胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)是恶性程度最高的神经系统肿瘤，约占恶性中枢神经系统原发肿瘤的48.6%^[1]。尽管采用了手术切除、替莫唑胺(temozolomide, TMZ)化疗和放疗的标准治疗，GBM患者的中位生存期仍＜15个月，肿瘤复发大多集中在治疗后的6~9个月^[2]。放射抵抗是导致复发的主要原因^[3]，克服GBM放射抗拒是提高患者局部控制和远期生存的关键。B7同源物3(B7-H3，又名CD276)是B7家族重要的免疫检查点分子，在多种恶性肿瘤中高表达并与不良预后相关^[4-5]，在放射抵抗中的潜在作用逐渐引起关注。研究表明，B7-H3可通过促进上皮-间质转化、介导免疫逃逸等途径，直接参与肿瘤的进展与治疗抵抗^[6]。在结直肠癌与胃癌中，B7-H3已被证实可通过激活特定信号通路直接诱导放射抵抗^[7-8]。前期临床研究发现，B7-H3与GBM预后相关^[9]，而B7-H3是否直接调控肿瘤细胞的放射敏感性，以及其介导辐射抵抗的分子机制的科学问题尚未阐明。本研究初步探讨B7-H3对GBM放疗抵抗的调控作用及潜在机制，为提高GBM放疗疗效提供新靶点。

1.细胞主要试剂及仪器：人胶质瘤细胞系U251(中国科学院上海细胞库)；DMEM高糖培养液、胎牛血清和双抗(上海逍鹏生物公司)；Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)；RNA提取、反转录及q-PCR试剂盒(长沙艾科瑞公司)；Annexin V-APC/PI凋亡试剂盒(南京凯基公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁公司)；Matrigel基质胶和Transwell小室(美国Corning公司)；实验用抗体(武汉三鹰公司)。6 MV X射线直线加速器(美国Varian公司)。

2.细胞培养与处理：U251细胞使用含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM高糖培养基于37℃、5% CO₂培养，每2~3天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。细胞照射：设定照射野15 cm × 15 cm，培养皿下垫1 cm硅胶垫，源靶距(SSD)为100 cm，剂量率600 cGy/min。

3.慢病毒包装与稳转细胞株构建：将慢病毒载体与包装质粒共转染293 T细胞，收集48 ~ 72 h病毒上清测定滴度。U251细胞接种于6 cm培养皿，待融合度达70%时加病毒液及聚凝胺，24 h后换液。4 d后加嘌呤霉素2 μg/ml筛选。实验分为过表达组、敲低组(sh-B7-H3-1、sh-B7-H3-2)、空载对照组及空白对照组。sh-B7-H3-1序列：5′TGGTGCACAGTTTCACCGA3′；sh-B7-H3-2序列：5′TGAAACACTCTGACAGCAA3′。

4.实时荧光定量PCR(q-PCR)：提取总RNA并反转录。采用SYBR Green法扩增。B7-H3引物：上游5′CTGGCTTTCGTGTGCTGGAGAA3′，下游5′GCTGTCAGAGTGTTTCAGAGGC3′；内参β-肌动蛋白引物：上游5′TGGCACCCAGCACAATGAA3′，下游5′CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA3′。反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。采用2^-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

5.Western blot：使用放射免疫沉淀裂解液(RIPA)提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂牛奶封闭，分别加入B7-H3抗体(1 ∶2 000)及内参β-tubulin抗体(1 ∶5 000)，4℃孵育过夜。洗膜后加入相应二抗(1 ∶5 000)，室温孵育1 h，电化学发光显影，ImageJ软件进行灰度值分析。将各组细胞照射10 Gy后，继续培养24 ~ 48 h，提取细胞蛋白，按上述方法检测p-STAT3 (1 ∶1 000)、STAT3 (1 ∶2 000)、Cleaved-Caspase-3 (1 ∶1 000)表达水平。

6.克隆形成实验：收集处于对数生长期的U251细胞，经胰酶消化制备成单细胞悬液，以2 000个/孔的密度接种于6孔板中，贴壁后分别照射0、2、4、6、8 Gy。继续培养7 ~ 14 d，至可见细胞克隆形成。4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，计数含50个细胞以上的集落数。按以下公式计算相关参数：克隆形成率(plating efficiency, PE)=克隆形成数/接种细胞数×100%，细胞存活分数(survival fraction, SF)=克隆形成数/(实验组细胞数×PE)，放射增敏比(sensitizer enhancement ratio, SER)=对照组D₀ /实验组D₀。应用GraphPad Prism 7.0软件，以单击多靶模型SF= 1- (1-e^-kD) N拟合细胞存活曲线，得出D₀、D_q和SF₂等放射生物学参数，计算放射增敏比(SER_D0)。

7.细胞增殖检测：将各组细胞以4×10³/孔接种于96孔板，过夜孵育后，照射10 Gy后继续培养0、24、48、72、96 h。吸弃培养基，每孔加入配置好的CCK-8试剂110 μl(DMEM: CCK-8试剂=10 ∶1)，孵育2 h后测定酶标仪450 nm波长下的吸光度(A)值。细胞抑制率按公式计算：细胞抑制率=[(A_对照-A_实验)/ (A_对照-A_空白)]×100%。

8.流式细胞术：10 Gy照射处理后的细胞培养48 h，使用不含EDTA的胰酶消化收集。所得细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两遍(离心条件：350 ×g，5 min)，随后将5×10⁵个细胞悬于500 μl结合缓冲液中。先后加入5 μl Annexin V-APC与5 μl碘化丙啶(PI)染色液，混匀后置于室温环境下避光反应10 min后上机检测。

9.细胞侵袭实验：照射10 Gy后的各组细胞用无血清培养基重悬为5 × 10⁴ /ml细胞悬液。Transwell上室预先涂覆Matrigel基质胶(与无血清培养基按1∶8混合)，下室加入含20%血清的培养基700 μl。上室每孔加入200 μl细胞悬液，培养48 h后，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下随机选取视野计数穿膜细胞数。

10.统计学处理：所有数据均通过SPSS 26.0进行处理。符合正态分布的连续变量以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验(两组)或单因素方差分析(多组)。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.Western blot和q-PCR结果：成功构建B7-H3过表达和敲低细胞模型，并设立空载对照组(图 1)。过表达组B7-H3蛋白表达水平高于空载对照组(t = 5.21, P ＜0.01)，敲低组B7-H3蛋白表达低于空载对照组(t = 7.61、7.24，P＜0.01)，而空载对照组与空白对照组B7-H3蛋白表达差异无统计学意义(P > 0.05)。q-PCR检测进一步证实了mRNA表达差异有统计学意义(t = 5.21、7.61、7.24、9.86、4.76、4.48, P＜0.01)，且B7-H3-1组抑制效率更高，因此，选取敲低B7-H3-1作为敲低组进行后续实验。

注：1.过表达组；2.空载对照组；3.空白对照组；4.敲低B7-H3-1组；5.敲低B7-H3-2组。a与空载对照组相比，t = 5.21、7.61、7.24、9.86、4.76、4.48, P＜0.01 图 1 U251细胞转染后B7-H3蛋白及mRNA表达情况   A. Western blot电泳图；B. 蛋白及mRNA相对表达量 Figure 1 Expression of B7-H3 protein and mRNA in U251 cells after lentiviral transfection   A. Western blot electrophoresis image; B. Relative quantification of protein and mRNA expression

2.克隆形成实验结果：与空载对照组相比，过表达组的存活曲线上移、肩区增宽，表现出辐射抵抗性；敲低组的存活曲线下移、肩区缩窄，表现出辐射增敏性。根据拟合的存活曲线参数计算，过表达组相较于空载对照组的放射增敏比(SER)为0.88；敲低组SER为1.30(表 1，图 2)。

表 1(Table 1)

表 1 U251细胞不同组存活曲线的相关参数 Table 1 The main parameters of survival curves for different groups of U251 cells 组别 k N D0 Dq SF2 SER 过表达组a 0.43 2.16 2.35 1.81 0.70 0.88 空载对照组 0.48 1.94 2.07 1.37 0.60 1.00 敲低组b 0.63 2.21 1.59 1.19 0.49 1.30 注：k.存活曲线斜率；N.细胞内靶的个数；D0.平均致死剂量；Dq.准阈剂量；SF2.单次照射2 Gy的存活分数

表 1 U251细胞不同组存活曲线的相关参数 Table 1 The main parameters of survival curves for different groups of U251 cells

注：a与空载对照组相比，t = 5.42、7.69、6.18、5.58, P＜0.01；b与空载对照组相比，t = 9.39、15.09、12.85、9.95, P＜0.01 图 2 B7-H3对U251细胞放射增敏性的影响 Figure 2 The effect of B7-H3 on the radiosensitivity of U251 cells

3.细胞增殖实验：照射处理后的相同时间点，自24 h起，不同组间细胞增殖能力差异有统计学意义(F = 25.38、96.88、165.41、31.75, P＜0.01)。该结果表明，B7-H3可降低射线对细胞增殖的抑制作用(图 3)。

注：24~96 h 3组间比较，F = 25.38、96.88、165.41、31.75, P ＜0.01 图 3 X射线对不同B7-H3表达水平U251细胞增殖活力的影响 Figure 3 Effect of irradiation on proliferative viability of U251 cells with different B7-H3 expression levels

4.细胞侵袭实验：B7-H3促进U251细胞辐射后的侵袭。与空载对照组相比，过表达组的穿膜细胞数显著增加(t = 4.87, P＜0.01)；相反，敲低组的穿膜细胞数减少(t = 15.14, P＜0.01，图 4)。

图 4 不同B7-H3表达水平U251细胞的侵袭能力检测(Transwell法)结晶紫染色 ×10    A. 过表达组；B. 空载对照组；C. 敲低组 Figure 4 Detection of the invasive ability of U251 cells with different B7-H3 expression levels (Transwell assay) Crystal violet staining ×10   A. Overexpression group; B. Empty vector control group; C. Knockdown group

5.流式细胞术检测凋亡：与空载对照组相比，过表达组的细胞照射后总凋亡率显著降低(t = 5.75, P＜0.01)；相反，敲低组的细胞凋亡率升高(t = 5.23, P ＜0.01，图 5)。

注：1.空载对照组；2.过表达+照射组；3.空载对照+照射组；4.敲低+照射组。a与空载对照组相比，t = 6.84, P＜0.01；b与空载对照+照射组相比，t = 5.75、5.23，P＜0.01 图 5 流式细胞术检测B7-H3对辐射诱导U251细胞凋亡的影响 Figure 5 Effect of B7-H3 on radiation-induced apoptosis in U251 cells detected by flow cytometry

6.Western blot实验：10 Gy照射后，U251细胞中B7-H3蛋白水平上升(t = 5.57, P＜0.01)。进一步分析表明，B7-H3正向调控STAT3的活化并负向调控细胞凋亡。过表达B7-H3显著促进了STAT3的磷酸化(t = 9.97, P＜0.01)，并抑制了Cleaved-Caspase-3的产生(t = 6.64, P＜0.01)；而敲低B7-H3则导致p-STAT3水平降低(t = 10.64, P＜0.01)及Cleaved-Caspase-3水平升高(t = 7.50, P＜0.01)，各组STAT3总蛋白差异无统计学意义(P > 0.05)。结果提示，辐射诱导B7-H3升高，可能通过激活STAT3信号通路抑制了凋亡基因Caspase-3活化，从而介导辐射抵抗(图 6)。

注：1.过表达组；2.空载对照组；3.空白对照组；4.敲低组。U251与U251+RT(10 Gy)相比，tB7-H3 = 5.57，P＜0.01；a与空载对照组相比，tp-STAT3 = 9.97、10.64, tCleaved-Caspase-3 = 6.64、7.49，P ＜0.01；b与空白对照组相比，tp-STAT3 = 8.75、8.91, tCleaved-Caspase-3 = 6.89、7.22, P ＜0.01 图 6 辐射诱导的B7-H3在STAT3活化及凋亡调控中的作用  A. B7-H3表达；B. p-STAT3、STAT3及Cleaved-Caspase-3表达 Figure 6 Role of radiation-induced B7-H3 in STAT3 activation and apoptosis  A. B7-H3 expression; B. Expression of p-STAT3, STAT3, and Cleaved-Caspase-3

GBM是颅内最常见的恶性肿瘤，由于高致残率、高致死率，严重危害人类健康。目前，GBM的标准治疗方法是手术联合术后同步放化疗和辅助化疗^[10]。尽管微创手术技术有了很大的进步，但由于肿瘤位置的限制，很难完整切除，术后放疗成为GBM提高局部控制和生存的重要辅助治疗^[3]。即使适形调强放疗和替莫唑胺化疗的应用，GBM的5年总生存率仍然只有9.8%^[11]。这是因为GBM放射敏感性差，术后肿瘤区供血和供氧不足，导致GBM放射治疗效果不尽如人意。此外，大脑是辐射的剂量限制器官，所以很难通过增加辐射剂量来加强对肿瘤的局部控制。因此，如何提高GBM的放射敏感性，寻找影响GBM放射敏感性的分子标志物具有重要的临床意义。

B7-H3作为B7免疫共刺激分子家族的重要成员^[12-13]，近年来在肿瘤研究领域备受关注。多项研究表明，B7-H3在包括胶质母细胞瘤在内的多种恶性肿瘤中异常高表达，且其高表达与患者的不良预后显著相关^{[4-5, 9]}。在GBM中，B7-H3的表达水平明显高于正常脑组织，并与肿瘤的高级别、侵袭性生长及术后快速复发等临床特征密切相关^[14]。研究发现，B7-H3不仅可以通过调控T细胞功能介导肿瘤免疫逃逸，还通过非免疫依赖的机制促进肿瘤增殖、转移和治疗抵抗^[15]，特别是在放射抵抗方面，已有研究发现，B7-H3可通过激活ERK1/2等信号通路在结直肠癌、胃癌等实体瘤中介导放射抵抗^[7-8]。但B7-H3在GBM放射敏感性调控中的作用及其机制尚未得到系统阐明。本研究通过构建B7-H3表达差异的GBM细胞模型，结合功能学实验与分子机制探索，明确B7-H3对GBM放射敏感性的调控效应及其与STAT3信号通路的相关性。

本研究发现，X射线照射可反馈性上调GBM细胞中B7-H3的蛋白表达水平。这一现象提示，在临床放疗过程中，常规放疗可能在杀伤肿瘤细胞的同时，正向筛选或诱导B7-H3高表达的细胞亚群，这些细胞凭借其固有的放射抵抗特性在治疗压力下存活并增殖，从而形成“治疗抵抗-靶点上调”的恶性循环，这为理解GBM放疗后快速复发提供了新的解释。

通过多维度功能实验，本研究系统验证了B7-H3在GBM放射敏感性调控中的核心作用。克隆形成实验显示，B7-H3敲低可显著降低细胞存活分数，增敏比最高达1.30；而其过表达则明显诱导放射抵抗。这一发现在其他功能实验中得到进一步验证：CCK-8实验显示，敲低B7-H3增强了辐射对细胞增殖的抑制作用；Transwell实验表明，B7-H3过表达促进辐射后细胞的侵袭能力；流式细胞术分析则证实敲低B7-H3显著提高了辐射诱导的细胞凋亡率。由此表明B7-H3是GBM放射敏感性的关键负向调控因子。

机制研究显示，B7-H3过表达导致STAT3磷酸化水平显著升高，同时伴随Cleaved-Caspase-3蛋白表达降低。STAT3作为细胞内重要的信号转导与转录激活因子，其持续活化可通过多种机制促进肿瘤细胞存活^[16]。一方面，活化的STAT3进入细胞核后，可上调Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等多种抗凋亡蛋白的表达^[17]；另一方面，B7-H3还能促进DNA损伤修复相关基因的转录，增强肿瘤细胞对基因毒性应激的抵抗能力^[4]，本研究结果与其相一致。B7-H3可能通过激活STAT3信号通路，同时从抑制凋亡和增强修复两个层面协同介导放射抵抗。

此外，本研究发现B7-H3过表达能显著促进辐射后细胞的侵袭能力，与温丰标等^[18]报道的B7-H3通过激活PI3K/Akt通路诱导上皮-间质转化(EMT)的结果一致。值得注意的是，EMT不仅与肿瘤侵袭转移相关，越来越多的证据表明，其与治疗抵抗也密切相关。发生EMT的肿瘤细胞通常表现出更强的抗凋亡能力和干细胞特性，这些特征都可能共同贡献于放射抵抗表型。

综上所述，本研究通过细胞实验证实，B7-H3在GBM中具有诱导放射抵抗、抑制凋亡、促进增殖与侵袭的多重生物学效应，初步揭示其可能通过激活STAT3信号通路、抑制Cleaved-Caspase-3的表达来介导放射抵抗。这些发现深化了对GBM放射抵抗机制的理解，并为探索相关联合治疗策略提供了理论依据。

利益冲突  无

作者贡献声明  巴晓琰负责实验与论文撰写；李书艳协助实验实施；郑珂参与细胞实验；黄蓉和孙学明协助查找资料和论文修改；吴慧指导研究设计及论文修改