2026, Vol. 46
2. 南华大学衡阳医学院 军事科学院研究生协作培养基地, 衡阳 421001
2. Graduate Collaborative Training Base of Academy of Military Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, Hengyang 421001, China
DNA是传递遗传信息的主要载体，持续受到各种内源性和外源性损伤威胁。电离辐射可诱导多种i类型DNA损伤，其中最为严重的是DNA双链断裂(double-strand breaks, DSB)，可能导致基因组不稳定、细胞死亡及癌变[1]。因此，DSB修复能力是细胞放射敏感性的重要生物学基础[2-3]。同源重组(homologous recombination, HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)是DSB修复经典作用途径，二者与细胞周期调控协同作用，共同维护基因组稳定性。HR主要发生于S/G2期，而NHEJ发生于整个细胞周期，尤其在G1期起主导作用[4]。探索细胞周期对DSB损伤与修复的动态影响，对于理解放射敏感性差异及基因组不稳定性具有重要意义。
细胞核具有高度区室化结构，核仁作为最大亚结构，其功能与细胞周期及DNA损伤应激密切关联[5]，如RPA、GADD45等核仁蛋白能够直接参与DNA损伤修复过程[6-7]。但是，目前对不同周期时相细胞核仁中的DSB修复动态仍缺乏研究。传统的细胞周期同步化技术可能干扰正常的DNA复制，难以反映生理状态下的修复过程[8]。近年来，荧光泛素化细胞周期指示物(fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator, Fucci)的发展为这一挑战提供了革命性的解决方案[9]。Fucci系统通过荧光标记细胞周期核心蛋白，无需外力干预即可在活细胞中直观地分析G1、S和G2/M期细胞，为研究细胞周期依赖的DNA损伤修复提供了理想工具。本研究旨在利用tFucci(CA)5细胞周期报告系统对不同周期时相的细胞受电离辐射损伤后，细胞核及核仁、核质区室DSB损伤效应及其修复动态进行探索。
材料与方法1. 试剂与仪器：DMEM培养基和胰蛋白酶购自美国GIBCO公司；胎牛血清购自上海ExCellBio公司；青-链霉素溶液购自美国Hyclone公司；磷酸盐缓冲液(PBS)购自天津灏洋华科有限公司；tFucci(CA)5和transposase质粒购自美国Addgene公司；灭瘟素S盐酸盐购自美国Selleck公司；Transfection Reagent转染试剂购自法国Polyplus公司；荧光封片剂(不含DAPI)、兔抗人核磷蛋白(NPM1)抗体、兔抗人cyclin A抗体、驴抗兔Alexa Fluor® 405抗体和羊抗鼠Alexa Fluor® 647抗体均购自英国Abcam公司；鼠抗人Cyclin D抗体、鼠抗人Cyclin A抗体和鼠抗人Cyclin B抗体购自美国Santa Cruz公司；鼠抗人β-肌动蛋白抗体购自美国Proteintech公司；羊抗鼠辣根过氧化物酶标记IgG抗体购自美国KPL公司；鼠抗人γ-H2AX抗体购自德国Millipore公司。流式细胞仪BD FACSAriaTMⅢ购自美国BD公司；ImageQuant AI800型超敏化学发光成像仪购自美国GE公司；X-light V3共聚焦显微镜系统购自日本尼康公司；60Co γ射线源由军事科学院军事医学研究院提供。
2. 细胞株：HT29结直肠癌细胞系购自上海吉凯基因医学科技有限公司，用含10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养基在37℃、含5% CO2、饱和湿度的恒温培养箱内培养。
3. tFucci(CA)5细胞周期报告系统的工作原理：通过AzaleaB5和h2-3两种荧光蛋白分别标记Cdt1和Geminin蛋白的泛素化降解片段，Cdt1和Geminin分别受到两种E3泛素化连接酶[CRL4S E3泛素连接酶(CUL4)和后期促进复合体(APC)] 的时序调控，从而实现不同周期时相细胞中Cdt1和Geminin的双相检测。该报告系统将AzaleaB5(红色荧光)融合到hCdt1(1/100)Cy(-)片段上，该片段能被CUL4泛素化降解；h2-3(绿色荧光)融合到hGem(1/110)片段上，该片段能被APC泛素化降解。在G1期，APC活性高而CUL4活性低，因此，h2-3-Geminin融合蛋白被APC降解致绿色荧光消失，AzaleaB5-Cdt1不断累积使细胞呈现红色荧光；进入S期后CUL4的活性逐步增加，并且APC迅速失活，致使AzaleaB5-Cdt1融合蛋白被CUL4降解，红色荧光迅速消失，h2-3-Geminin融合蛋白不断累积使细胞呈现绿色荧光；而在G2/M期CUL4及APC活性低，因此AzaleaB5-Cdt1融合蛋白及h2-3-Geminin融合蛋白不断累积，细胞出现红、绿叠加的黄色或橙色荧光信号(图 1)。
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图 1 tFucci(CA)5细胞周期报告系统的工作原理 Figure 1 Schematic diagram showing the operation principle of the tFucci(CA)5 cell cycle reporter system |
4. 表达tFucci(CA)5质粒的稳定细胞系构建：将HT29细胞按3×105个/孔接种于6孔板培养24 h，转染前1~2 h将6孔板中的培养基换为无抗培养基，按照每孔2.5 μg质粒+200 μl转染缓冲液+5 μl转染试剂配制转染体系，其中加入的tFucci(CA)5和transposase质粒质量比例为3∶1。转染工作液于室温静置10 min后滴入6孔板中，并于6 h后换为完全培养基。转染后48 h用含50 μg/ml灭瘟素S盐酸盐的培养基进行阳性细胞筛选，持续筛选3 d后用含10 μg/ml灭瘟素S盐酸盐的培养基进行维持培养。通过有限稀释法进一步挑选tFucci(CA)5表达良好的单细胞克隆。荧光显微镜下观察：G1期细胞呈红色荧光，S期细胞呈绿色荧光，G2期细胞呈红绿叠加的黄色荧光。
5. 流式细胞术筛选不同周期细胞：将HT29 tFucci(CA)5细胞经0.25%胰酶消化后，900×g离心3 min后收集细胞，用1 ml预冷PBS重悬洗涤细胞后，使用FACSAriaTMⅢ流式细胞仪收集并分析细胞。h2-3通过488 nm激光激发，其发射光通过530/30 BP收集；AzaleaB5通过561 nm激光激发，其发射光通过610/20 BP收集。根据所发出的荧光进行分群并收集，用于后续验证实验。
6. Western blot实验：用放射免疫沉淀测定法(RIPA)裂解缓冲液裂解细胞样本提取总蛋白。采用湿转法90 V恒压转膜，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液(含1‰Tween 20的Tris缓冲盐水)室温封闭2 h，使用鼠抗人Cyclin D抗体、鼠抗人Cyclin A抗体和鼠抗人Cyclin B(1∶1 000稀释)，鼠抗人β-肌动蛋白抗体(1∶5 000稀释)检测目标蛋白，4℃孵育过夜，用TBST缓冲液洗膜3次，每次5 min。羊抗鼠辣根过氧化物酶标记IgG抗体(1∶5 000稀释)室温孵育2 h，TBST缓冲液洗膜3次，每次5 min。用增强型化学发光试剂对目的条带进行显影，通过超敏化学发光成像仪自动曝光条带记录结果。
7. 免疫荧光实验：在6孔板中放入无菌盖玻片，并接种5×105个/孔的HT29 tFucci(CA)5细胞，使用60Co γ射线对HT29 tFucci(CA)5细胞进行2 Gy照射，剂量率为52.83 cGy/min。照射后不同时间点用2 ml组织固定液固定细胞，室温15 min。弃去组织固定液，用PBS洗涤细胞3次后，加入0.4% Triton-PBS缓冲液冰上破膜10 min。用含5% BSA及0.3% Triton-PBS溶液封闭液室温封闭2 h，而后在4℃湿盒中孵育一抗过夜：Cyclin D抗体和Cyclin A抗体均1∶100稀释，NPM1抗体1∶100稀释，γ-H2AX抗体1∶500稀释。一抗反应结束后将盖玻片用PBST缓冲液洗涤3次，再用PBS洗涤1次。而后将驴抗兔Alexa Fluor® 405和羊抗鼠Alexa Fluor® 647荧光二抗用1% BSA 0.3% Triton-PBS封闭液按1∶200稀释，室温避光孵育2 h，洗涤二抗后用荧光封片剂封片，最后用X-light V3共聚焦显微镜系统拍照。开启四道激发荧光通道获取图片：365 nm(Cyclin A和NPM1)、488 nm(h2-3)、594 nm(AzaleaB5)，640 nm(Cyclin D和γ-H2AX)。
8. γ-H2AX foci的计数方法：进行共聚焦荧光图像分析时，根据tFucci(CA)5报告系统的红色与绿色荧光信号，将细胞分类为G1期、S期或G2/M期。然后，利用标记蓝色荧光的核仁蛋白NPM1信号划定核仁区域。计数位于核仁区内及核质区的γ-H2AX foci，紧邻核仁边缘的γ-H2AX foci计入核仁区。各组每个细胞周期时相随机分析50个细胞。
9. 统计学处理：应用SPSS 26.0和Graphpad Prism 9.0软件进行统计学分析。数据在进行正态性检验及方差齐性检验后，符合正态分布的数据以x±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验(方差齐)，多组间两两比较采用单因素方差分析结合LSD检验(方差齐)。P < 0.05为差异具有统计学意义。
结果1. tFucci(CA)5细胞周期报告系统的构建及鉴定：本研究利用该系统建立了稳定表达tFucci(CA)5的HT29细胞系(图 2A)。为了验证该细胞周期报告系统的有效性，首先，利用流式细胞术对HT29 tFucci(CA)5细胞系进行阳性细胞分选，发现可清晰区分红色荧光、绿色荧光、红/绿双荧光3种亚群。通过Western blot实验检测3群细胞中周期标志蛋白表达水平，结果显示，红色荧光的细胞群仅表达Cyclin D(G1期标志物)，而Cyclin A及Cyclin B表达水平极低；绿色荧光的细胞群表达Cyclin A(S期标志物)；红/绿双荧光细胞群表达Cyclin B(G2/M期标志物，图 2B)。其次，为了更直观地对各周期时相细胞进行观察，利用免疫荧光技术对Cyclin D(Alexa Fluor 405，蓝色)和Cyclin A(Alexa Fluor 647，远红外)蛋白进行组合标记，结果显示，G1期细胞核Cyclin D染色阳性，S期细胞核Cyclin A染色阳性，G2/M期细胞核Cyclin A蛋白荧光强度低于S期细胞，且Cyclin D染色阴性(图 2C)。综上表明，tFucci(CA)5荧光周期报告系统可正确地指示G1、S、G2/M期等不同周期时相，细胞模型制备成功。
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注：P1区域为活细胞群；P2区域为红色荧光阳性细胞群；P3区域为绿色荧光阳性细胞群；P4区域为红绿双荧光阳性细胞群 图 2 HT29 tFucci(CA)5稳定细胞系构建及验证 A. HT29 tFucci(CA)5稳定细胞系的构建；B. 流式细胞术分选不同周期时相细胞后，Western blot检测CyclinD、CyclinA、CyclinB等细胞周期标志分子；C. HT29 tFucci(CA)5细胞中经免疫荧光实验标记细胞周期标志蛋白Cyclin D(Alexa Fluor 647，远红外)、Cyclin A(Alexa Fluor 405，蓝色) Figure 2 Establishment and validation of the HT29 tFucci(CA)5 stable cell line A. Establishment of the HT29 tFucci(CA)5 stable cell line; B. Detection of cell cycle marker molecules, including Cyclin D, Cyclin A, and Cyclin B, using Western blot following flow cytometry-based sorting of cells in different cycle phases; C. Immunofluorescence labeling of cell cycle marker proteins Cyclin D (Alexa Fluor 647, far-red) and Cyclin A (Alexa Fluor 405, blue) in HT29 tFucci(CA)5 cells |
2. 放射对不同周期时相细胞核及核质、核仁区室DSB损伤效应的影响：图 3展示2 Gy照射后0.5、4、12 h及0 Gy对照组对HT29 tFucci(CA)5细胞系γ-H2AX和NPM1的蛋白免疫荧光结果。由于核仁中的核糖体DNA(rDNA)发生DSB损伤后，会趋向于核仁外周形成“核仁帽”结构[10]，注：利用红、绿荧光用于区分不同的细胞周期时相，远红外(紫色)荧光标记γ-H2AX用于衡量DSB损伤水平，蓝色荧光用于标记核仁蛋白NPM1用于划分核仁区，每个时间点随机分析不同周期的细胞各50个因此，数据统计时将NPM1标记区域内或紧邻其边缘位置的γ-H2AX foci计入核仁区室的DSB损伤。对细胞核进行分析，发现在照射后所有观测时间点(0.5、2、4、8、12、24 h)，G1期细胞γ-H2AX foci数量均显著低于S期和G2期细胞(G1 < S/G2，F=13.89~186.10，t=3.37~17.12，P < 0.05)，而S期与G2期细胞γ-H2AX foci数量差异无统计学意义(P>0.05)，核质区室与细胞核分析结果基本一致(图 4A)。而对核仁γ-H2AX foci的分析结果显示出与细胞核、核质区室不完全一致的分布情况：照射后0.5 h，γ-H2AX foci数量以G1期细胞为最低，S期细胞次之，而G2期细胞为最高(G1 < S < G2，F=3.31~187.70，t=4.13~18.46，P < 0.05)，这一分布趋势持续至照射后2 h。照射后24 h，核仁中γ-H2AX foci大幅度降低，表明大部分DSB被修复，但仍有少量γ-H2AX foci残留。此时，G1期细胞的核仁区域foci残留数量比S期少(G1 < S，t=2.57，P < 0.05)，而S期与G2期细胞间的残留foci数量则差异无统计学意义(P>0.05)(图 4C)。表明不同周期时相细胞中核质、核仁区室对放射致DNA损伤的效应存在一定差异，核仁区室对放射致DSB的响应具有更强的周期依赖性。
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注：利用红、绿荧光用于区分不同的细胞周期时相，远红外(紫色)荧光标记γ-H2AX用于衡量DSB损伤水平，蓝色荧光用于标记核仁蛋白NPM1用于划分核仁区，每个时间点随机分析不同周期的细胞各50个 图 3 2 Gy照射后不同时间点细胞核与核仁、核质区室DSB损伤水平 Figure 3 Damage levels of DSBs in the nucleus, nucleolar compartment, and nucleoplasmic compartment at different time points after 2 Gy irradiation |
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注：F=3.31~187.70，P＜0.05；a 与G1期相比，t =2.57~16.27，P＜0.05；b与S期相比，t =2.76~18.46，P＜0.05 图 4 2 Gy γ射线照射后不同细胞周期时相细胞核(A)与核质(B)、核仁区室(C)γ-H2AX foci数量统计分析 Figure 4 Statistics of the quantities of γ-H2AX foci in the nucleus (A), nucleoplasmic compartment (B), and nucleolar compartment (C) in different cell cycle phases after 2 Gy γ-ray irradiation |
3. 不同周期时相细胞照射后核质与核仁区室DSB损伤修复动力学差异：为了量化评估不同周期细胞中DSB损伤修复效率，以0.5 h γ-H2AX foci数量作为初始DSB损伤量(设为100%)，分析核仁与核质DSB修复动力学是否存在差异。DSB修复动力学分析结果显示，细胞核及核质、核仁区室DSB修复模式具有一定的周期特征：G1期细胞中DSB修复动力学在细胞核及核质、核仁之间未观察到明显差异，表明在NHEJ主导的修复模式下，三者DSB修复效率趋于一致(图 5A)。但在S期和G2期细胞中，核仁内的DSB修复效率显著高于细胞核及核质，表现为在照射后中后期(4~12 h)，核仁内γ-H2AX foci的清除速率明显快于细胞核及核质(F=5.50~25.10，核仁与核质相比，t=2.41~8.55，P＜0.05；核仁与细胞核相比，t =2.61~4.42，P＜0.05)。在DSB修复末期(24 h)，S期和G2期细胞中核仁内的γ-H2AX foci残留率(相对于0.5 h的百分比)显著低于细胞核及核质(F=18.25、29.48，P < 0.05；核仁与核质相比，t =4.57、7.02，P＜0.05；核仁与细胞核相比，t =2.62、3.63，P＜0.05，图 5B，C)。这表明相比于细胞核及核质区室，S和G2期细胞核仁对放射诱导的DSB损伤具有更高的修复效率。
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注：F=5.50~29.48，P＜0.05；a核仁与核质相比，t =2.41~8.55，P＜0.05；b 核仁与细胞核相比，t =2.62~4.66，P＜0.05；c 细胞核与核质相比，t =2.61~4.12，P＜0.05 图 5 G1期(A)、S期(B)、G2期(C)细胞照射后0~24 h不同核区室修复动力学曲线 Figure 5 DSB repair kinetic curves of the nucleus, nucleoplasmic compartment, and nucleolar compartment of cells in G1 (A), S (B), and G2 (C) phases at 0-24 h after irradiation |
讨论
DNA损伤与修复研究是放射生物学领域的重要研究方向，Fucci系统能够对不同周期细胞进行实时动态观察，是探索DNA修复与细胞周期相互作用的有力工具[11-12]。本研究利用tFucci(CA)5周期报告质粒建立了HT29 tFucci(CA)5细胞模型，并利用该模型分析了不同周期时相细胞中核仁、核质对放射致DSB损伤的响应，初步发现核仁在DSB损伤和修复过程中不同于核质的周期动态规律。
细胞周期调控与DNA损伤修复是构成DNA损伤应答反应的重要环节，二者受到细胞内一系列分子反应的精密调节，彼此独立又相互协同：一方面表现为不同周期细胞中，因DNA含量和染色质形态的不同，DNA分子对放射损伤的敏感程度存在明显差异；另一方面表现为，细胞对DSB修复方式的选择受细胞周期依赖性激酶活性的调节，与周期时相密切相关[13-14]。过去，对不同细胞周期的区分多依赖DNA含量分析或化学药物处理(如胸腺嘧啶核苷双阻断法)，这些方法不能精确区分各个周期时相，并可能引入额外的应激信号干扰内在的修复过程[8, 15-16]。在DNA损伤修复相关研究中，传统的细胞周期同步化技术无法实现在正常培养条件下对不同周期时相细胞进行直接观察和分析。本研究采用tFucci(CA)5双荧光报告质粒在HT29细胞中建立了细胞周期报告模型，实现了在正常培养的HT29细胞中同时对G1、S和G2期等不同周期时相进行精准识别与追踪[17]，因此，本研究为分析不同周期细胞中DNA损伤修复相关研究提供了有效工具。
核仁是rDNA进行活跃转录的核心区域，是细胞核内最大的亚细胞结构和DNA损伤感受器。放射引起的核仁rDNA损伤能诱导核仁应激反应，导致核仁结构改变(核仁帽形成)和rDNA转录活性抑制，是参与DNA损伤修复的重要反应过程[18]。既往关于DNA损伤修复效应和机制的研究多关注细胞核或核质的作用，而核仁在不同周期细胞中对DSB损伤修复的效应目前鲜见报道。本研究利用tFucci(CA)5报告系统分析了电离辐射对不同周期细胞中细胞核及核质、核仁区室结构的DSB损伤效应，发现细胞核与核质表现为G1 < S/G2期，而核仁则表现为G1 < S < G2期，核仁中DSB损伤具有更强的细胞周期依赖性。现有资料表明，人体细胞中rDNA在整个细胞核DNA中占比极低(不超过0.4%)[19]。本研究发现，细胞中核仁DSB损伤数量与核质区基本持平，提示核仁rDNA对放射损伤更为敏感。有研究认为，rDNA中包含的高度重复串联序列和rDNA高转录活性状态使核仁成为DNA损伤和基因组不稳定的“脆性位点”[20]，这可能是放射损伤反应中核仁rDNA DSB损伤占比较高的重要原因。
Liu等[21]研究发现，核仁内存在局部监查机制维持rDNA稳定性。而在不同周期时相细胞中rDNA修复动态是否与核质DNA修复动态存在差异目前仍然未知。本研究将照射后0.5 h γ-H2AX foci数量作为起始DSB损伤水平，通过多个时间点数据分析对核质、核仁区室DSB修复动力学进行了比较。首次发现S期和G2期细胞中，照射后4 h开始核仁区域的DSB修复效率显著高于核质区域，而G1期两者无明显差异。据目前所知，电离辐射损伤后早期细胞主要通过非同源性末端接合(NHEJ)途径对DSB损伤进行快速修复，而中后期(通常为4~6 h之后)开始启动相对缓慢、高保真的HR修复途径[22-23]。据此推测，核仁区室相比于核质区可能具有更高效的HR修复效率，也意味着HR修复对于rDNA损伤修复具有更重要的意义。
综上所述，本研究建立了一种稳定表达细胞周期报告系统的细胞模型，应用该细胞模型对不同细胞周期时相中核质、核仁区室DNA损伤修复效应进行分析，发现核仁对放射致DSB损伤的响应及修复动态有别于核质区域，且具有显著细胞周期依赖性。该研究为研究DNA损伤修复“时-空”协同作用提供了新的工具，同时为进一步探索放射敏感性调控机理提供了新的视角。
利益冲突 无
作者贡献声明 吴磊负责实验实施、数据分析、论文撰写；马佳楠负责实验样品制备与数据分析；王婧璇、孙金诺、莫云琪、蔡丹负责数据收集与分析；王治东负责论文修改；沈丽萍指导实验设计、论文修改
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