乳腺癌是女性常见恶性肿瘤，放疗是其关键治疗手段^[1]，但部分患者出现辐射抵抗导致复发转移^[2]。近年来，研究发现乳酸化作为一种新型蛋白质翻译后修饰，在肿瘤代谢重编程和辐射抵抗中起重要作用^[3-4]，它可通过调控基因表达及信号通路影响辐射敏感性^[5]，例如通过修饰DNA损伤修复蛋白或影响免疫微环境来降低疗效^[6-7]。因此，研究乳酸化机制对揭示辐射抵抗及开发增敏策略具有重要意义。

HIST2H2BE是组蛋白H2B家族核心成员，在染色质结构与基因调控中起基础作用^[8-9]。近年来研究表明，组蛋白乳酸化逐渐成为肿瘤研究的新热点^[10]。本研究通过分析乳腺癌患者放疗前后转录组数据，筛选差异基因并与乳酸化基因交集，发现HIST2H2BE在乳腺癌中高表达。进一步通过细胞实验探究其乳酸化在辐射抗性中的具体机制，旨在揭示组蛋白修饰在放疗抵抗中的新功能，并为逆转辐射抵抗提供潜在靶点。

1.数据来源：乳腺癌放射治疗反应的基因表达谱来自GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) 中的GSE59733，该数据集包含19个患者样本，其中有9例患者均有辐射前后的配对数据，故选取这9例患者数据进行差异基因分析。

2.主要试剂与仪器：actin抗体购自美国Proteintech公司，Flag抗体购自美国Sigma公司，泛乳酸化(Pan-Kla)抗体购自杭州景杰生物公司。二抗羊抗兔IgG (H + L)-HRP和羊抗鼠抗体(H+L)-HRP偶联物购自加拿大Bio-Rad公司。DMEM培养基购自美国Thermo Fisher公司，CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司；免疫印迹化学发光溶液(ECL)购自美国Thermo Fisher公司。细胞培养箱购自美国Thermo公司；流式细胞仪(ACEA NovoCyte) 购自杭州艾森生物有限公司；Western blot电泳仪购自加拿大Bio-RAD公司；全自动酶标仪购自美国Thermo公司；X射线辐照仪(X-RAD 320IX)购自美国Precision公司。

3. 细胞培养、受照条件及分组：乳腺癌细胞系MCF-7购自中国科学院北京细胞库。在37℃、5% CO₂条件下，使用含10%胎牛血清和1% 100×青链霉素的DMEM培养基培养细胞。设置10 cm × 10 cm照射野，源靶距50 cm，以3 Gy/min的剂量率给予8 Gy X射线照射。实验分为①Flag空载对照组、Flag-HIST2H2BE组、Flag-HIST2H2BE+IR组。② Flag-HIST2H2BE+IR组、Flag-HIST2H2BE-K31R+IR组、Flag-HIST2H2BE-K44R+IR组、Flag-HIST2H2BE-K35R+IR组。③ shHIST2H2BE+Flag空载对照组、shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE组、shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE-K35R组、shHIST2H2BE+Flag+IR组、shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE+IR组、shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE-K35R+IR组。

4. CCK-8法检测细胞活力：MCF-7细胞以2×10³个/孔接种于96孔板中，48 h每孔加入90 μl完全培养基和10 μl CCK-8试剂，孵育3 h后用全波长酶标仪在450 nm波长处记录吸光度值A。计算细胞增殖率的公式为：细胞活力(%) = (实验组A值-空白A值) / (对照组A值-空白A值) × 100%。

5. 流式细胞术检测：细胞以1.5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，照后72 h收集细胞培养液。4℃，4 500 r/min，离心半径85 mm，离心5 min，弃上清；1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，加入500 μl的0.25%胰蛋白酶于37℃细胞培养箱中消化3 min，1 ml完全培养基终止消化；4℃，2 000 r/min，离心半径85 mm，离心5 min，收集细胞；弃上清，200 μl PBS重悬细胞，20 μl台盼蓝染色液染色3 min，采用流式细胞仪进行检测，每次上样20 000个细胞，采用SSC-H/FSC-H通道检测细胞死亡率。

6. 细胞转染：将细胞在培养皿中进行铺板，使次日转染时的密度约为50%。用Lipofectamin 2000转染Flag、Flag-HIST2H2BE、Flag-HIST2H2BE-K31R、Flag-HIST2H2BEK35R、Flag-HIST2H2BE-K44R质粒，转染液配置为A液：10 μl Lipofectamine 2000和250 μl基础培养基；B液：5 μg质粒和250 μl基础培养基。A、B液分别静置5 min，B液逐滴加入到A液中，轻轻混匀后静置15 min，逐滴滴进培养皿中，混匀后在37℃、5% CO₂细胞培养箱中继续培养，6 h后加入10%胎牛血清，24 h后更换完全培养基，转染48 h后收细胞鉴定转染效率以及进行后续实验。

7.蛋白质免疫印迹：细胞经刮取收集后，按沉淀量加入适量放射免疫沉淀法裂解缓冲液(RIPA)，于4℃条件下裂解30 min。总蛋白样品经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)80 V 30 min电泳，待蛋白Marker分离后再用110 V 90 min电泳分离，后采用100 V 100 min转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)上。后于室温条件下，采用6%脱脂牛奶-TBST溶液封闭1 h。之后，加入一抗1∶5 000，4℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次5 min；再加入二抗1∶10 000，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，在膜上均匀滴加现配的ECL，通过化学发光成像系统进行曝光，获得最终图像。

8. 免疫共沉淀实验：MCF-7细胞用Lipofectamin 2000转染空载体(Flag)、Flag-HIST2H2BE及各点突变体质粒(Flag-HIST2H2BE-K31R、Flag-HIST2H2BE-K35R、Flag-HIST2H2BE-K44R)。转染48 h后8 Gy照射细胞，继续培养24 h后收集样品。使用NP40裂解液提取总蛋白，取等量蛋白与Flag抗体于4℃孵育过夜，随后加入10 μl Protein A/G磁珠捕获免疫复合物。经洗涤后，加入1×SDS上样缓冲液解离蛋白。通过Western blot分析，以泛乳酸化抗体检测沉淀中HIST2H2BE的乳酸化水平。

9.统计学处理：采用SPSS 18.0软件进行统计分析，用Graphpad Prism 8.0软件作图。两组独立样本之间采用独立t检验，多组独立样本间采用单因素方差分析。实验数据表示为x±s。P < 0.05为差异具有统计学意义。

1. 乳腺癌放疗患者中乳酸化相关基因的筛选：示于图 1，从GSE59733中获取9例乳腺癌患者放疗前后的基因表达谱矩阵，用limma包进行差异分析，以| log2FC |≥1，P < 0.05为条件进行筛选，得到135个基因，126个基因上调，9个基因下调。将这135个差异基因与乳酸化相关基因^[11]取交集，得到HIST2H2BE基因。在TCGA数据库中，与正常乳腺组织相比，HIST2H2BE的mRNA水平在乳腺癌里高表达，使用来自HPA数据库(https://www.proteinatlas.org/)的免疫组织化学结果验证了HIST2H2BE在乳腺癌和正常乳腺组织中的蛋白表达水平，HIST2H2BE在乳腺癌中的蛋白表达水平高于正常乳腺组织。

注：a与正常组织相比，t=11.04，P＜0.05 图 1 乳腺癌放疗患者中乳酸化相关基因的筛选  A-B. 放疗前后差异基因火山图及热图；C.TCGA数据库中HIST2H2BE在正常乳腺组织乳腺癌和中的mRNA表达；D. HPA数据库中HIST2H2BE在正常组织和肿瘤组织中的免疫组织化学结果 Figure 1 Selection of lactylation-associated genes in breast cancer patients undergoing radiotherapy  A-B. Volcano plot and heatmap showing differentially expressed genes before and after radiotherapy; C. mRNA expression of HIST2H2BE in normal breast tissue and breast cancer based on the TCGA database; D. Immunohistochemical results of HIST2H2BE in normal and tumor tissues from the HPA database

2. 电离辐射影响乳腺癌的乳酸化水平：为探究电离辐射对乳腺癌的整体乳酸化水平的影响，对MCF-7分别照射0、2、4、8、12 Gy，结果示于图 2。结果显示，照后8 Gy细胞的乳酸化水平最高，因此后续实验将在8 Gy的剂量下进行。分别收集8 Gy照射后0、4、8、12、24、48 h的细胞，乳腺癌细胞的乳酸化水平随着时间慢慢增高，结合照后48 h内乳酸化的水平变化情况，24 h作为后续研究的固定时间点，因为24 h已观察到稳定且显著的乳酸化水平升高，表明生物学反应充分，并且选择24 h有利于在细胞活力保持良好、形态稳定的状态下进行后续的转染等实验。

图 2 不同剂量X射线(A)照后与8 Gy照后不同时间(B)对细胞乳酸化水平的影响 Figure 2 Effects of different X-ray radiation doses (A) and different times under 8 Gy post-irradiation (B) on the lactylation levels of breast cancer cells

3. 电离辐射引起HIST2H2BE的K35位点发生乳酸化：结果示于图 3，为了研究电离辐射是否可以让HIST2H2BE本身发生乳酸化，在MCF-7细胞中转染Flag-HIST2H2BE质粒，并施加8 Gy电离辐射处理，结果显示，电离辐射可引起HIST2H2BE乳酸化水平增加。通过Deepkla(http://lin-group.cn/server/DeepKla/)预测HIST2H2BE发生乳酸化的位点，选取PTMscores评分分数较高的3个位点K35(评分分数为93.9%)、K31(评分分数为89.42%)、K44(评分分数为73.17%)进行验证，将赖氨酸突变为精氨酸，消除乳酸化修饰位点，并施加8 Gy电离辐射处理，得到Flag-HIST2H2BE-K31R+IR、Flag-HIST2H2BE-K44R+IR、Flag-HIST2H2BE-K35R+IR组，通过免疫沉淀实验，K35R组乳酸化降低，说明K35是HIST2H2BE乳酸化的位点。

图 3 电离辐射对HIST2H2BE乳酸化的影响(A)及K35作用位点的确定(B) Figure 3 Effects of ionizing radiation on HIST2H2BE lactylation (A) and the identification of the K35 site (B)

4. HIST2H2BE发生乳酸化并促进肿瘤的生长：为探究HIST2H2BE乳酸化是否会影响乳腺癌的细胞活力与死亡情况，在MCF-7细胞中构建了shHIST2H2BE细胞模型，再将Flag、Flag-HIST2H2BE、Flag-HIST2H2BE-K35R质粒转染到细胞中。通过CCK-8实验检测各组的细胞活力情况，结果列于表 1，与shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE组相比，shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE-K35R组细胞活力降低(t=7.57，P < 0.05)；与shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE+IR组相比，电离辐射后shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE-K35R+IR组细胞活力更低(t=8.91，P < 0.05)。如表 2，通过台盼蓝流式细胞术实验检测各组的细胞死亡率，结果显示与shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE组相比，shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE-K35R组促进了细胞死亡(t=20.15，P < 0.05)，与shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE+IR组相比，shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE-K35R+IR组死亡率更高(t=49.46，P < 0.05)。

表 1(Table 1)

表 1 CCK-8检测不同组别的细胞活力(%, x±s) Table 1 Cell viability in different groups determined using CCK-8 (%, x±s) 组别 样本数 细胞活力 shHIST2H2BE+Flag组 3 100.00±1.35 shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE组 3 116.08±5.75 shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE-K35R组 3 82.49±5.11a shHIST2H2BE+Flag+IR组 3 61.10±0.91 shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE+IR组 3 88.89±8.17 shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE-K35R+IR组 3 34.66±6.67b 注：a与shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE组相比，t=7.57，P < 0.05；b与shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE+IR组相比，t=8.91，P < 0.05

表 1 CCK-8检测不同组别的细胞活力(%, x±s) Table 1 Cell viability in different groups determined using CCK-8 (%, x±s)

表 2(Table 2)

表 2 台盼蓝流式细胞术检测不同组别的细胞死亡率(%, x±s) Table 2 Cell mortality in different groups detected using trypan blue staining combined with flow cytometry (%, x±s) 组别 样本数 细胞死亡率 shHIST2H2BE+Flag组 3 24.37±4.41 shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE组 3 14.34±1.12 shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE-K35R组 3 34.93±1.37a shHIST2H2BE+Flag+IR组 3 47.30±3.46 shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE+IR组 3 24.93±1.31 shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE-K35R+IR组 3 64.68±0.48b 注：a与shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE组相比，t=20.15，P < 0.05；b与shHIST2H2BE+Flag-HIST2H2BE+IR组相比，t=49.46，P < 0.05

表 2 台盼蓝流式细胞术检测不同组别的细胞死亡率(%, x±s) Table 2 Cell mortality in different groups detected using trypan blue staining combined with flow cytometry (%, x±s)

乳腺癌是威胁女性健康的首要恶性肿瘤，放疗在其综合治疗体系中占据关键地位，能有效降低局部复发率并提高生存率^[12]。然而，辐射抵抗是导致部分患者治疗失败和预后不良的主要原因^[13]。近年来，肿瘤代谢异常，特别是瓦博格效应导致的乳酸大量生成，被证实与肿瘤的恶性进展和治疗抵抗密切相关。乳酸不再被视为单纯的代谢废物，而是作为一种重要的信号分子，通过新型蛋白质翻译后修饰——乳酸化，参与基因表达调控^[4]。研究表明，乳酸化修饰可通过影响DNA损伤修复、细胞周期检查点、表观遗传状态以及肿瘤免疫微环境等多种途径，促进肿瘤细胞的辐射抵抗，如肿瘤微环境中高水平的乳酸可通过乳酸化修饰组蛋白，改变染色质开放性，进而调控一系列促进细胞存活和DNA修复的基因转录，最终削弱放疗效果^[14]。

本研究通过整合放疗前后的差异基因与乳酸化相关基因，筛选出与放疗患者预后相关且与辐射抗性相关的基因——HIST2H2BE。HIST2H2BE是核心组蛋白H2B家族的重要成员，在染色质压缩、核小体组装以及基因转录调控中发挥基础性作用^[15]。除了传统的功能，组蛋白变异体及其动态修饰(如乙酰化、甲基化)在肿瘤发生发展中的调控作用日益受到关注^[16]。本研究将HIST2H2BE置于乳腺癌放疗抵抗的背景下，通过一系列功能实验揭示了HIST2H2BE是电离辐射诱导的乳酸化修饰的关键靶点。

本研究证实，电离辐射能以剂量和时间依赖性的方式诱导乳腺癌细胞乳酸化水平升高。通过免疫共沉淀实验，证明了辐射可特异性促进HIST2H2BE蛋白发生乳酸化修饰。进一步利用位点预测和点突变技术，鉴定出K35是HIST2H2BE关键的乳酸化位点。功能实验表明，将K35突变为精氨酸(K35R)以消除乳酸化修饰后，乳腺癌细胞的活力显著降低，辐射诱导的细胞死亡增加。这些结果证明电离辐射通过诱导HIST2H2BE第35位赖氨酸发生乳酸化修饰，从而赋予乳腺癌细胞辐射抵抗性，促进其存活。

与既往研究相比，本研究的主要创新在于将HIST2H2BE乳酸化与乳腺癌放疗抵抗直接关联；通过点突变及分子对接验证其关键修饰位点K35；揭示了乳酸化修饰与细胞活力、死亡率及辐射敏感性的直接关系。然而，本研究也存在一定局限性。首先，体外实验结果仍需在临床样本及动物模型中进一步验证；其次，HIST2H2BE乳酸化的下游调控靶基因和具体信号通路尚待明确。未来的研究可结合ChIP-seq或RNA-seq分析，探索HIST2H2BE乳酸化导致乳腺癌辐射抵抗的作用机制。

综上所述，本研究系统揭示了HIST2H2BE在乳腺癌放疗抵抗中的关键作用。其K35位点的乳酸化修饰在辐射应答中起核心调控作用，促进细胞存活并削弱放疗敏感性。这一发现不仅拓宽了乳酸化在肿瘤代谢与表观遗传交叉调控中的研究视角，也为靶向HIST2H2BE乳酸化逆转乳腺癌放疗抵抗提供了潜在的分子靶点。

利益冲突  无

作者贡献声明  文映人负责实验设计、实验操作、数据整理、撰写论文；黄进、杨雨馨协助部分实验和论文整理；马淑梅指导实验设计和论文撰写