为欧洲同步辐射加速器(European Synchrotron Radiation Facility，ESRF)[6-8]，以及欧洲核子研究所的电子直线加速器(CERN Linear Electron Accelerator for Research，CLEAR)[9-10]，成本高、技术复杂，临床转化价值有限。此外，也有商用质子放疗采用笔形束扫描(pencil-beam scanning，PBS)系统实现超高剂量率(40~160 Gy/s)与空间分割放疗的联用[11-12]，然而PBS系统难以实现直径小于2~4 mm的光束，无法达到MBRT/MRT水平[13]。本研究采用国产小型电子FLASH设备与自制的挡铅板成功实现了FLASH-RT与SFRT(MBRT)的联合，发现FLASH-SFRT相较传统放疗抑瘤效果更显著，且无明显皮肤及骨髓不良反应。目前，国际上鲜有使用小型FLASH-RT设备联合MBRT照射，本研究也是国内首次评估MBRT放射生物学效应的研究。
本研究在剂量设置中，选择5 Gy作为CONV-RT组的照射剂量，这是小鼠乳腺癌模型中确认的有效剂量[14]。为了在同等剂量条件下比较均匀剂量照射与峰谷剂量照射之间的抗瘤及安全性差异，SFRT以及FLASH-SFRT组选择了5 Gy的平均剂量照射，此时其峰剂量约为15 Gy，谷剂量约为2 Gy。照射后，发现CONV-RT、SFRT及FLASH-SFRT组均有着明显的肿瘤控制效果，并且SFRT和FLASH-SFRT射野(9 mm × 9 mm)较CONV-RT(12 mm × 20 mm)小。而放疗后第12天时，SFRT与FLASH-SFRT两组的肿瘤体积均显著小于CONV-RT组，提示在相同的平均剂量下，SFRT这种高度不均匀照射策略相较于均匀剂量照射的CONV-RT拥有更优异的抑瘤效果，这可能是由于非均匀照射产生的旁观者效应、免疫激活等机制所致。
安全性研究显示，各组均未观察到明显的毛发脱落、白化、脱屑、红斑、纤维化等放射性皮肤损伤，而股骨染色也未观察到各照射组明显的骨髓不良反应，这可能与照射剂量不高及电子线穿透能力有限有关。本研究并未发现FLASH-SFRT有叠加的保护效应，可能是由于本研究选择的照射剂量相对较小，主要起到抑制肿瘤生长的作用，CONV-RT照射已表现出较好的安全性。值得注意的是，目前认为FLASH效应存在一定剂量阈值，即触发FLASH效应的最小单次剂量[15]。然而，皮肤及骨髓的FLASH效应剂量阈值尚不明确，有研究发现在25、27、30、35 Gy/次[16-18]及35 Gy/2次[19]的剂量下观察到了皮肤的FLASH效应，在30 Gy[17]剂量下证实了骨的FLASH效应，由此推测，提高照射总剂量可能有助于发现新的安全优势。未来还需进一步探索FLASH-SFRT照射的最佳剂量学及物理学参数(如剂量率、剂量、分割模式、脉冲结构、照射孔径大小等)，以进一步优化FLASH-SFRT模式，确定最佳临床应用适应证。
本研究也有一定局限性。首先，电子FLASH-RT组织穿透性较差，仅适用于浅表肿瘤的治疗，临床应用潜力有限，未来进行X射线以及质子FLASH-SFRT的联合可能价值更大。其次，由于构建的小鼠大腿皮下荷瘤模型，难以在观测抗瘤效应的同时，多器官、多维度地评估FLASH-SFRT的安全性。最后，本研究中的SFRT与FLASH-SFRT组的剂量方阵分布未完全均匀，少部分点阵边缘孔的峰剂量未能达到预设剂量，可能也会影响肿瘤杀伤效果。
综上，FLASH-RT联合SFRT照射与SFRT照射在肿瘤生长抑制方面显著优于常规剂量率照射，且不产生明显的皮肤及骨髓不良反应，有望进一步优化照射方式。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 李东亮负责实验设计、实验实施、文章撰写；路顺负责放疗技术指导、实验设计；王建新负责实验实施、实验质量控制；李林涛负责放疗技术指导；申玉凤、吴哲瑶负责数据整理统计；周杰负责实验设计、论文修改
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