2026, Vol. 46
2. 温州医科大学公共卫生学院, 温州 325035
2. School of Public Health, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China
氚(3H)的来源分为天然和人工来源，人工来源的氚对环境的贡献比例大，其主要来自于核电站及乏燃料后处理厂、核武器实验、核事故、氚生产设施以及医疗和科研研究设施等[1-2]，其中核电厂的氚排放是环境最大的人工氚来源[3]。氚作为氢的同位素可直接参与水循环，迅速被整合到包括植物和动物在内的所有环境分区中，进而参与生态循环[4]。氚进入生物体后在生物组织中以3种形式存在：组织游离水氚(TFWT)、可交换的有机结合氚(E-OBT)和不可交换有机结合氚(NE-OBT)[5-7]，其中NE-OBT在组织中比E-OBT更稳定。在水生生物群中，由于呼吸、渗透调节，TFWT与周围环境中的氚水(HTO)浓度可以很快(在几分钟或几小时内)达到平衡[8]，暴露在HTO中的鲍鱼与褐藻体内的TFWT浓度在1 h内即可达到饱和并与环境氚浓度平衡[9]。进入机体的氚参与生物的代谢循环，基于生物半排期的差异，有机结合氚(OBT)在生物体内的滞留时间较TFWT长，并可通过食物链进入更高营养级生物体内，逐渐富集形成动态积累[10]。目前氚毒性的研究主要集中在急性暴露的神经毒性、生长发育毒性、生殖毒性及遗传毒性等[5, 11-13]。氚亚慢性及慢性暴露相关研究较少，同时，辐射敏感性在同一生物体中不同组织、不同生命阶段以及不同生理状态下都表现出不同，故氚亚慢性暴露的损伤效应值得关注。
材料与方法1.斑马鱼：使用野生型AB品系斑马鱼，采购于中国国家水生生物物质资源库国家斑马鱼资源中心，实验中所有程序均经苏州大学动物管理和使用委员会批准。将成年野生型AB品系斑马鱼雌雄分开，饲养于28℃恒温循环水养殖系统，pH值7.0±0.5，电导率为850~900 μs/cm，14 h ∶10 h光照和黑暗光周期，养殖室温维持(28±1)℃，定时喂食。
2. 氚水暴露：HTO购于北京同辐股份有限公司。对于实验暴露，将3月龄成年雌性斑马鱼转移到3 L的玻璃水族缸中，水族缸中加入2.6 L水，各水族缸均配备循环水系统，整个实验过程中，水质参数始终保持在可接受的范围内。选取3月龄成年雌性斑马鱼，按照随机数表法分为对照组、3.7×102、3.7×103、1.85×104、3.7×104 Bq/ml组，每组5条，暴露30 d。
3. 成年雌性斑马鱼卵巢中的氚浓度及生物富集系数：HTO暴露期间，每5天采集水样，测定环境水中氚含量以保证HTO暴露活度浓度保持稳定。用6 ml纯净水稀释2 ml HTO样品，与12 ml液体闪烁液(美国PE公司)混合，用闪烁计数仪(QuantulusTM 6220, 美国Perkin Elmer公司，WinQ software)测量水中氚含量。不同活度浓度HTO暴露30 d的成年雌性斑马鱼卵巢称重并研磨，加入1 ml的1∶1.5高氯酸和过氧化氢的混酸溶液，置于65℃水浴锅中进行水浴消解，向消解好的待测液中加入2 ml纯净水，将待测液进行稀释，取2 ml稀释液，加入6 ml纯净水和12 ml液体闪烁液，用力振荡使样品与闪烁液充分混匀，加盖密封，避光放置。评估成年雌性斑马鱼卵巢中的总氚浓度，样品中氚的放射性浓度A及生物富集系数(BCF)计算如下[11]：
| $ A=\frac{\mathrm{cpm}_{\mathrm{s}}-\mathrm{cpm}_{\mathrm{b}}}{V \cdot E} $ | (1) |
式中，A为样品中氚的比活度，Bq/g鲜重；V为测量中所用的体积，ml；cpms为待测样本的总计数率，s-1；cpmb为本底的总计数率，s-1。
| $ \mathrm{BCF}=\frac{A_0}{A_w} $ | (2) |
式中，A0为生物体中总氚活度浓度，Bq/g鲜重；Aw为水中氚活度浓度，Bq/ml。
4. 产卵量：各组成年雌性斑马鱼在不同活度浓度HTO暴露30 d后，于晚上9：00将各组雌鱼与生育适龄期的雄鱼以1∶1的比例置于生殖缸中，用隔板将雌鱼雄鱼分隔开，待到第2天早上9：30抽出隔板，等候雌鱼和雄鱼受精产卵，11点收集胚胎并对受精卵进行计数。需保证所选取雄鱼均具有生殖能力，尽量避免雄鱼带来的影响，每个活度浓度组至少设置5个平行样。
5. 性腺指数：各组成年雌性斑马鱼在不同活度浓度HTO暴露30 d后，按照随机数表法每组取5条雌性斑马鱼，置于过量三卡因(MS222)溶液中麻醉致死，待斑马鱼心跳停止后，将其从MS222溶液中捞出。用滤纸吸干体表水分，对整鱼进行称重。用解剖镊子沿泄殖孔打开腹腔，取出卵巢并称重。性腺指数(GSI)=性腺质量/体质量×100%[14]。
6. 卵巢病理切片分析：各组成年雌性斑马鱼在不同活度浓度HTO暴露30 d后，按照随机数表法每组取5条，置于过量MS222溶液中麻醉致死，解剖其卵巢，制作组织切片，进行苏木精-伊红染色(HE)。观察卵母细胞损伤情况并统计各阶段卵母细胞数目，在10倍镜下观察各组雌鱼卵母细胞是否出现损伤现象，在4倍镜下选定单位面积视野对各阶段卵母细胞进行计数，统计各阶段卵母细胞百分比。
7. 性激素的测定：各组成年雌性斑马鱼在不同活度浓度HTO暴露30 d后，按照随机数表法每组取5条，置于过量MS222溶液中麻醉致死，解剖其性腺，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗并称重，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织按1∶9质量体积比加入PBS，随后在冰上进行充分研磨，对匀浆液进行超声破碎，进一步裂解组织细胞，最后将匀浆液于5 000×g离心5~10 min，取上清，使用酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA试剂盒)对雌二醇(E2)、卵黄蛋白原(VTG)和睾酮(T)3种性激素进行检测。
将ELISA试剂盒室温平衡30 min，从铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。设置标准品孔，标准品孔加入不同浓度标准品50 μl，样品孔加入待测样品10 μl以及40 μl样品稀释液，空白孔不加。除空白孔外，标准品孔以及待测样品孔每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μl，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育60 min。温育结束后，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350 μl，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，重复洗板5次。洗板结束后，每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min。孵育结束后，每孔加入终止液50 μl，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的吸光度(A)值。
8. RT-qPCR：将解剖的各组雌鱼卵巢储存在TRIzol试剂中提取RNA，根据试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，并进行RT-qPCR分析。本研究选择了Cyp19a1、Fshr、Lhr、Figla、Zar1、Ar、Ptgs2a基因，将每个靶基因mRNA表达的相对定量标准化为Gapdh，用于RT-qPCR的引物列于表 1。每个反应孔含有5 μl SYBR Green Master Mix(YEASEN)、1 μl稀释的cDNA、0.2 μmol/L正向和反向引物以及3.6 μl无菌超纯水(YEASEN)，总体积为10 μl。通过熔解曲线分析优化引物，用于定量PCR。扩增靶基因和参考基因的PCR条件为：95℃ 2 min，95℃ 10 s，40个循环，基因特定温度下退火30 s。通过2-ΔΔct方法计算mRNA表达的结果。通过基因分析反映HTO亚慢性暴露对成年雌性斑马鱼卵巢发育生物大分子层面的影响。
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表 1 用于实时定量聚合酶链反应的引物序列 Table 1 Primer sequences for real-time quantification of polymerase chain reaction |
9. 统计学处理：使用GraphPad Prism 9.5进行统计分析。结果经正态性检验符合正态分布以x ±s形式表示。经方差齐性检验后，进行单因素方差分析，两组间比较采用Dunnett t检验。雌鱼卵巢中氚浓度与氚暴露活度浓度之间相关关系采用Pearson相关性分析及线性回归分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1. 水中及生物体中氚浓度的测定和生物富集系数的确定：HTO不同活度浓度暴露后成年雌鱼卵巢内的总氚浓度及BCF列于表 2。3.7×103、1.85×104、3.7×104 Bq/ml组斑马鱼卵巢BCF值为0.55，趋于稳定；3.7×102 Bq/ml组，斑马鱼卵巢BCF为0.28，明显小于其他各组(r=1.00, P < 0.001)，表明雌鱼卵巢中氚浓度与氚暴露活度浓度之间存在正相关关系。进一步进行线性回归分析，回归方程：卵巢中氚浓度=0.550 08×氚暴露活度浓度-27.801，回归系数为0.550 08 (P < 0.001)，R2= 0.999 9，模型拟合度高，雌性斑马鱼卵巢中氚浓度与氚暴露活度浓度存在显著的剂量线性关系。
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表 2 不同HTO活度浓度和成年雌性斑马鱼卵巢中的氚浓度以及卵巢氚生物富集系数(x ±s) Table 2 The activity concentration of HTO in each group, the tritium concentration in the ovaries of adult female zebrafish and the tritium bioaccumulation factor in the ovaries (x ±s) |
2. 产卵量的测定：各HTO暴露组中均观察到成年雌性斑马鱼产卵量显著减低(F=59.42，P＜0.05，表 3)。同时，随着HTO暴露活度浓度的增加，成年雌性斑马鱼产卵量呈下降趋势。在本实验中，非相邻活度浓度HTO暴露组具有显著差异(q=9.29、12.97、10.15，P＜0.05)，相邻活度浓度组中对照组与3.7×102 Bq/ml组、3.7×103 Bq/ml组与1.85×104 Bq/ml组差异有统计学意义(q=9.41、6.47，P＜0.05)。结果说明，HTO亚慢性暴露会影响成年雌性斑马鱼的生殖功能。
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表 3 不同活度浓度HTO暴露30 d后产卵量及性腺指数(x ±s) Table 3 Fecundity and GSI after 30 d exposure to HTO at different activity concentrations (x ±s) |
3. 性腺指数的测定：在不同活度浓度HTO暴露后，各暴露组的雌鱼性腺指数均呈现下降趋势(F=22.40，P＜0.05，表 3)。其中，3.7×102 Bq/ml组与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)，3.7×103、1.85×104、3.7×104 Bq/ml组较对照组的性腺指数下降(q=4.87、8.18、11.96，P＜0.05)，非相邻活度浓度HTO暴露组具有显著差异(q=5.85、9.63、7.09，P＜0.05)，相邻活度浓度HTO暴露组间差异无统计学意义(P＞0.05)。说明即使斑马鱼处于性成熟阶段，HTO亚慢性暴露也可导致雌性斑马鱼卵巢损伤，影响卵巢的进一步发育。
4. 卵巢观察及组织学分析：经HTO暴露30 d，成年雌鱼出现卵泡变性现象，变性卵泡呈透明化(图 1)。可观察到对照组卵泡饱满且排列紧密，3.7×102 Bq/ml组开始出现卵泡变性，数量相对较少，卵泡排列依旧紧密。随着HTO暴露活度浓度升高，变性卵泡数目逐渐增加，卵泡间的排列间隙开始增大，卵泡排列不再致密。在3.7×104 Bq/ml组，卵泡之间的排列间隙明显增大，变性卵泡不仅透明化甚至液化。
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注：红圈代表变性卵泡 图 1 HTO亚慢性暴露对斑马鱼卵泡发育情况的影响 A.对照组；B.3.7×102 Bq/ml组；C.3.7×103 Bq/ml组；D.1.85×104 Bq/ml组；E.3.7×104 Bq/ml组 Figure 1 Effect of subchronic HTO exposure on follicular development in zebrafish A. Control group; B. 3.7×102 Bq/ml group; C. 3.7×103 Bq/ml group; D. 1.85×104 Bq/ml group; E. 3.7×104 Bq/ml group |
在组织学切片观察中，3.7×102 Bq/ml组开始出现卵泡细胞与卵母细胞膜分离情况，见图 2。随着HTO暴露活度浓度的增加，在1.85×104 Bq/ml活度浓度HTO暴露下，卵母细胞变性种类增加，出现卵母细胞闭锁。在3.7×104 Bq/ml活度浓度HTO暴露下，卵母细胞变性种类进一步增多，出现核内含物沿核膜排列和核固缩现象。
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注：PG.初级卵母细胞；PV.皮质肺泡期卵母细胞；EV.卵黄形成早期卵母细胞；MV.卵黄形成中期卵母细胞；LV.卵黄形成晚期卵母细胞；FG.成熟阶段卵母细胞。 为卵泡细胞与卵母细胞分离；→为卵母细胞闭锁； 为核内含物沿核膜排列； 为核固缩
图 2 暴露于不同活度浓度HTO 30 d后的成年雌性斑马鱼卵巢组织学分析 A.对照组；B.3.7×102 Bq/ml组；C.3.7×103 Bq/ml组；D.1.85×104 Bq/ml组；E.3.7×104 Bq/ml组
Figure 2 Histological analysis of ovary tissue from adult female zebrafish exposed to different activity concentrations of HTO for 30 d A. Control group; B. 3.7×102 Bq/ml group; C. 3.7×103 Bq/ml group; D. 1.85×104 Bq/ml group; E. 3.7×104 Bq/ml group
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针对卵母细胞发育阶段问题，病理切片显示在1.85×104 Bq/ml活度浓度HTO暴露后出现初级卵母细胞积聚现象，多个初级卵母细胞聚集成一团；3.7×104 Bq/ml活度浓度HTO暴露时，初级卵母细胞及皮质肺泡期卵母细胞明显增加，成熟卵母细胞明显减少。对各组组织切片单位面积内不同阶段卵母细胞数目进行统计，发现随着HTO暴露活度浓度的增加，初级阶段卵母细胞增加，成熟阶段卵母细胞减少，见图 3。实验结果表明HTO亚慢性暴露可能阻滞卵母细胞发育。
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注：a与对照组比较，q=5.53、5.00、4.82、5.27、5.77、8.64、11.04、6.30、8.14、8.89、5.84、6.45、7.36、8.04，P＜0.05；b与3.7×102 Bq/ml组比较，q=4.87、5.01、4.90、7.48、6.03、7.87、8.62，P＜0.05；c与3.7×103 Bq/ml组比较，q=6.52，P＜0.05 图 3 暴露于不同活度浓度HTO 30 d后的成年雌性斑马鱼卵巢内各阶段卵母细胞占比 Figure 3 The proportion of oocytes at each stage in the ovaries of adult female zebrafish exposed to different activity concentrations for 30 d at different activity oncentrations |
5. 性激素水平：实验测定了E2、VTG和T 3种性激素，E2和VTG是调控雌性斑马鱼卵巢发育的核心因子，二者协同参与卵黄形成、卵母细胞成熟以及生殖功能的维持；T作为雌激素E2的前体，通过转化为E2驱动卵黄的生成和卵母细胞的发育。在HTO暴露30 d后，E2、VTG和T含量均呈现下降趋势，见表 4，在E2和VTG的测定中，只有3.7×104 Bq/ml组较对照组差异有统计学意义(q=6.27、6.19，P＜0.05)；在T的测定中，1.85×104与3.7×104 Bq/ml组较对照组差异有统计学意义(q=6.38、8.34，P＜0.05)。
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表 4 暴露于不同活度浓度HTO 30 d后的成年雌性斑马鱼内性激素E2、VTG、T的含量(ng/g，x ±s) Table 4 The contents of sex hormones E2, VTG and T in the ovaries of adult female zebrafish exposed to different activity concentrations for 30 d(ng/g, x ±s) |
6. 相关基因表达的测定：测定了不同阶段卵母细胞中的高表达基因。包括在初级生长阶段高表达的Figla基因、在初级生长阶段以及皮质肺泡期高表达的Zar1基因、在皮质肺泡期向卵黄生成期高表达的Ar基因以及在成熟阶段高表达的Ptgs2a基因[15]。各阶段卵母细胞基因表达结果见图 4，其结果与组织切片中各阶段卵母细胞计数结果相符合，证明HTO亚慢性暴露可导致卵母细胞发育受到阻滞。
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图 4 暴露于不同活度浓度HTO 30 d后的成年雌性斑马鱼卵巢内各阶段marker基因及相关生殖基因的相对表达水平 Figure 4 Relative expression levels of stage-specific marker genes and related reproductive genes in the ovaries of adult female zebrafish exposed to different activity concentrations of HTO for 30 d |
同时，测定了与雌鱼生殖相关的Cyp19a1、Fshr、Lhr基因，在HTO暴露30 d后，成年雌性斑马鱼卵巢内3种基因均呈下调趋势，其中Cyp19a1基因在1.85×104 3.7×104 Bq/ml活度浓度组出现显著下调(q=8.64、11.04，P＜0.05)；Fshr基因在3.7×103 Bq/ml活度浓度组出现显著下调(q=6.30，P＜0.05)；Lhr基因在各活度浓度组均与对照组相比，差异均有统计学意义(q=5.84、6.45、7.36、8.04，P＜0.05)，各组间差异无统计学意义(P＞0.05)。结果说明HTO亚慢性暴露会影响相关生殖基因的表达。
讨论随着核能的大力发展，氚排放量不断增加，且氚在环境中具有极强的迁移能力，使得大家越来越重视氚的生物学效应，其中非人类物种的辐射防护受到了更多的关注。2021年，国际放射防护委员会(ICRP)出版的《参考动物和植物的辐射权重》(ICRP 148号出版物[15])，探讨了氚对非人类物种的生物效应影响。目前氚对水生生物的生物效应影响研究大多集中在生命早期阶段[13, 16]，该生长阶段对辐射最为敏感，大多研究仅讨论急性暴露情况，忽略了氚的慢性或亚慢性暴露影响。若发生核事故大概率会出现相对较高剂量和较高剂量率的急性暴露，随着时间变化以及在海洋的稀释作用下，氚活度浓度会出现一定的下降，在该时段内的慢性及亚慢性暴露影响不可忽视。
生殖功能是对辐射最敏感的生物功能之一，并且在低于引起死亡剂量的10% 的剂量下即可受到损害。在1 850~37 000 × 106 Bq/L活度浓度HTO暴露10 d后，青鳉鱼鱼苗中生殖细胞存活率随氚剂量呈指数下降，雌性生殖细胞比雄性生殖细胞对辐射更敏感[17]。根据其他环境污染物及化学污染物等对成年斑马鱼生殖系统的影响研究[14, 18]，本研究确定了将HTO不同活度浓度亚慢性暴露后的产卵量、性腺指数(GSI)、组织学观察、性激素以及卵巢发育相关基因表达水平作为生物学终点，观察氚亚慢性暴露对成年斑马鱼的雌性生殖毒性。
本研究发现，在3.7×102 Bq/ml活度浓度HTO暴露时，其卵巢的氚生物富集系数较其他几个活度浓度组较低，其他3个暴露组卵巢的氚生物富集系数保持相对稳定。针对该现象可能的原因：①在低活度浓度的HTO暴露下，成年雌鱼卵巢主要通过被动扩散吸收氚，扩散速率与HTO浓度梯度成正比，外界氚浓度较低，与卵母细胞内氚的浓度梯度较小，使得生物体内氚的积累有限，从而使得生物富集系数较低，这与Shibata团队的考虑相同[9]。②低活度浓度时，进入卵母细胞的氚含量有限，氚在细胞内参与代谢过程的程度较低，摄入与排泄速率接近平衡，净积累量低。③成年雌鱼性腺在低活度浓度HTO暴露后，其自身生理功能未受到显著干扰，细胞对于氚的吸收和积累未因生理功能的紊乱而异常增加，高浓度氚可能通过同位素效应干扰氢参与的生化反应[19]。
本研究结果表明，HTO亚慢性暴露显著降低了成年雌性斑马鱼的产卵量，并导致卵母细胞发育异常。在先前对于青鳉鱼的HTO暴露研究中，也发现了照射后的鱼卵数量减少、生长迟缓和畸形等情况[20]。这些结果提示，氚可导致卵巢发育受限并干扰卵巢功能，进而影响水生生物生殖能力。考虑氚暴露引起下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)内分泌异常、卵巢发育停滞、雌激素合成受抑制，导致卵母细胞卵黄沉积不足，成熟卵泡比例降低，从而导致产卵量下降。
本研究中，在HTO亚慢性暴露后，成年雌性斑马鱼体内的E2、VTG和T性激素均出现一定程度的下降。同时HPG轴相关基因(Fshr、Lhr和Cyp19a1)也出现下调。Cyp19a1基因可以催化睾酮、雄烯二酮不可逆地转化为雌激素，是雌激素合成过程中的关键酮和限速酶[21]；Fshr基因为Fsh卵泡刺激素受体，卵黄形成主要受Fsh控制；Lhr基因为Lh黄体生成素受体，卵母细胞成熟主要受Lh控制[22]。考虑氚可能通过干扰HPG轴相关基因或直接作用于性腺，从而影响E2、FSH、LH等关键生殖激素的合成或信号传导，破坏鱼类体内类固醇激素的平衡，导致闭锁卵泡数目增加，对卵母细胞发育及生殖功能产生不利影响[23]。
对各阶段卵母细胞的高表达水平的基因：Figla基因表达局限于初级生长阶段的卵母细胞，主要参与卵泡的形成[24]；Zar1基因可以在初级阶段卵母细胞、皮质肺泡期卵母细胞中特异性表达，可调节聚腺苷酸化和雌激素合成，在卵巢的发育和卵子发生过程起重要作用[25]；Ar基因在皮质肺泡期卵母细胞及卵黄发生期卵母细胞中特异表达，用以维持卵巢功能[26]；Ptgs2a基因在成熟和排卵阶段卵母细胞中达到峰值，是斑马鱼排卵过程必需基因[27]。基因表达水平结果结合组织切片结果说明，氚亚慢性暴露会影响卵巢的发育并可阻滞斑马鱼卵母细胞发育。
本研究发现HTO亚慢性暴露对于成年雌性斑马鱼有一定的生殖毒性，其损伤效应表现在生殖功能、器官发育、组织细胞发育以及生物大分子各个层面。因此，HTO亚慢性暴露的危害不可忽视，即使在放射性相对不敏感的成年阶段也会产生一定的生殖损伤，其生殖损伤的机制以及遗传毒性还待进一步研究及探索。
利益冲突 无
作者贡献声明 高晓童负责实验设计和实施、数据采集和分析、论文撰写；王天姿、朱巧巧负责协助实验实施并采集数据；薛惠元负责技术支持；许文星负责部分统计分析；崔凤梅、陈娜、孙亮、涂彧指导论文修改
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