2026, Vol. 46
2. 浙江省肿瘤医院放射物理科 中国科学院杭州医学研究所, 杭州 310022
2. Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou Institute of Medicine, Chinese Academy of Sciences, Hangzhou 310022, China
全球每年新诊断肺癌病例超过200万例，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占80% ~ 85%[1]。放射治疗是其主要的治疗方法之一。然而，无论采用何种放疗和剂量分割方法，都不可避免地出现辐射抵抗，导致放疗失败和局部复发。辐射抵抗的机制研究很多，目前尚无定论，但是所有肿瘤组织电离辐射后都会出现脂滴增加现象[2]。因此，讨论脂滴含量和辐射抗性的关系，对解释辐射抵抗的发生机制至关重要。
脂质代谢是癌症生物学中的重要调节机制，脂滴在应激抵抗和维持细胞稳态中有重要作用[3]。脂滴包被蛋白(perilipins，PLINs)是脂滴(lipid droplets，LDs)表面含量最多的一类参与脂质代谢调节的脂滴相关蛋白家族，参与LDs的形成、分解、代谢等生物学过程，不同的PLINs在LDs表面具有各自特异的组织分布特征、亚细胞位置、脂质结合特性等功能。其中，脂滴包被蛋白5(perilipin 5，PLIN5)在脂滴形成和脂质重塑中起重要作用[4]。PLIN5在脂肪酸氧化代谢程度较高的组织(如心脏、肝脏、骨骼肌)中表达丰富[5]。PLIN5的过量表达可以诱发脂滴组成蛋白的急剧招募，促进细胞内脂滴的形成。其中，PLIN5羧基末端399~463位氨基酸对于脂质形成和代谢相关蛋白招募是必需的[6]。尽管报道辐射引发的脂滴形成有助于辐射抵抗，然而，PLIN5对非小细胞肺癌细胞脂滴形成和电离辐射敏感性的影响鲜见报道。
本研究采用不同剂量X射线照射非小细胞肺癌细胞系，通过转录组学明确PLIN5在辐射应激后的表达，通过过表达和干扰表达PLIN5，探究细胞辐射敏感性、脂滴含量和PLIN5表达的关系，旨在阐明PLIN5在肿瘤细胞辐射抵抗中的潜在作用，为非小细胞肺癌放疗增敏提供潜在的解决方案。
材料与方法1. 主要材料与仪器：人非小细胞肺癌细胞A549和Calu-1购于美国ATCC细胞资源保藏中心。胎牛血清购自乌拉圭ExCell公司。青霉素、链霉素购自苏州博奥龙公司。DMEM购自上海VivaCell公司，CCK-8试剂盒、总RNA提取试剂盒、定量PCR检测试剂盒均购自南京Vazyme公司。反转录试剂盒购自泰州康为世纪公司。Lipo3000、BODIPY染料购自美国Invitrogene公司。生物学X射线辐照仪为美国Radsource公司RS-2000 Pro型号产品。共聚焦激光扫描显微镜为日本奥林巴斯FV3000公司产品。实时荧光定量PCR仪为美国ThermoFisher公司产品。
2. 细胞培养和照射：细胞采用含10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素的DMEM进行培养，并将细胞培养于37℃、含5% CO2的培养箱中。采用160 kV X射线照射细胞，照射剂量分别为0、2、8 Gy，吸收剂量率1.375 Gy/min，源靶距100 cm。通过添加油酸(50 μmol/L)及棕榈酸(100 μmol/L)混合溶液构建高量中性脂滴模型。
3. 转录组测序：给予A549细胞2 Gy X射线照射后24 h收集细胞，按照1×106个/ml TRIzol比例收集细胞裂解物，委托金唯智生物科技有限公司(苏州)进行有参转录组测序。使用DESeq2软件进行基因差异表达分析。差异表达基因筛选按照|fold change|≥1.5且Padj＜0.05设置阈值。随后，使用基因集富集分析(GSEA)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析对差异表达基因进行分析。
4. qRT-PCR检测：细胞在电离辐射或转染PLIN5过表达、siRNA后24 h，使用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，测量RNA浓度后，取1 μg RNA使用反转录试剂盒进行反转录获取cDNA，并使用高灵敏性染料法定量PCR检测试剂盒进行qRT-PCR。检测采用qRT-PCR仪，数据分析使用2-ΔΔct方法。所有的PCR产物通过GAPDH作为内参进行定量和归一化。引物序列为：GAPDH正向引物5’GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3’, 反向引物5’TGGTGAAGACGCCAGTGGA3’；PLIN5正向引物5’AGCCATGCTGTGGATGTTGT3’,反向引物5’CTCCTCTGATCCTCCACCGA3’。
5. 细胞转染：通过Lipo3000转染试剂将PLIN5 siRNA或构建到pCDNA3.1的PLIN5核心序列转染进入A549细胞中，转染24 h后通过qRT-PCR方法检测过表达和敲减效率。转染所需要的体系按照说明书进行。PLIN5小干扰RNA(siRNA)序列为：5’GGAUGUUGUACUGGAAAAAUC3’。
6. 细胞活力测定：将对数生长期A549细胞接种于30 mm的培养皿中，待细胞贴壁后，分别进行0和8 Gy X射线照射；照射后，以每孔3 000个细胞种于96孔板中，待贴壁后培养0、24、48、72 h，弃培养基，加入100 μl新鲜培养基，同时加入10 μl阿尔玛蓝(alarmar blue)试剂，37℃培养2 h后，使用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度(A)值。
7. 共聚焦活细胞成像：细胞脂滴通过标记红色荧光的BODIPY染料染色10 min，细胞核通过HOCHEST染色10 min，然后使用共聚焦激光扫描显微镜观察处理后的A549细胞内脂滴含量并拍照。
8. 细胞凋亡检测：细胞凋亡采用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒进行，使用流式细胞仪进行细胞凋亡比例的检测。收集细胞并消化重悬，细胞浓度调整到1×106个/ml，在细胞悬液中加入5 μl Annexin V-FITC，混匀之后再加入5 μl 7-AAD染料，再次混匀；避光，室温孵育15 min后上机检测。
9. 细胞存活率检测：对细胞进行分为4组：阴性对照组(NC)、空载体组(pEGFP)、过表达载体组(PLIN5FL)及PLIN5成脂结构域删除载体组(PLIN5Δ399-463)。每组细胞随机分成两组，照射组进行8 Gy X射线照射，照后培养24、48、72 h，分别采用CCK-8方法检验各组细胞的活力，绘制细胞相对存活曲线。
10. 统计学处理：所有实验都独立重复至少3次，所有数据均符合正态分布检验，方差齐，以 x±s表示。使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析，组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果1. 2 Gy X射线照射显著增加PLIN5基因表达和脂质代谢相关通路：结果示于图 1，A549细胞照射后24 h共出现487个差异表达基因，其中上调表达基因237个，下调表达基因250个。对差异基因的KEGG分析显示，差异基因富集到了脂质转运-ATP酶活性、脂质β氧化、细胞质-线粒体等与脂质合成和代谢密切相关的通路。在上调表达的基因中，与细胞内中性脂质含量密切相关的基因PLIN5也富集到了相关通路。基因集富集分析(GSEA)显示，脂质代谢通路(lipid metabolism signature)与电离辐射刺激显著相关。所有脂质代谢通路差异表达基因热图分析显示，PLIN5是该通路中上调变化最明显的基因。推测PLIN5可能与细胞电离辐射后脂质代谢异常及辐射敏感性相关。
|
注：1-3分别为对照组平行样本一、二、三；4-6分别为照射组平行样本一、二、三。 箭头所指为变化最为显著的差异表达基因 图 1 电离辐射对A549细胞基因表达和功能富集条目的影响 A. 基因差异表达火山图；B. 差异基因富集条目；C. 基因集富集分析；D. 热图分析 Figure 1 Effects of ionizing radiation on gene expression and functional enrichment terms in A549 cells A. Volcano plot of differentially expressed genes; B. Enrichment terms of differential genes; C. Gene set enrichment analysis; D. Heat map analysis |
2. 电离辐射诱导A549细胞内PLIN5基因和蛋白的表达上升：qRT-PCR检测A549细胞在2 Gy X射线照射24 h后的基因表达水平变化。结果表明，与对照组1%相比，照射组PLIN5的基因表达水平提高了2.5倍(2.50±0.50)% (t=3.06，P＜0.05)；共聚焦显微镜结果示于图 2，PLIN5蛋白在照射后定位在细胞质内，呈点状分布，且照射组细胞的PLIN5荧光强度高于对照组。结果提示电离辐射能够显著增加PLIN5基因和蛋白的表达。
|
图 2 2 Gy X射线照射对PLIN5蛋白表达的影响 HOCHEST染色 ×1 260 Figure 2 2 Gy X-ray radiation on PLIN5 protein expression HOCHEST staining ×1 260 |
3. 提高细胞内中性脂质含量显著增加细胞的辐射抗性：为了验证中性脂质和脂滴累积对细胞辐射敏感性的影响，通过添加油酸/棕榈酸混合溶液构建高量中性脂滴细胞模型，结果示于图 3。添加50 μmol/L油酸和100 μmol/L棕榈酸混合溶液后，细胞内中性脂滴含量显著增加，结果提示高量中性脂滴模型构建成功。与对照组(4.93±0.19)%相比，电离辐射刺激后，高量中性脂滴模型细胞的相对增殖速率为(7.96±0.41)% (t=11.10，P＜0.01)。说明中性脂质累积可以显著增加细胞的辐射抗性。
|
注：红色标记脂滴，蓝色标记细胞核；a与对照组照射后同一指标相比，t=11.10，P＜0.01 图 3 增加细胞内中性脂质含量对细胞辐射敏感性的影响 A. 脂滴染色分析BODIPY染色+HOCHEST染色×1 260；B. 细胞相对增殖曲线 Figure 3 The effect of neutral lipid content on increasing intracellular cell radiation sensitivity A. Analysis of lipid droplet staining BODIPY+HOCHEST staining ×1 260; B. Relative proliferation curve of cells |
4. 过表达PLIN5基因增加A549细胞内脂滴含量和细胞辐射抗性：为了验证PLIN5对细胞脂滴含量和辐射敏感性的影响，通过构建PLIN5全长过表达载体(PLIN5FL)转染A549细胞。同时，为了验证PLIN5是否通过脂滴生成影响细胞辐射敏感性，构建了PLIN5成脂结构域删除的载体(PLIN5Δ399-463)使之不影响细胞内脂滴含量。结果示于图 4，在A549细胞中与阴性对照组(NC)和空载体组(pEGFP)相比，过表达PLIN5全长的细胞内脂滴含量明显增加，过表达PLIN5成脂结构域删除的细胞脂质含量与对照组和空载体组明显差异；同时，与阴性对照照射组(1.70±0.48)%相比，过表达PLIN5全长的细胞辐射抗性显著增加(2.49±0.92)% (t=3.32，P＜0.05)，过表达PLIN5成脂结构域删除的细胞辐射抗性与对照组和空载体组差异无统计学意义。在Calu-1细胞中，流式细胞术检测细胞凋亡结果表明，过表达PLIN5全长组(47.67±2.34)%的细胞凋亡比例显著降低(t=11.19，P＜0.01)，过表达PLIN5成脂结构域删除组(55.53±2.97)%的细胞辐射抗性与阴性对照组(57.03±1.59)%和空载体组(58.60±2.00)%差异无统计学意义。结果提示PLIN5是通过增加脂滴的含量增强细胞的辐射抗性。
|
注：蓝色为细胞核；红色为脂滴；绿色为PLIN5。 a与NC IR同一指标相比，t=3.32，P＜0.05 图 4 过表达PLIN5及其成脂结构域敲除截断体对细胞内脂滴含量和辐射敏感性的影响 A. 脂滴和PLIN5蛋白含量荧光图HOCHEST+BODIPY染色×630；B. 细胞相对存活率曲线 Figure 4 Effects of overexpression of PLIN5 and its lipid-binding domain deletion truncated mutant on intracellular lipid droplet content and radiosensitivity A. Fluorescence micrographs showing lipid droplets and PLIN5 protein content HOCHEST+BODIPY staining ×630; B. Cell relative survival curves following irradiation |
5. 敲低PLIN5细胞脂滴含量显著降低：为了进一步验证PLIN5对细胞内脂质含量的影响，构建了PLIN5敲低的A549细胞系。结果表明，在未经X射线照射时，干扰PLIN5表达后脂质含量显著降低[siPLIN5 Sham组vs.siNC Sham组：(592.70±76.07)% vs. (821.40±45.48)%，t=6.60，P＜0.05]；经X射线照射后，对照组细胞脂质含量显著上升[siNC IR组vs.siNC Sham组：(1 403.00±86.81)% vs. (821.40±45.48)%，t=13.55，P＜0.05]，虽然与对照组照射后样本相比，干扰PLIN5表达组的脂质含量也出现上升，但是与对照组照射后相比，脂质含量明显降低[siNC IR组vs.siNC Sham组：(958.80±74.27)% vs. (1 403.00±86.81)%，t=3.84，P＜0.05]。结合前述结果说明，PLIN5过表达可以增加脂滴含量，干扰PLIN5能够显著降低电离辐射引起的脂滴累积。
6. 敲低PLIN5显著降低细胞辐射抗性：为了明确PLIN5敲减对细胞辐射敏感性的影响，构建了PLIN5敲低的A549和Calu-1细胞系。在A549细胞中，在未经X射线照射时，干扰PLIN5表达下调至18%[siPLIN5 Sham组vs. siNC Sham组：(0.21±0.06)% vs.1%，t=13.72，P＜0.05]；经X射线照射后，对照组细胞PLIN5表达显著上升至1.55倍[siNC IR组vs. siNC Sham组：(1.56±0.14)% vs.1%，t=4.10，P＜0.05]，但是干扰PLIN5后电离辐射并未产生显著上调；与对照组细胞照射后相比，PLIN5干扰组的PLIN5表达显著降低[siPLIN5 IR组vs. siNC IR组：(0.40±0.08)% vs.(1.56±0.14)%，t=6.21，P＜0.05]。细胞相对增殖速率结果示于表 1，干扰PLIN5表达显著降低了电离辐射后A549细胞的增殖速率(t=7.63，P＜0.05)。在Calu-1细胞中，流式细胞术检测PLIN5敲减后的细胞凋亡比例，结果显示电离辐射后，敲减PLIN5的细胞凋亡比例显著升高[siPLIN5 IR组vs. siNC IR组：(57.77±2.02)% vs.(47.37±1.48)%，t=4.43，P＜0.05]，过表达PLIN5成脂结构域删除的细胞辐射抗性与对照组和空载体组差异无统计学意义。结果说明，干扰PLIN5能够显著增加A549和Calu-1等非小细胞肺癌细胞的辐射敏感性。
|
表 1 敲低PLIN5对A549细胞相对增殖速率的影响(x±s) Table 1 The impact of knocking down PLIN5 on the relative proliferation rate of A549 cells(x±s) |
讨论
放射抵抗是肿瘤治疗失败和局部复发的主要原因之一。其直接危害在于，对辐射不敏感的癌细胞在治疗后存活并增殖，导致肿瘤无法被有效控制或清除。这不仅使患者错失了潜在治愈的机会，还迫使临床提高辐射剂量，从而加剧对周围正常组织的损伤，引发严重的副作用，影响患者的生存质量和预后。如何减少肿瘤组织的辐射抵抗，探索放疗增敏的方案是研究的重点。在放射生物学领域，2 Gy被公认为标准分次剂量，也是解析DNA损伤修复、周期阻滞及早期细胞死亡等核心事件的经典模型。本研究首先利用2 Gy照射的转录组图谱，系统捕获细胞对电离辐射的初始分子应答，并据此锁定PLIN5介导的脂质代谢通路。随后，将剂量窗口扩展至8 Gy，对已确证的分子通路进行高剂量验证，从而提升转录组学发现的可信度。2 Gy接近常规分割放疗单次剂量，而8 Gy更接近立体定向放疗(SBRT)或单次大剂量照射的暴露水平，二者结合可兼顾分次照射的分子基础与极端剂量下的生物学边界，并为后续临床剂量分割方案优化提供双重分子依据。
放射抵抗的机制复杂，主流观点认为癌细胞非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)等修复等高效的DNA损伤修复通路快速激活[7]、肿瘤组织微环境内缺氧、癌症干细胞特性、PI3K/Akt和NF-κB等促生存通路过度激活[8-9]的存在使癌细胞具有更强的DNA修复能力和抗氧化压力能力，对辐射更具抵抗力。近年研究发现，脂质代谢重编程在辐射抵抗中扮演关键角色[10]。快速增殖的癌细胞需要大量脂质来构建细胞膜和产生能量。辐射抵抗细胞通过增强脂肪酸合成(如ACC、FASN酶活性上调)和摄取外源脂质，满足其修复和再生需求[11]。本研究提示，PLIN5是电离辐射导致脂质堆积和放射抵抗的关键因素，通过敲除PLIN5能够显著降低脂质含量并且增加细胞的辐射敏感性。其中潜在的原因可能是脂质代谢中的多个环节(如谷胱甘肽合成)有助于清除电离辐射产生的活性氧自由基，减轻氧化损伤，产生辐射抵抗[12]。某些脂质分子本身也具有抗氧化功能。某些脂质，如花生四烯酸衍生物、溶血磷脂酸(LPA)等，可作为信号分子，激活上述PI3K/Akt等促生存和修复通路，形成正向反馈环路，强化辐射抵抗表型。靶向关键脂质代谢酶或通路有可能未来成为克服放射抵抗的新型策略。
Perilipins是在LD表面检测到的蛋白质家族[13]，其中PLIN5基因仅存在于哺乳动物物种中，映射到人类19p13.3染色体，在脂滴积累中起重要作用[4]。PLIN5通过协调脂滴的存储与分解，精细管理脂肪酸的通量。它既能保护脂滴免受过早分解，也能在能量需求时(如辐射后修复)促进脂肪酸的释放，为细胞提供充足的能源和生物膜合成原料。PLIN5主要表达于高氧化代谢组织(如心脏、肌肉)的脂滴表面蛋白，在肿瘤细胞中，其表达与辐射抵抗的关系尚不明确。本研究明确了PLIN5能够通过增加细胞内脂滴含量增加非小细胞肺癌细胞系的辐射抗性。在产生辐射抗性的机制层面，辐射通过产生大量活性氧(ROS)杀伤细胞，PLIN5可能会通过将脂肪酸导向线粒体进行β-氧化，这一过程能消耗NADPH并产生抗氧化剂(如谷胱甘肽)，可能会减轻癌细胞的氧化损伤，增强癌细胞的存活能力[12]。鉴于PLIN5的关键作用，靶向PLIN5可能成为克服放疗抵抗的极具前景的新策略。
综上，本研究证实电离辐射通过上调PLIN5表达，促进脂滴形成，从而增强A549和Calu-1细胞的辐射抵抗性。敲低PLIN5则可逆转辐射诱导的脂质累积并显著增加放射敏感性。PLIN5的功能依赖于其成脂结构域，其缺失会消除辐射保护效应。本研究结果提示，PLIN5是具有潜力的放射增敏新靶点。后续研究可深入探索其调控脂质代谢的具体分子机制，并致力于开发靶向PLIN5的小分子抑制剂，为克服肿瘤放疗抵抗提供新的联合治疗策略。对于PLIN5表达上升引起的脂滴增加是否具有潜在的脂毒性尚待进一步的研究。
利益冲突 无
作者贡献声明 郑泽轩、沈嘉浩负责实验和数据分析、撰写论文；裴海龙、李宛时负责实验设计、数据整理和论文修改
| [1] |
Chen P, Liu Y, Wen Y, et al. Non-small cell lung cancer in China[J]. Cancer Commun (Lond), 2022, 42: 937-970. DOI:10.1002/cac2.12359 |
| [2] |
Francesca P, Jeannette J, Jan K, et al. Cancer radioresistance is characterized by a differential lipid droplet content along the cell cycle[J]. Cell Div, 2024, 20(19): 14. DOI:10.1186/s13008-024-00116-y |
| [3] |
Peng W, Chen S, Ma J, et al. Endosomal trafficking participates in lipid droplet catabolism to maintain lipid homeostasis[J]. Nat Commun, 2025, 16: 1917. DOI:10.1038/s41467-025-57038-8 |
| [4] |
Wang H, Sztalryd C. Oxidative tissue: Perilipin 5 links storage with the furnace[J]. Trends Endocrinol Metab, 2011, 22: 197-203. DOI:10.1016/j.tem.2011.03.008 |
| [5] |
Dalen K T, Dahl T, Holter E, et al. LSDP5 is a PAT protein specifically expressed in fatty acid oxidizing tissues[J]. Biochim Biophys Acta, 2007, 1771(2): 210-227. DOI:10.1016/j.bbalip.2006.11.011 |
| [6] |
Benedikt K, Stephanie K, Natalia K, et al. Lipid droplet-mitochondria coupling via perilipin 5 augments respiratory capacity but is dispensable for FA oxidation[J]. J Lipid Res, 2022, 63(3): 100172. DOI:10.1016/j.jlr.2022.100172 |
| [7] |
刘菁华, 曹志飞, 张永胜. 肾细胞癌放疗抵抗机制的研究进展[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2024, 44(10): 886-890. Liu JH, Cao ZF, Zhang YS. Research advances in the mechanisms of radiotherapy resistance in renal cell carcinoma[J]. Chin J Radiol Med Prot, 2024, 44(10): 886-890. DOI:10.3760/cma.j.cn112271-20240517-00184 |
| [8] |
Bussink J, Kogel AJ, Kaanders JH. Activation of the PI3-K/AKT pathway and implications for radioresistance mechanisms in head and neck cancer[J]. Lancet Oncol, 2008, 9(3): 288-296. DOI:10.1016/S1470-2045(08)70073-1 |
| [9] |
王萍, 袁德晓, 邵春林. 染色质结构影响肿瘤细胞辐射敏感性的研究进展[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2016, 36(9): 717-720. Wang P, Yuan DX, Shao CL. Influence of chromatin structure on the radiation sensitivity of tumor cells[J]. Chin J Radiol Med Prot, 2016, 36(9): 717-720. DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2016.09.018 |
| [10] |
魏金玲, 张勇, 潘鑫艳, 等. 代谢重编程在电离辐射及其旁效应中的研究进展[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2023, 43(2): 154-160. Wei JL, Zhang Y, Pan XY, et al. Research progress of the roles of metabolic reprogramming in radiation-induced direct- and bystander-effects[J]. Chin J Radiol Med Prot, 2023, 43(2): 154-160. DOI:10.3760/cma.j.cn112271-20220628-00269 |
| [11] |
Cao Y, Li J, Chen Y, et al. Monounsaturated fatty acids promote cancer radioresistance by inhibiting ferroptosis through ACSL3[J]. Cell Death Dis, 2025, 16: 184. DOI:10.1038/s41419-025-07516-0 |
| [12] |
Asantewaa G, Tuttle ET, Ward NP, et al. Glutathione synthesis in the mouse liver supports lipid abundance through NRF2 repression[J]. Nat Commun, 2024, 15(1): 6152. DOI:10.1038/s41467-024-50454-2 |
| [13] |
Luo W, Wang H, Ren L, et al. Adding fuel to the fire: The lipid droplet and its associated proteins in cancer progression[J]. Int J Biol Sci, 2022, 18(16): 6020-6034. DOI:10.7150/ijbs.74902 |