高剂量放疗对不可手术的或未能彻底清除的骨肉瘤可达到令人满意的局部控制率^[1-2]。然而，高剂量导致的严重不良反应限制了放疗的应用^[3]。因此，迫切需要阐明骨肉瘤放射抵抗的潜在机制，为骨肉瘤的放射增敏提供新的靶点。

转化生长因子-β超家族成员生长分化因子15(growth differentiation factor 15，GDF15)广泛参与器官的分化发育调控，并在多种病理条件下表达上调^[4]，已被证实是心血管等代谢性疾病诊断或预后的标志物，并成为新药研发的热门靶点。研究证实，GDF15在骨髓间充质干细胞、乳腺癌、鼻咽癌、肺癌以及胶质母细胞瘤的辐射抗性中发挥重要作用^[5-9]，但少有报道GDF15是否影响骨肉瘤的放射敏感性，且GDF15中和抗体已在缓解癌症恶病质的临床试验中展现出良好的安全性^[10-11]。本研究选择骨肉瘤作为研究模型，检测了GDF15在骨肉瘤照射前后的表达变化，并阐明GDF15参与骨肉瘤放射耐受的机制，以期为骨肉瘤的放疗增敏提供新的思路。

1. 主要材料与仪器：骨肉瘤肿瘤及癌旁组织收集于2020年12月至2024年1月陆军军医大学第二附属医院骨科收治的4例骨肉瘤患者，所有患者均签署了知情同意书；骨肉瘤细胞U2OS和Saos2购于美国ATCC公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清购于美国GIBCO公司；辣根过氧化物酶标记二抗、放射免疫沉淀法缓冲液、超氧阴离子活性氧检测试剂盒、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽检测试剂盒、脂质氧化检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；Annexin ⅤPE/7AAD细胞凋亡检测试剂盒购于美国BD Biosciences公司；NRF2、GDF15、γ-H2AX一抗购于英国Abcam公司；Caspase3和Cleaved Caspase-3一抗购于美国Cell Signaling公司；RNAiMAX转染试剂、荧光二抗购于美国赛默飞世尔科技公司；⁶⁰Co放射源为加拿大诺迪安公司的固定源式湿贮源γ照射装置；流式细胞仪为美国贝克曼库尔特公司的CytoFlex LX；PCR仪为美国赛默飞世尔科技公司的Quantstudio Ⅰ；化学成像发光系统为美国AcuronBio公司的FluorQuant AC600；倒置荧光显微镜为德国蔡司公司的Axio Vert A1。

2. 细胞培养及照射：在含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗的RPMI 1640培养基中，37℃、5% CO₂浓度的条件培养骨肉瘤细胞U2OS和Saos2。以⁶⁰Co γ放射源对细胞进行9 Gy的照射，源靶距为102 cm，剂量率1 Gy/min^[12]，实验随机分为阴性对照组、GDF15沉默组、照射对照组、联合处理组。

3. 细胞转染：细胞密度生长至50%~60%时，将RNAiMAX转染试剂与siRNA等体积混匀至终浓度为20 nmol/L，加入培养瓶中继续培养24 h后进行基因和蛋白表达水平验证。siGDF15序列为GACCUAUGAUGACUUGUUA。

4. 克隆形成实验：将U2OS以1 000/孔接种于六孔板中，GDF15沉默组或阴性对照组转染24 h后，将细胞分别进行0、3、6、9 Gy的照射处理，继续培养10 d，结晶紫染色，拍照、计数。ImageJ 1.52a统计染色面积后导入Graphpad Pism 9.5进行作图。存活分数计算公式：克隆数/ (接种细胞数×未照射细胞克隆形成率)^[13]。

5. 转录组测序：照射处理后0和24 h收集细胞样品提取RNA，转录组测序由武汉华大医学检验所有限公司完成。通过HTSeq进行基因表达水平分析，按照P＜0.05和变化倍数＞1.2或变化倍数＜0.833筛选差异表达基因，随后使用GoSeq软件对差异表达基因进行功能基因本体论(gene ontology, GO)富集分析。

6. 细胞凋亡检测：照射处理后继续培养24 h收集细胞，以凋亡检测缓冲液重悬细胞，随后每管加入5 μl Annexin Ⅴ-PE和5 μl 7-AAD，室温避光30 min后，112 × g离心5 min，使用磷酸盐缓冲液PBS重悬细胞通过流式细胞仪检测细胞凋亡(PE激发波长488 nm/7-AAD激发波长546 nm)。

7. 细胞周期检测：112 × g离心5 min收集细胞，70%的预冷乙醇重悬细胞后于-20℃固定过夜，再以448 × g离心5 min后用DAPI溶液(5 μg/ml)重悬细胞，37℃避光孵育30 min，448 × g离心5 min收集细胞后用PBS重悬并通过流式细胞仪检测细胞周期(DAPI激发波长405 nm)。

8. 荧光定量PCR检测：使用TRIzol裂解液提取RNA，以1 μg的RNA总量进行反转录。按照12.5 μl Mix、1 μl上游引物、1 μl下游引物、8.5 μl DEPC水、2 μl cDNA配置qPCR反应体系，通过荧光定量PCR仪进行定量检测(表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences 引物基因 正向引物5’→3’ 反向引物5’→3’ GDF15 GACCCTCAGAGTTGCACTCC GCCTGGTTAGCAGGTCCTC SLC3A2 GTGCTGGGTCCAATTCACAAG CACCCCGGTAGTTGGGAGTA SLC7A11 GGTCCATTACCAGCTTTTGTACG AATGTAGCGTCCAAATGCCAG GPX4 GAGGCAAGACCGAAGTAAACTAC CCGAACTGGTTACACGGGAA ACSL4 AACCCAGAAAACTTGGGCATT GTCGGCCAGTAGAACCACT β-肌动蛋白 ACCCCGTGCTGCTGACCGAG TCCCGGCCAGCCAGGTCCA

表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences

9. Western blot：使用RIPA裂解液提取蛋白，90 V电压电泳30 min，待样本进入分离胶后再转为130 V电压电泳1 h，随后以恒定电流300 mA转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，含吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗膜3次后于4℃进行一抗(1∶1 000)过夜孵育。洗去一抗后于室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)2 h，洗膜后滴加显影液并通过化学发光成像系统进行显影。

10. ROS检测：按超氧阴离子活性氧检测试剂盒说明书操作，二氢乙锭按照1∶1 000使用assay buffer稀释后与U2OS在37℃共孵育30 min，随后通过倒置荧光显微镜观测活性氧染色结果。按线粒体膜电位检测试剂盒操作，四甲基罗丹明乙酯按照1∶1 000使用assay buffer稀释后与U2OS在37℃共孵育45 min，随后通过倒置荧光显微镜观测线粒体染色结果。

11. 免疫荧光检测：于4℃多聚甲醛中固定细胞30 min，0.5% Triton X-100通透10 min后用细胞封闭液处理，加入一抗(1∶200)并于4℃过夜孵育。洗去一抗后，加入荧光二抗(1∶200)室温孵育1 h，洗去荧光二抗后滴入封片液，通过激光共聚焦显微镜拍照分析。

12. 统计学处理：使用GraphPad Prism 9.5进行作图和统计分析，所有实验重复3次，数据符合正态分布，且满足方差齐性，用x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

1. GDF15在骨肉瘤组织高表达且可被放射诱导：结果示于图 1，对收集到的骨肉瘤组织病理标本进行免疫组织化学染色发现，GDF15在所有骨肉瘤组织中强阳性表达。在4例手术切除的骨肉瘤组织新鲜标本中GDF15的mRNA及蛋白表达水平均显著高于对应癌旁组织(t_mRNA = 5.33 ~ 16.32，t_蛋白= 3.21 ~ 13.49，P＜0.05)。分析GSCA数据库可知，GDF15在包括肺腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、甲状腺癌等多种癌症中高表达(变化倍数= 2.34 ~ 22.89，P＜0.05)，仅在肾透明细胞癌和肺鳞状细胞癌中低表达(变化倍数= 0.36、0.49，P＜0.05)。此外，低表达GDF15的肉瘤患者与高表达组相比，具有更长的生存期。与阴性对照组相比，照射可诱导人骨肉瘤细胞细胞系U2OS和Saos2中GDF15的mRNA和蛋白水平持续升高，在2 h时即出现差异有统计学意义(t_U2OS = 12.90~54.71，P＜0.05；t_Saos2 = 5.46~ 37.69，P＜0.05)，提示骨肉瘤组织高表达的GDF15在放射后表达进一步升高，可能参与放射抵抗。鉴于U2OS为P53野生型细胞系而Saos2为P53突变型细胞系，且大量研究提示P53在骨肉瘤放疗抵抗中的具有重要作用^[14-15]，本文后续实验选择U2OS为主要研究对象。

注：T-1 ~ T-4表示4例临床癌组织样本，N-1 ~ N-4表示4例配对的癌旁样本。a与T-1相比，t= 16.32，P＜0.05；b与T-2相比，t= 10.38，P＜0.05；c与T-3相比，t= 13.90，P＜0.05，d与T-4相比，t= 5.33，P＜0.05；e与U2OS阴性对照组相比，t = 12.90 ~ 54.71，P＜0.05；f与Saos2阴性对照组相比，t = 5.46 ~ 37.69，P＜0.05 图 1 GDF15在骨肉瘤组织高表达且可被放射诱导表达 A. 肉瘤组织病理标本的免疫组织化学染色×20；B、C. 骨肉瘤癌及癌旁肿瘤组织中GDF15的mRNA与蛋白表达；D. GDF15在不同癌组织中的表达；E. GDF15与肉瘤患者总生存期的关系；F~I. U2OS和Saos2细胞照射后GDF15的mRNA和蛋白表达 Figure 1 High expression level of GDF15 in osteosarcoma tissues, which can also be induced by radiation A. Immunohistochemical staining of histopathological specimens of sarcoma issues × 20; B, C. mRNA and protein expression levels of GDF15 in cancerous and paracancerous tissues of osteosarcoma; D. Expression levels of GDF15 in different cancer tissues; E. Relationship between GDF15 and overall survival of sarcoma patients; F-I. mRNA and protein expression levels of GDF15 in irradiated U2OS and Saos2 cells

2. 沉默GDF15促进受照射U2OS细胞的凋亡：如图 2所示，沉默GDF15的U2OS细胞系中，GDF15的mRNA水平显著低于阴性对照组(t =26.05 ~ 37.68, P＜0.05)，GDF15蛋白表达也明显下降，其中siRNA-3用于后续实验。克隆形成实验表明，siGDF15可增强放射对U2OS的杀伤效果，在9 Gy时效果最为显著(t= 12.06, P＜0.05)；与照射对照组相比，联合处理组显著增加细胞凋亡率(t= 10.93, P＜0.05)；导致更多的细胞处于G₂/M期(t= 15.63, P＜0.05)；γ-H2AX焦点数量显著升高(t= 15.54, P＜0.05)；以及与之相应的Cleaved Caspase-3表达量上调。上述结果表明，沉默GDF15可增加U2OS细胞的放射敏感性。

注：1. 阴性对照组；2. GDF15沉默组；3. 照射对照组；4. 联合处理组。a与NC组相比，t = 26.05 ~ 37.68，P＜0.05; b与NC+IR组相比，t= 12.06，P＜0.05；c与照射对照组相比，t= 10.93，P＜0.05；d与照射对照组相比，t= 15.63，P＜0.05；e与照射对照组24 h相比，t= 15.54，P＜0.05 图 2 敲低GDF15可促进受照射U2OS细胞的凋亡 A、B. qPCR和Western blot筛选靶向GDF15的siRNA；C. 不同处理组的细胞克隆形成能力评估；D. 不同处理组的细胞凋亡流式统计；E. 不同处理组的细胞周期流式统计；F~G. 不同处理组的细胞在4 h和24 h的γ-H2AX免疫荧光检测×40；H. γ-H2AX平均荧光强度统计；I. 不同处理组细胞凋亡标志物的蛋白表达 Figure 2 Knockdown of GDF15 promoting the apoptosis of irradiated U2OS cells A, B. Selection of siRNAs targeting GDF15 through qPCR and Western blot; C. Evaluation of colony-forming ability of cells in different treatment groups; D. Apoptosis of different treatment groups; E. Cell cycle of different treatment groups; F-G. Immunofluorescence detection of γ-H2AX in different treatment groups at 4 h and 24 h ×40; H. Statistics of the mean fluorescence intensities of γ-H2AX; I. Expression levels of of apoptosis markers of different treatment groups

3. 联合处理组的U2OS细胞转录组测序分析：结果示于图 3，对GDF15沉默组及阴性对照组细胞照射后，进行转录组学测序分析发现，照射与否、GDF15敲除与否的不同处理组可在主成分分析聚类上被区分开；按照变化倍数> 1.2或＜0.833且P＜0.05筛选照射对照组和联合处理组，得到3 238个显著差异表达基因；通过GO分析则发现与ROS相关的信号通路被富集。筛选到与ROS相关的基因如ACSL4、SLC7A11、GPX4、SLC3A2等因沉默GDF15而改变；qPCR证实，相较于照射对照组，联合处理组导致GPX4、SLC7A11、SLC3A2显著降低(t = 6.36 ~ 11.11，P＜0.05)以及ACSL4显著升高(t= 3.06，P＜0.05)。提示沉默GDF15导致的U2OS放射敏感性增加可能与ROS有关。

注：1. 阴性对照组；2. GDF15沉默组；3. 照射对照组；4. 联合处理组。a与照射对照组比较，t = 3.06 ~ 11.11，P＜0.05 图 3 联合处理组的转录组测序分析 A. 细胞主成分分析; B、C. 差异基因进行GO分析及热图展示；D. 不同处理组GPX4、ACSL4、SLC7A11、SLC3A2的mRNA变化 Figure 3 Transcriptome sequencing analysis of the combined treatment group A. Principal component analysis of cells; B, C. Gene ontology (GO) analysis and heatmap display of differentially expressed genes; D. Changes in mRNAs of GPX4, ASCL4, SLC7A11, and SLC3A2 in different groups

4. GDF15的缺失导致照射后U2OS细胞内ROS水平升高：如表 2所示，与照射对照组相比，联合处理组可在照射后4、12、24 h导致ROS水平升高，差异具有统计学意义(t = 20.95 ~ 53.07，P＜0.05)，GDF15沉默还会导致照射后U2OS细胞线粒体膜电位降低(t = 57.32 ~ 75.31，P＜0.05)。如表 3所示，照射后4和24 h，联合处理组中GSH水平显著低于照射对照组(t= 68.89、15.04，P＜0.05)；而MDA含量显著高于照射对照组(t= 3.86、2.91，P＜0.05)。以上结果表明，沉默GDF15可增加骨肉瘤细胞受照后ROS水平，加剧细胞的氧化损伤。

表 2(Table 2)

表 2 照射后不同时间段活性氧与线粒体膜电位的荧光统计(AU，x±s) Table 2 Statistics of the mean fluorescence intensities of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial membrane potential (MMP) at different time points after irradiation (AU, x±s) 照后时间(h) 组别 活性氧 线粒体 0 照射对照组 6.52±0.35 65.24±1.82 0 联合处理组 14.52±1.06 64.99±1.39 4 照射对照组 61.36±1.30 5.39±0.35 4 联合处理组 74.93±1.67a 4.11±0.17b 12 照射对照组 23.56±0.22 30.56±1.05 12 联合处理组 56.83±1.72a 9.84±0.81b 24 照射对照组 5.53±0.62 57.27±0.45 24 联合处理组 28.30±0.43a 10.65±0.88b 注：a与0 h联合处理组相比，t = 20.95 ~ 53.07，P＜0.05；b与0 h联合处理组相比，t = 57.32 ~ 75.31，P＜0.05

表 2 照射后不同时间段活性氧与线粒体膜电位的荧光统计(AU，x±s) Table 2 Statistics of the mean fluorescence intensities of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial membrane potential (MMP) at different time points after irradiation (AU, x±s)

表 3(Table 3)

表 3 照射后不同时间段GSH与MDA的水平变化(x±s) Table 3 Changes in GSH and MDA contents at different time points after irradiation(x±s) 组别 样本数 GSH MDA 4 h 24 h 4 h 24 h 阴性对照组 3 0.21±0.01 0.33±0.06 0.17±0.01 0.10±0.01 GDF15沉默组 3 0.17±0.02 0.24±0.04 0.18±0.01 0.12±0.02 照射对照组 3 0.25±0.01 0.34±0.01 0.22±0.01 0.12±0.02 联合处理组 3 0.11±0.01a 0.14±0.02a 0.30±0.03b 0.16±0.02b 注：GSH. 谷胱甘肽；MDA. 丙二醛。aGSH与照射对照组4 h比较，t= 68.89、15.04，P＜0.05；bMDA与照射对照组4 h比较，t= 3.86、2.91，P＜0.05

表 3 照射后不同时间段GSH与MDA的水平变化(x±s) Table 3 Changes in GSH and MDA contents at different time points after irradiation(x±s)

5. 重组GDF15减少照射后U2OS细胞凋亡：示于图 4，联合处理组Nrf2的mRNA水平较照射对照组显著降低，差异具有统计学意义(t= 25.55，P＜0.05)；以及Nrf2蛋白表达降低和核定位减少。添加外源GDF15单克隆抗体ponsegromab(珀塞古单抗)可有效降低放射后Nrf2蛋白表达水平，而添加外源重组GDF15蛋白(rhGDF15)则明显增加放射后Nrf2的蛋白表达水平。相比于照射对照组，ponsegromab或rhGDF15预处理分别显著提高或降低了照射后U2OS的细胞凋亡率(t= 10.1、21.32，P＜0.05)；以及与之相应的γ-H2AX焦点数量增加或减少。上述结果进一步揭示了GDF15表达水平高低与骨肉瘤细胞的放射抵抗具有相关性，Nrf2相关的ROS信号通路可能是其关键机制。

注：1. 阴性对照组；2. 珀塞古单抗处理；3. 重组GDF15处理组；4. 照射对照组；5. 珀塞古单抗联合照射组；6. 重组GDF15联合照射组。a与照射对照组比较，t= 10.1、21.32，P＜0.05 图 4 重组GDF15减少照射后U2OS细胞凋亡 A. Nrf2和GDF15免疫荧光检测；B. Nrf2的蛋白表达变化; C. 不同处理组的细胞凋亡流式统计; D. 不同处理组的细胞在4 h和24 h的γ-H2AX免疫荧光检测 Figure 4 Recombinant GDF15 reducing the apoptosis of irradiated U2OS cells A. Immunofluorescence test results of Nrf2 and GDF15; B. Changes in protein expression of Nrf2; C. Apoptosis of different treatment groups; D. Immunofluorescence test results of γ-H2AX from different treatment groups at 4 h and 24 h

骨肉瘤多发于四肢长骨的干垢端，其死亡率和致残率始终居高不下^[16]。治疗技术并未显著提升过去40年患者生存率^[17]。因此，亟需揭示骨肉瘤放化疗抵抗的分子机制，为探索潜在的治疗及放化疗增敏靶点和开发新的疗法奠定基础。

GDF15是一种多效性细胞因子，既往研究主要集中于其在肥胖、心血管疾病、肿瘤恶病质等疾病中的作用^[18]。近年的证据表明，GDF15在乳腺癌、胃癌、前列腺癌和胰腺癌等恶性肿瘤患者血清中的浓度急剧升高，被认为是肿瘤进展的标志物^[19]。此外，GDF15还可被缺氧、炎症等理化因素刺激后表达上调^[20]。但骨肉瘤组织中GDF15表达水平及其作用的研究较为少见。本研究证实，GDF15的mRNA和蛋白水平在骨肉瘤组织中都远高于对应的癌旁组织，且骨肉瘤细胞中GDF15的表达水平在电离照射后持续升高。这表明GDF15的表达上调可能参与了骨肉瘤的放射抵抗。

本研究通过siRNA抑制骨肉瘤细胞中GDF15后，可增加放射诱导的细胞凋亡，与GDF15促进乳腺癌放疗抵抗等^[6]结果一致。GDF15介导的放疗抵抗的作用机制在不同的癌症类型中也存在明显差异。在胶质母细胞瘤中，GDF15的高表达可通过p-MAPK/SP1通路促进细胞增殖和肿瘤血管生成以增强其放射抗性^[9]；而在肺癌中，GDF15的放射抵抗作用，通过激活TGF-β/Smad通路实现^[8]。本研究通过生信分析表明，敲低GDF15导致放射后抗氧化过程发生显著变化，其中关键分子GPX4、SLC7A11、SLC3A2等也参与铁死亡过程。尽管这些分子已被证实与骨肉瘤的增殖、转移和耐药等有关^[21-23]，但是否促进放射抵抗还未见报道，因此，推测GDF15可能通过影响铁死亡进程进而促进骨肉瘤的放射抵抗。本研究证实，敲低GDF15可诱导放射后骨肉瘤细胞中ROS水平升高、线粒体膜电位降低等。这些结果证明GDF15在骨肉瘤中的放射抵抗作用机制可能与ROS清除有关。

已有大量研究在探索安全有效的骨肉瘤放射增敏剂，如共掺杂钽、锆和卟啉分子的纳米级金属有机框架，这些分子可有效阻止骨肉瘤的生长和转移^[24]；小分子化合物PD0166285通过抑制WEE1激酶活性降低损伤DNA的修复能力，从而增加照射后细胞的凋亡^[25]。然而，这些骨肉瘤放疗增敏剂都因存在较强的不良反应，限制其临床应用。本研究使用的GDF15单克隆抗体珀塞古单抗，已在癌症恶病质的临床试验中展现出极好的疗效和安全性^{[10, 26]}，具有重要的临床应用价值。本研究结果表明，珀塞古单抗可大幅增加放射诱导的骨肉瘤细胞凋亡，表明以GDF15为靶点的珀塞古单抗，能够提高骨肉瘤的放疗敏感性，具有重大的临床转化意义。

综上，本研究表明，在骨肉瘤组织中高表达的GDF15，能够调控照射后的氧化应激损伤反应，敲低GDF15增加了骨肉瘤细胞对电离照射的敏感性。未来将深入探索GDF15清除ROS的机制，以及珀塞古单抗对骨肉瘤放疗增敏有效性的体内验证实验，以期为开发骨肉瘤的放疗增敏新策略奠定基础。

利益冲突  无

作者贡献声明  林川川负责实验操作、数据整理、论文撰写；于加武协助部分实验操作；杨振兴负责部分数据分析；冉茜、李忠俊指导实验和论文修改；向阳负责实验设计