2026, Vol. 46
2. 解放军医学院, 北京 100853;
3. 解放军总医院第一医学中心放射治疗科, 北京 100853
2. Chinese PLA Medical School, Beijing 100853, China;
3. Department of Radiation Oncology, First Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
放射治疗在超过50%的癌症患者治疗中发挥着关键作用[1]，肠道损伤是腹部和盆腔肿瘤患者放疗过程中的主要剂量限制因素。50%接受腹部或盆腔放疗的患者会出现不同程度的慢性肠道功能障碍，60%~80%的患者在放疗期间会出现暂时的肠道不良反应[2]。FLASH放疗是一种新兴的放疗技术，能够减轻对正常组织的辐射损伤，同时保持对肿瘤的控制效果[3-4]，即FLASH效应。在动物实验中已观察到腹部照射后的FLASH效应，但是产生FLASH效应的剂量及剂量率却不一致[5-6]，了解这些参数对FLASH放疗应用于临床具有重要意义。
有研究表明，肠道微生物群失调与放射性肠道损伤的发生有关[7]，特定的微生物群落特征可以预测患者在放疗期间的不良反应[8-9]。但关于FLASH照射对肠道菌群影响的研究很少，本研究旨在探究FLASH照射后肠道菌群的变化特点及肠道菌群与FLASH效应的关系。
材料与方法1. 实验动物与分组：113只6周龄雄性健康C57BL/6J小鼠购自北京斯贝福生物技术有限公司，生产许可证：SCXK(京)2024-0001。小鼠在开始实验前1周进行适应环境，12 h/12 h昼夜光照交替，随意进食饮水。实验已获得解放军总医院伦理委员会批准(伦理号：SQ2024876)。将小鼠按照完全随机分组方法分为空白对照组(Sham组)、常规照射组(CONV组)和FLASH组，分别为9、52、52只。CONV组和FLASH组每组分别照射10、15、20和25 Gy，每个剂量分别为15、15、11、11只。
2. 照射：CONV照射使用瑞典Elekta Precise直线加速器，6 MV X射线，剂量率为4 Gy/min。FLASH照射使用绵阳中玖闪光医疗科技有限公司和中国工程物理研究院应用电子学研究所联合研制的紧凑型X射线FLASH放疗专用装置照射，剂量率为200 Gy/s。在小鼠照射前，使用EBT3辐射显色胶片测定照射剂量。小鼠麻醉后固定在有机玻璃固定架上，进行全腹照射。照射野的上界以胸骨剑突为标志，下界以耻骨联合为标志，以确保照射覆盖全腹，照射视野大小为3 cm × 4 cm。
常规剂量率和FLASH照射的剂量学测量同时采用两种方法：EBT4辐射变色胶片(配日本EPSON 12000XL扫描仪)和德国PTW 60025 FlashDiamond金刚石探头(配PTW UNIDOS Tango静电计)。EBT4胶片用于测量吸收剂量、射束的射野离轴比/剂量分布曲线(profile)和百分深度剂量(percentage depth dose，PDD)曲线，测量不确定度约3%。FlashDiamond探头用于对胶片测量结果进行校对，其本身剂量的测量不确定度约1%。EBT4测量得到的profile和PDD曲线与Geant4平台(粒子物理模拟软件)进行的蒙特卡罗计算结果在不确定度范围内一致。在FLASH照射过程中，使用专用的Beam monitor对剂量率和总剂量进行了监测，结果显示加速器波动导致的组内小鼠受照剂量差异约为1%。
3. 苏木精-伊红染色：颈椎脱臼法处死小鼠，取小肠组织进行HE染色。将小肠组织固定在4%多聚甲醛溶液中，然后依次进行脱水、包埋、切片、脱蜡、染色和封片。HE染色后，参照Chiu等[10]，进行肠道组织损伤评分。
4. 16S rDNA测序：收集小鼠粪便进行16S rDNA检测。使用MP-soil进行粪便DNA提取，使用引物27F(AGRGTTYGATYMTGGCTCAG)和1492R(RGYTACCTTGTTACGACTT)进行16S rDNA全长扩增，随后进行PCR产物纯化、定量与均一化，使用SMRTbell prep kit 3.0(美国Pacbio公司)建库，通过Pacbio Sequel IIe System进行16S rDNA三代全长测序。上机完成后，进行生物学分析。Chao指数是用chao1算法估计样本中所含扩增子序列变体(amplion sequence variant，ASV)数目的指数，chao1在生态学中常用来估计物种总数。计算公式如下：Schao1=Sobs+n1(n1-1)/[2(n2+1)], 式中Schao1为估计的ASV数；Sobs为实际观测到的ASV数；n1为只含有一条序列的ASV数目；n2为只含有两条序列的ASV数目。Shannon指数用来估算样本中微生物多样性的指数之一，常用于反映群落alpha多样性。Shannon值越大，说明群落多样性越高。计算公式如下：
| $ H_{{shannon }}=-\sum\limits_{i=1}^{S_{o b s}} \frac{n_i}{N} \ln \frac{n_i}{N}, $ | (1) |
式中，Sobs为实际观测到的ASV数目；ni为第i个ASV所含的序列数；N为所有的序列数。主坐标分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)用于研究样本群落组成的相似性或差异性，基于所选距离矩阵进行作图。
5. 统计学处理：使用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。绘制Kaplan-Meier生存曲线，使用Log-rank(Mantel-Cox)检验比较生存曲线。计量资料符合正态分布，以x±s表示。采用Wilcoxon秩和检验进行α多样性的组间差异分析，使用基于bray-Curtis距离算法的PCoA检验样本间微生物群落结构的β多样性，使用Kruskal-Wallis秩和检验进行多组间物种差异分析。菌群失调指数(microbial dysbiosis index，MDI)计算公式为：MDI=log10[(干预组中丰度增加的菌属总丰度) / (干预组中丰度降低的菌属总丰度)][11]。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1. 存活率和体重：10 Gy时，两种照射均无小鼠死亡。20和25 Gy时，两种照射均导致小鼠1周内全部死亡。15 Gy时，FLASH照射的生存率为77.78%(7/9)，而CONN组的生存率为55.56%(5/9)，但差异无统计学意义(P=0.28)。10、15 Gy FLASH和CONV照射的小鼠体质量均低于Sham组。见图 1。
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图 1 两种照射方式不同剂量照射后的生存率(A)和体重变化(B) Figure 1 Survival rates (A) and changes in body weight (B) following FLASH and conventional irradiation at different doses |
2. FLASH照射后肠道组织损伤情况：小肠组织HE染色结果显示，照射后第3天，FLASH-10 Gy组的肠道组织评分低于相应的CONV组(q =6.71，P＜0.05)，且FLASH-15 Gy组的肠道病理评分也低于CONV-15 Gy组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。照射后第7天，FLASH组的病理评分也低于相应剂量的CONV组，但差异均无统计学意义(P＞0.05)。而照射后30 d，只有CONV-15 Gy组肠道组织存在明显损伤(q=5.21，P＜0.05，图 2)。而20和25 Gy时，FLASH组和CONV组的肠道组织隐窝结构绝大多数被破坏，并且存在肠道出血。
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注：a与CONV-10 Gy组比较，q =6.71，P < 0.05；b与Sham组比较，q=5.21，P < 0.05 图 2 两种照射方式在10和15 Gy照射后不同时间点的小肠病理评分 Figure 2 Pathological scores of the small intestine at different time points after FLASH and conventional irradiation at doses of 10 and 15 Gy |
3. FLASH照射后肠道微生物群恢复情况：15 Gy照射后30 d，CONV组的Shannon指数显著低于Sham组(q= 5.16，P＜0.05)，而FLASH组与Sham组差异无统计学意义(P＞0.05)。同时，FLASH组在照射后30 d的物种数为107种，而CONV组仅为73种(图 3)。10 Gy照射后，FLASH组肠道微生物群恢复更快。FLASH组和CONV组的Chao指数在照射后30 d与Sham组相似(P＞0.05)，但在照射后7 d CONV组的Chao指数显著低于Sham组和FLASH组(q= 3.81、4.06，P＜0.05，表 1)。PCoA主成分分析结果如图 4所示，FLASH组的肠道菌群组成恢复至照射前(P＞0.05)，而CONV组与自身照射前存在显著差异(R=0.45，P＜0.05)。
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图 3 FLASH组和CONV组在15 Gy全腹照射后第30天的物种数 Figure 3 Numbers of gut bacterial species in FLASH and conventional groups at 30 d after 15 Gy of whole-abdomen irradiation |
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表 1 不同剂量FLASH和CONV照射后Shannon指数和Chao指数 Table 1 Shannon and Chao indices following FLASH and conventional irradiation at different doses |
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图 4 FLASH(A)和CONV(B)照射的主成分分析在10 Gy全腹照射后第30天的变化 Figure 4 Changes in the PCoA results of the FLASH (A) and CONV (B) groups at 30 d after 10 Gy of whole-abdomen irradiation |
4. 照射后肠道菌群的纵向变化：10 Gy照射后，FLASH组和CONV组的Chao指数整体变化趋势均为先升高后降低，但CONV组在照射后第3天达到最高，而FLASH组则是在第1天最高。进一步分析肠道菌群失调指数表明，FLASH组在照射后1和3 d存在明显的肠道菌群失调(U=0、9，P＜0.05)，照射后第7天已恢复至正常(P＞0.05)，CONV组在照射后1、3和7 d均存在明显的肠道菌群失调(U=0、0、10，P＜0.05)，照射后第30天恢复正常(P＞0.05)。物种数变化表明，FLASH组和CONV组的物种数量在照射后1 d均升高，随后在照射后3、7和30 d均降低，但CONV组变化幅度更大(表 2，3)。
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表 2 FLASH组和CONV组10 Gy全腹照射后不同时间Chao指数和菌群失调指数(MDI)的变化 Table 2 Changes in the Chao index and microbial dysbiosis index (MDI) of the FLASH and CONV groups at different time points after 10 Gy of whole-abdomen irradiation |
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表 3 FLASH组和CONV组10 Gy全腹照射后不同时间物种数的变化 Table 3 Changes in the species numbers of the FLASH and CONV groups at different time points following 10 Gy whole-abdomen irradiation |
5.与FLASH效应相关的特异细菌：物种差异分析显示，10和15 Gy照射后1 d，CONV组和FLASH组的Lactobacillus丰度均会显著降低(q=5.10、3.95、6.14、6.20，P＜0.05，表 4)。10 Gy照射后第3天，FLASH组显著升高，并持续升高至第30天，而CONV组升高延迟，在照射后第7天出现峰值，而第30天又降低(表 5)。进一步分析显示，Akkermansia丰度照射后先升高后降低，FLASH组在照射后3 d内持续升高，在照射后7 d后持续降低，而CONV组在照射后7 d内持续升高，后降低，并且在照射后的整个变化过程中CONV组的Akkermansia丰度始终高于FLASH组。15 Gy全腹照射后30 d，CONV组的Akkermansia丰度同样高于FLASH组，且差异有统计学意义(q= 8.27、6.46，P＜0.05，表 4)。
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表 4 Lactobacillus和Akkermansia在FLASH和CONV照射后的相对丰度 Table 4 Relative abundances of Lactobacillus and Akkermansia following FLASH and conventional irradiation |
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表 5 FLASH和CONV组10 Gy全腹照射后不同时间Lactobacillus和Akkermansia相对丰度的变化 Table 5 Changes in the relative abundances of Lactobacillus and Akkermansia in the FLASH and CONV groups at different time points following 10 Gy of whole-abdomen irradiation |
讨论
本研究应用不同的照射剂量探究了小鼠全腹照射的FLASH效应，并对受照小鼠粪便样本进行16S rDNA测序分析，系统探究了X射线FLASH照射与CONV照射对小鼠肠道菌群的影响，明确了FLASH照射后肠道菌群恢复更快的特征，且发现乳杆菌属和Akkermansia与FLASH效应存在关联，为FLASH效应的微生物机制研究提供了全新视角，增加了“FLASH放疗-肠道菌群-正常组织保护”三者关联的研究依据。
临床中FLASH放疗的关键参数(如有效剂量、剂量率)尚未统一，不同研究结果存在差异。Böhlen等[12]的研究结果提示对于小鼠肠道组织，当单次照射剂量为10~25 Gy时，可以观察到比较明显且稳定的FLASH效应。因此，本研究通过设置10、15、20、25 Gy 4种剂量，对比200 Gy/s(FLASH)与4 Gy/min(CONV)的小鼠生存率，为确定FLASH放疗的安全剂量范围提供了重要的动物实验依据，同时为降低放疗相关肠道不良反应、优化放疗方案(如剂量选择、照射方式)提供了潜在方向。有研究显示，接受15 Gy全腹照射的FLASH组(6 MeV，平均剂量率为>150 Gy/s，瞬时剂量率为>5.5×105 Gy/s)生存率为87.5%，CONV组的生存率为62.5%[13]，本研究结果与其相似。但Gao等[14]研究显示，15 Gy全腹照射的FLASH组(15 Gy/次，8 MeV，937 Gy/s)小鼠全部死亡，而照射剂量为12 Gy时FLASH组(700 Gy/s，6 MeV)的生存率为62.5%，CONV组(0.1 Gy/s，6 MeV)在照射剂量为12 Gy时全部死亡。这些临床前研究结果的差异可能与照射剂量率不同相关，提示在研究FLASH效应时应兼顾照射剂量和照射剂量率的共同影响，FLASH临床转化的关键参数仍需进一步探究。
本研究还探讨了FLASH照射和CONV照射对肠道微生物的影响。从肠道菌群α多样性和β多样性来看，相同剂量照射下FLASH照射后肠道微生物群恢复更快。FLASH组和CONV组在照射剂量15 Gy时生存率不同可能与肠道菌群的作用密不可分。多项临床及基础研究证实肠道菌群可以减轻放疗带来的肠道损伤，从而提高生存率[15-18]。而Xu等[19]在AOM/DSS诱导的结直肠癌小鼠模型中的研究认为，FLASH和CONV照射不会改变肠道菌群的多样性和均匀性，但会改变肠道菌落的组成。研究结果的不同可能与小鼠模型不同相关，小鼠照射前肠道菌群组成以及小鼠对照射的反应存在差异。
此外，本研究进一步探讨了FLASH照射和CONV照射后肠道菌群的纵向变化。首先，无论哪种照射方式，肠道菌群均会在照射后1 d发生显著变化。其次，肠道菌群的纵向变化分析也发现了FLASH组较CONV组恢复更快。FLASH组和CONV组的物种总数在照射后3~30 d一直在逐渐减少，并且CONV组的变化更明显，肠道菌群的这种长期紊乱可能与慢性放射性肠道损伤相关。辐射后肠道内环境发生变化，包括免疫环境等[20]，可能具有辐射耐受以及免疫耐受的肠道细菌才能够生存，后续将进行更加长期的研究来进一步探究彼此之间的关系。
最后，对与FLASH效应相关的特异细菌进行了探索。乳杆菌属和Akkermansia菌丰度在照射后发生了明显变化，并且在FLASH组和CONV组的变化不同。多项研究表明，乳杆菌可以减轻放射性肠道损伤，增强肠道屏障，其丰度在照射后降低[21-23]。本研究发现，FLASH组小鼠肠道乳杆菌属丰度较CONV组开始明显升高的时间更早，一项电子FLASH全脑照射后肠道菌群变化的研究分析也同样发现FLASH暴露增加了Lachnospiraceae等有益菌的丰度[24]，这可能与FLASH效应相关。本研究还发现在照射后30 d内，Akkermansia在FLASH组的丰度低于CONV组。同样也有研究表明，Akkermansia的丰度升高与放射诱导的直肠炎相关，并且在放射损伤后升高[5, 18]。张俊等[25]关于FLASH不同照射剂量对肠道菌群改变的结果显示，Akkermansia在损伤较大的25 Gy组中富集。这些发现提示乳杆菌属可作为放射性肠道损伤的潜在保护菌，阿克曼氏菌属可作为损伤程度的“指示菌”，为后续通过调节肠道菌群(如益生菌补充、菌群移植)治疗放射性肠道损伤提供了明确的靶点参考，但具体的作用及机制仍需要进一步探究。
综上所述，与常规照射相比，FLASH照射可提高小鼠生存率，降低肠道组织损伤。此外，FLASH照射较常规照射减少了对肠道菌群的影响。FLASH照射和常规照射均会导致肠道菌群在照射后1 d发生明显的变化，乳杆菌属等细菌在FLASH照射后和常规照射后的纵向变化不同。这些研究结果可能为FLASH效应机制的探究提供新的思路，同时也为放射性肠道损伤提供了潜在的治疗策略。
利益冲突 无
作者贡献声明 张雨静负责文献调研、实验实施、数据分析及论文撰写；王琳、张嘉琪参与文献调研及实验实施；杜乐辉、曲宝林负责实验设计、指导实施及论文修改；彭丽华负责实验设计和论文修改
| [1] |
Huang RX, Zhou PK. DNA damage response signaling pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer[J]. Signal Transduct Target Ther, 2020, 5(1): 60. DOI:10.1038/s41392-020-0150-x |
| [2] |
Hauer-Jensen M, Denham JW, Andreyev HJ. Radiation enteropathy--pathogenesis, treatment and prevention[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2014, 11(8): 470-479. DOI:10.1038/nrgastro.2014.46 |
| [3] |
Bogaerts E, Macaeva E, Isebaert S, et al. Potential molecular mechanisms behind the ultra-high dose rate "FLASH" effect[J]. Int J Mol Sci, 2022, 23(20): 12109. DOI:10.3390/ijms232012109 |
| [4] |
Favaudon V, Caplier L, Monceau V, et al. Ultrahigh dose-rate FLASH irradiation increases the differential response between normal and tumor tissue in mice[J]. Sci Transl Med, 2014, 6(245): 245ra93. DOI:10.1126/scitranslmed.3008973 |
| [5] |
Ruan JL, Lee C, Wouters S, et al. Irradiation at ultra-high (FLASH) dose rates reduces acute normal tissue toxicity in the mouse gastrointestinal system[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2021, 111(5): 1250-1261. DOI:10.1016/j.ijrobp.2021.08.004 |
| [6] |
Levy K, Natarajan S, Wang J, et al. Abdominal FLASH irradiation reduces radiation-induced gastrointestinal toxicity for the treatment of ovarian cancer in mice[J]. Sci Rep, 2020, 10(1): 21600. DOI:10.1038/s41598-020-78017-7 |
| [7] |
Yang Q, Qin B, Hou W, et al. Pathogenesis and therapy of radiation enteritis with gut microbiota[J]. Front Pharmacol, 2023, 14: 1116558. DOI:10.3389/fphar.2023.1116558 |
| [8] |
Jang BS, Chung MG, Lee DS. Association between gut microbial change and acute gastrointestinal toxicity in patients with prostate cancer receiving definitive radiation therapy[J]. Cancer Med, 2023, 12(22): 20727-20735. DOI:10.1002/cam4.6636 |
| [9] |
Iacovacci J, Serafini MS, Avuzzi B, et al. Intestinal microbiota composition is predictive of radiotherapy-induced acute gastrointestinal toxicity in prostate cancer patients[J]. EBioMedicine, 2024, 106: 105246. DOI:10.1016/j.ebiom.2024.105246 |
| [10] |
Chiu CJ, McArdle AH, Brown R, et al. Intestinal mucosal lesion in low-flow states: Ⅰ. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal[J]. Arch Surg, 1970, 101(4): 478-483. DOI:10.1001/archsurg.1970.01340280030009 |
| [11] |
Gunathilake M, Lee J, Choi IJ, et al. Alterations in gastric microbial communities are associated with risk of gastric cancer in a Korean population: A case-control study[J]. Cancers (Basel), 2020, 12(9): 2619. DOI:10.3390/cancers12092619 |
| [12] |
Böhlen TT, Germond JF, Bourhis J, et al. Normal tissue sparing by FLASH as a function of single-fraction dose: A quantitative analysis[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2022, 114(5): 1032-1044. DOI:10.1016/j.ijrobp.2022.05.038 |
| [13] |
Zhu H, Xie D, Yang Y, et al. Radioprotective effect of X-ray abdominal FLASH irradiation: Adaptation to oxidative damage and inflammatory response may be benefiting factors[J]. Med Phys, 2022, 49(7): 4812-4822. DOI:10.1002/mp.15680 |
| [14] |
Gao F, Yang Y, Zhu H, et al. First demonstration of the FLASH effect with ultrahigh dose rate high-energy X-rays[J]. Radiother Oncol, 2022, 166: 44-50. DOI:10.1016/j.radonc.2021.11.004 |
| [15] |
Tu Y, Luo L, Zhou Q, et al. Fecal microbiota transplantation repairs radiation enteritis through modulating the gut microbiota-mediated tryptophan metabolism[J]. Radiat Res, 2024, 201(6): 572-585. DOI:10.1667/RADE-23-00189.1 |
| [16] |
Ding X, Li Q, Li P, et al. Fecal microbiota transplantation: A promising treatment for radiation enteritis?[J]. Radiother Oncol, 2020, 143: 12-18. DOI:10.1016/j.radonc.2020.01.011 |
| [17] |
Wang L, Li Y, Zhang YJ, et al. Intestinal microecological transplantation for a patient with chronic radiation enteritis: A case report[J]. World J Gastroenterol, 2024, 30(19): 2603-2611. DOI:10.3748/wjg.v30.i19.2603 |
| [18] |
Li Y, Dong J, Xiao H, et al. Gut commensal derived-valeric acid protects against radiation injuries[J]. Gut Microbes, 2020, 11(4): 789-806. DOI:10.1080/19490976.2019.1709387 |
| [19] |
Xu M, Qiu X, Chen Q, et al. Changes of gut microbiome and metabolome in the AOM/DSS mouse model of colorectal cancer with FLASH radiation[J]. Radiat Med Prot, 2023, 4(1): 1-10. DOI:10.1016/j.radmp.2023.02.001 |
| [20] |
Wang Z, Gu M, Zhang S, et al. Radiation-induced gut microbiota dysbiosis and Treg cells dysfunction: Mechanistic insights and clinical implications-A review[J]. Life Sci, 2025, 379: 123844. DOI:10.1016/j.lfs.2025.123844 |
| [21] |
Cui M, Xiao H, Li Y, et al. Faecal microbiota transplantation protects against radiation-induced toxicity[J]. EMBO Mol Med, 2017, 9(4): 448-461. DOI:10.15252/emmm.201606932 |
| [22] |
Zhao TS, Xie LW, Cai S, et al. Dysbiosis of gut microbiota is associated with the progression of radiation-induced intestinal injury and is alleviated by oral compound probiotics in mouse model[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2021, 11: 717636. DOI:10.3389/fcimb.2021.717636 |
| [23] |
Li Y, Sui L, Zhao H, et al. Differences in the establishment of gut microbiota and metabolome characteristics between Balb/c and C57BL/6J mice after proton irradiation[J]. Front Microbiol, 2022, 13: 874702. DOI:10.3389/fmicb.2022.874702 |
| [24] |
Gao F, Cheng W, Ma Y, et al. Electron-beam FLASH whole brain irradiation induced a unique changes of intestinal flora[J]. Mol Med, 2025, 31(1): 165. DOI:10.1186/s10020-024-01053-w |
| [25] |
张俊, 许志明, 程馨阳, 等. 全腹超高剂量率照射对小鼠肠道菌群的改变[J]. 中华放射肿瘤学杂志, 2025, 34(8): 811-818. Zhang J, Xu ZM, Cheng XY, et al. Study of the changes of intestinal microbiota in mice by whole-abdominal ultra-high dose rate irradiation[J]. Chin J Radiat Oncol, 2025, 34(8): 811-818. DOI:10.3760/cma.j.cn113030-20240624-00247 |