2026, Vol. 46
细胞衰老是指细胞增殖分化能力和生理功能随时间逐渐发生衰退的过程，主要特征为持久性细胞周期阻滞和促炎状态[1-2]。电离辐射作为一种应激源，可通过DNA损伤和氧化损伤诱导细胞发生衰老。p21和p16是细胞周期蛋白依赖的激酶抑制剂，作为细胞周期进程的负调控因子，在细胞周期阻滞过程中发挥作用[3]。衰老相关分泌表型(senescence associated secretory phenotype, SASP)的主要成分包括促炎细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶等[4]。有研究表明，p62/GATA4参与SASP的发生与调控[5]，但具体机制尚不清楚。
内皮细胞作为对辐射较为敏感的细胞类型，是放射治疗过程中血管损伤的关键靶细胞[7]。目前，关于高剂量电离辐射诱导血管内皮细胞发生衰老相关机制研究较多[8-9]。然而，低、中等剂量(＜5 Gy)电离辐射诱导血管内皮细胞发生衰老的作用尚不明确。本研究探索中、低剂量X射线对人脐静脉内皮细胞衰老的影响及相关机制，并在体内验证X射线对心脏组织衰老相关通路的调控，为预防和治疗电离辐射诱导的心血管疾病提供理论基础。
材料与方法1.试剂与仪器：DMEM基础培养基、青霉素-链霉素溶液购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国GIBCO公司；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；细胞蛋白提取液、蛋白定量试剂盒和化学发光底物均购自美国Thermo Fisher公司；磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂购自瑞士Roche公司；5×蛋白上样缓冲液购自北京鼎国生物公司；p16、p62蛋白抗体购自英国Abcam公司；GATA4抗体购自美国Cell Signal公司；GAPDH、山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗抗体及SYBR Green qPCR mix购自北京中杉金桥公司；反转录试剂盒购自日本东洋纺公司；RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技公司；ChemiDoc型多功能成像系统为美国Bio-Rad公司产品；7500 Fast实时荧光定量PCR仪购自美国Thermo Fisher公司；照射仪器使用火箭军特色医学中心X射线辐照仪(美国KUBTEC公司，型号XCELL 225)。
2.细胞培养、实验动物及照射条件：人脐静脉内皮细胞系EA.hy926购自中国协和细胞库，培养于含10%胎牛血清，1%双抗的DMEM高糖培养液中，37℃，5% CO2饱和湿度培养箱培养。待细胞融合至90%传代，隔日换液。根据照射剂量，将细胞分为0、0.188、0.375、0.75、2和4 Gy组。野生型C57BL/6J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK [京] 2021-0006)；野生型C57BL/6J小鼠6~8周龄，体重18~20 g，共18只，雌雄各半，用随机数法分为0、2和4 Gy组，每组6只。所有小鼠在无菌屏障环境中，温度(25±1)℃，湿度40%~60%，噪声＜60 dB，明暗交替时间为12 h/12 h。细胞及小鼠均为225 kV X射线照射，小鼠为全身照射。源皮距均为100 cm，剂量率为1.79 mGy/s。
3.CCK-8实验：细胞照射后24、48和72 h分别使用CCK-8试剂盒，每孔细胞中加入10 μl CCK-8溶液，在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养0.5 h，用酶标仪在450 nm处测量吸光度(A)值。
4. β-半乳糖苷酶染色：按照β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书，在每孔细胞中加入1 ml固定液，室温下固定15 min。磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次。在每孔中加入1 ml配制好的染色工作液后，放置于无CO2、37℃孵箱，孵育过夜。用倒置相差显微镜观察并随机选取5个视野拍照。用Image J (V1.5.4F)分析阳性细胞数所占比例。
5. Western blot实验：提取细胞及小鼠心脏组织的全蛋白，采用BCA法进行浓度定量，用5×上样缓冲液混匀后，于100℃金属浴煮10 min，变性后蛋白进行蛋白印迹实验。每组取30 μg蛋白进行12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳条件为80 V 30 min，120 V 60 min。转膜条件为300 mA 60 min。将蛋白转移至硝酸纤维素膜后，5%脱脂奶粉封闭1 h，p21、p16、p62、GATA4蛋白和GAPDH蛋白一抗(1∶1 000)4℃孵育过夜，二抗(1∶3 000)孵育1 h后，通过增强化学发光液使用ChemiDocXRC+成像系统显影拍照，用ImageJ(V1.5.4F)对条带进行分析。
6. 实时荧光定量PCR：使用试剂盒提取细胞RNA，使用分光光度计测量RNA浓度和纯度。取100 ng RNA使用反转录试剂盒合成cDNA，反应体系20 μl。反转录为cDNA后采用SYBR Green实时荧光定量PCR方法用实时荧光定量PCR仪进行检测。取1 μl cDNA模板在20 μl的反应体系中进行PCR反应，反应条件为：95℃ 30 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，40个循环。引物序列如表 1所示。
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表 1 引物序列列表 Table 1 List of primer sequences |
7. 统计学处理：采用SPSS 24.0统计软件进行数据处理，采用Graphpad Prism 8.0软件作图。数据符合正态分布，经方差齐性检验后用单因素方差分析进行多组间比较，事后两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
结果1. 不同剂量X射线照射对EA.hy926细胞增殖的影响：结果如图 1所示，0.375和0.75 Gy X射线照射后24 h，细胞A值与0 Gy组相比显著降低(t=5.61、8.04，P＜0.05)；照射后48 h，0.375、0.75、2和4 Gy组A值与0 Gy组相比显著降低(t=6.07~17.10，P＜0.05)；照射后72 h，0.188和0.375 Gy组的A值与0 Gy组相比显著增高(t=5.52、6.24，P＜0.05)，而2和4 Gy组的A值与0 Gy组相比显著降低(t=4.18、3.39，P＜0.001)。该结果表明，细胞增殖能力与受照剂量和时间相关，0.188 Gy组和0.375 Gy组在后期表现出促进细胞增殖的效应，而2和4 Gy照射则显著抑制细胞增殖。
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注：a与0 Gy相比，t=3.39~17.10，P＜0.05 图 1 不同剂量X射线照射后不同时间对EA.hy926细胞增殖的影响 Figure 1 Effect of different doses of X-ray irradiation at different time on the proliferation of EA.hy926 cells |
2. 不同剂量X射线照射对细胞EA.hy926衰老标志物β-半乳糖苷酶(SA-β-gal) 活性的影响：如图 2所示，0 Gy组细胞β-半乳糖苷酶染色较浅且数量较少，照射组细胞β-半乳糖苷酶染色深度随着剂量升高而增加。0~4 Gy X射线照射后72 h，细胞β-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例分别为7.41%、12.08%、9.33%、10.21%、15.98%和40.36%。2和4 Gy组与0 Gy组相比显著增加(t=12.34、11.49，P＜0.05)。该结果表明，2和4 Gy X射线照射后EA.hy926细胞衰老比例较0 Gy组显著增加。
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图 2 不同剂量X射线照射对EA.hy926细胞衰老的影响 β-半乳糖苷酶染色 ×100 A. 0 Gy；B. 0.188 Gy；C. 0.375 Gy；D. 0.75 Gy；E. 2 Gy；F. 4 Gy Figure 2 β-galactosidase staining of premature senescence in EA.hy926 after X-ray irradiation ×100 A. 0 Gy; B. 0.188 Gy; C. 0.375 Gy; D. 0.75 Gy; E. 2 Gy; F. 4 Gy |
3. 不同剂量X射线照射对细胞衰老标志蛋白p21、p16表达的影响：如图 3所示，照后72 h, 0.75、2和4 Gy组p21蛋白相对表达量分别为1.302、1.303和1.284，与0 Gy组(1.000)相比显著升高(t=12.66、14.34、17.54，P﹤0.05)。2和4 Gy X射线照后7 d，p21蛋白和p16蛋白相对表达量分别为1.238和1.755，与0 Gy组(1.000)相比显著升高(t=3.48、23.58，P﹤0.05)。该结果表明2和4 Gy X射线照射后EA.hy926细胞衰老比例较对照组显著增加。
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注：与0 Gy相比，F=19.93，P ＜0.05 图 3 不同剂量X射线照射EA.hy926细胞72 h(A)和7 d(B)后对衰老标志蛋白p21、p16表达的影响 Figure 3 Effects of different doses of X-ray irradiation on the expression of aging marker proteins p21 and p16 in EA.hy926 cells after 72 h (A) and 7 d (B) of irradiation |
4. 不同剂量X射线照射对细胞p62和GATA4蛋白表达的影响：结果如图 4所示，0.375、0.75、2和4 Gy组的蛋白表达量分别为0.628、0.589、0.467和0.289，与0 Gy组相比, p62蛋白表达量显著降低(t=9.88~51.12，P＜0.05)，GATA4蛋白相对表达量分别为2.100、2.946、2.850和1.622，与0 Gy组(1.000)相比显著增加(t=7.10~25.91，P＜0.05)。该结果表明0.375、0.75、2和4 Gy X射线照射人脐静脉内皮细胞后，p62蛋白表达显著下降，同时GATA4蛋白表达显著增加。
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图 4 不同剂量X射线照射EA.hy926细胞后72 h对p62和GATA4表达的影响 Figure 4 Effects of different doses of X-ray irradiation on p62 and GATA4 expression in EA.hy926 cells after 72 h |
5.不同剂量X射线照射对C57BL/6J小鼠心脏组织衰老标志蛋白p21和p62/GATA4衰老信号通路表达的影响：2和4 Gy X射线全身照射小鼠后1个月，采用Western blot检测小鼠心脏组织中p21、p62和GATA4的表达变化。结果如图 5所示，与0 Gy组相比，2和4 Gy照射后，小鼠心脏组织衰老标志蛋白p21的相对表达量分别为0.461和1.226，与0 Gy组(0.164)相比显著增加(t=8.21、12.13，P＜0.05)。此外，2和4 Gy组p62蛋白相对表达量分别为0.411和0.439，与0 Gy组(0.164)相比显著降低(t=11.16、7.46，P＜0.05)，GATA4蛋白相对表达量分别为1.420和1.561，与0 Gy组(0.321)相比显著增加(t=13.66、8.61，P＜0.05)。该结果与体外X射线照射人脐静脉内皮细胞结果相一致，说明X射线照射诱导小鼠心脏组织衰老标志蛋白和p62/GATA4通路表达增加。
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图 5 不同剂量X射线照射后1个月对p21，p62和GATA4表达的影响 Figure 5 Effects of different doses of X-ray irradiation on the expression of p21, p62, and GATA4 in mice at 1 month post-irradiation |
6.不同剂量X射线照射对细胞SASP因子IL-33、IFIT-1、IFI-44基因表达水平的影响：结果如表 2所示，在不同剂量X射线照射后72 h，2和4 Gy组IL-33 mRNA相对表达量分别为1.869和1.853，与0 Gy组相比显著增加(t=28.98、21.17，P＜0.05)；0.375、0.75、2和4 Gy组IFIT-1 mRNA相对表达量，与0 Gy组相比显著增加(t=46.40~62.87，P＜0.05)；0.75、2和4 Gy组IFI-44 mRNA相对表达量与0 Gy组相比显著增加(t=11.4、11.28、22.07，P＜0.05)。
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表 2 不同剂量X射线照射后72 h SASP mRNA表达水平变化 Table 2 Changes of SASP factor gene expression levels in EA.hy926 at 72 h after X-ray irradiation |
讨论
内皮细胞对电离辐射相对敏感，电离辐射诱导的血管内皮损伤是胸部放疗相关心血管疾病的核心病理基础。流行病学研究表明，胸部放疗会增加心血管疾病的风险。研究报道，乳腺癌、肺癌、食管癌等胸部癌症患者接受胸部放疗后会出现不良反应[1-4]。胸部受到照射的剂量与心血管疾病患病风险的增加之间存在显著的关联性[5-6]。研究表明，血管损伤和内皮功能障碍在辐射诱导的心血管疾病的发病机制中具有关键作用[7, 10]。电离辐射造成血管内皮功能损伤的机制是通过引起DNA损伤、氧化应激和炎性激活等早期损伤事件，最后诱导细胞凋亡及细胞衰老[11-12]。电离辐射诱发内皮的炎症损伤和凋亡作用已被广泛研究[13-15]。而在放疗诱导的心血管疾病中，关于辐射后内皮细胞衰老的作用和机制报道较少。
研究表明，0.5~10 Gy的电离辐射主要诱导内皮细胞发生衰老，而对辐射诱导的细胞凋亡具有抵抗力[16]，但关于衰老及其作用机制尚未阐明。本研究对不同剂量X射线照射诱导血管内皮细胞导致的衰老进行了探索，发现0.375、0.75、2和4 Gy X射线可诱导人脐静脉内皮细胞发生细胞衰老，诱导细胞分泌SASP，并激活人脐静脉内皮细胞p62/GATA4衰老相关通路，同时2和4 Gy的X射线全身照射小鼠后可诱导小鼠心脏组织中p62/GATA4衰老相关通路的激活。
现有研究指出，电离辐射诱导细胞衰老主要表现为不可逆的细胞周期阻滞，以及持续的衰老相关分泌表型。Gabriels等[10]研究表明，0、4、6、8和12 Gy 60Co照射PCa细胞后，细胞增殖能力与辐射剂量呈负相关。另有研究证明，0~15 Gy γ射线照射AHH-1细胞24~72 h后，细胞活力降低[11]。本研究对不同剂量电离辐射对细胞增殖的影响进行检测，得出的结论与上述研究结果一致，均证明不同剂量X射线可以抑制细胞的增殖能力。许多研究表明，哺乳动物细胞在体内和体外接受低剂量辐射照射后，会发生适应性保护反应。适应性保护预防和修复DNA损伤并引发免疫刺激，它的发生延迟数小时，可持续数天至数月，在剂量0.1~0.2 Gy时稳定下降，在超过约0.5 Gy的急性照射后下降稳定趋势消失。但本实验结果观察到照射后72 h，0.188和0.375 Gy照射促进细胞增殖，与以往结论稍有不同。其可能原因是低剂量辐射适应性保护反应是否发生取决于细胞类型和组织的代谢状态，以及射线种类等。同时低剂量与低剂量率反应呈非线性相关，预测低剂量电离辐射诱导对生物健康风险评估的影响仍然困难，需要具体分析[12-14]。Chen等[15]的研究证明小鼠接受20 Gy肺部辐照可引起内皮细胞衰老比例增加，p16表达增加。本研究对不同剂量电离辐射诱导细胞衰老的比例进行检测，实验结果表明，2和4 Gy X射线照射EA.hy926细胞后，细胞衰老比例增加。
目前关于衰老的研究涉及多条信号通路。研究发现，p62蛋白在细胞衰老过程中发挥着重要作用[16-18]。在秀丽隐杆线虫模型中过表达p62蛋白使其寿命延长[19]。p62基因敲除小鼠则表现出寿命缩短和衰老加速[20]。在主动脉血管细胞模型中，Salazar等[21]发现，p62敲低的血管平滑肌细胞在衰老诱变剂作用下，与对照组相比，p21蛋白表达增加，β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数增加。在成纤维细胞模型中，Kole等[5]的研究发现，GATA4蛋白通过逃脱p62蛋白的选择性自噬，激活细胞衰老相关分泌表型，在X射线诱导成纤维细胞衰老过程中发挥关键作用。与该报道类似，本研究发现0.375、0.75、2和4 Gy X射线照射人脐静脉内皮细胞后，p62蛋白表达显著下降，同时GATA4蛋白表达显著增加，以及SASP因子IL-33、IFIT-1和IFI-44表达增加，表明电离辐射激活了p62/GATA4衰老通路。这一发现可能为研究电离辐射诱导的心血管疾病发病机制提供新的思路，为找到关键的治疗靶点和制定更有效的辐射诱导的心血管疾病治疗策略提供理论基础。
本研究初步揭示了不同剂量X射线辐射对血管内皮细胞经典衰老标志物p16和p21表达的影响，以及p62/GATA4通路的调控作用。既往研究多聚焦DNA损伤反应(如ATM/ATR-p53轴)在内皮辐射衰老中的作用，本研究发现，0.375 Gy即可诱导血管内皮细胞种p62的抑制与GATA4的累积，该剂量远低于诱导p21/p16表达升高所需剂量(>2 Gy)。这提示GATA4通路可能对辐射敏感性可能优于经典衰老通路(p21和p16介导的通路)，这一发现为以后电离辐射诱导的血管内皮损伤的早期辐射敏感分子的研究提供了新的视角。但本研究仍存在以下局限性：首先，p62与GATA4在辐射诱导衰老中的上下游关系尚未完全明确，二者是否独立或协同调控下游SASP因子仍需进一步验证；其次，2和4 Gy对细胞死亡的潜在影响未系统分析，可能干扰对衰老表型的特异性解读；最后，p62/GATA4通路与SASP因子(IL-33、IFIT-1、IFI-44)的调控关系尚未通过功能实验直接证实。未来研究需结合基因敲降/过表达技术明确关键分子机制，并拓展多类型细胞模型以验证结论普适性，同时探索辐射诱导衰老中其他潜在调控因子(如NF-κB、mTOR)的交互作用，为靶向干预提供理论依据。
利益冲突 无
作者贡献声明 关子易、刘萌萌负责实验设计、实验操作、数据整理、撰写论文；高义哲、马丽萍、伊如罕、余南希负责论文修改；高玲指导实验设计和论文修改
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