放射性组织损伤是临床放疗中常见的并发症^[1]。不同组织对辐射敏感程度不同，可分为器官特异性损伤或多器官损伤^[2]。然而，受照后由于组织样本获取不易，导致无法直观地判断组织是否发生损伤或损伤程度。因此，通过无创或微创途径(如尿液和外周血等)发掘受照后组织损伤的生物标志物，对于临床诊疗优化及预后判断具有一定的应用前景。

长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是指长度超过200个核苷酸、几乎不编码蛋白质的RNA分子^[3]。研究表明，lncRNAs的表达具有细胞和组织特异性，且在体液中(如血液、尿液等)稳定存在，不易被内源性RNA酶降解。因此，lncRNAs具备作为液体活检指标的潜力，可为辐射所致组织损伤的微创性动态监测与评估提供依据^[4-5]。近年来，已有研究报道lncRNAs可响应电离辐射，如辐射可以显著增加MALAT1表达，血浆中MALAT1可作为喉癌放疗患者发生不良反应的生物标志物^[6]。然而，有关lncRNAs的辐射响应特征是否具有组织特异性，以及组织水平与血浆及血细胞间的表达是否存在关联研究较少。本研究通过建立全身照射小鼠模型，旨在分析国内外已公开报道的具有辐射响应性的lncRNAs在多组织、血浆及血细胞中的表达变化，初步探索其作为辐射后组织损伤生物标志物的潜力。

1.文献检索：检索中国知网(CNKI)、万方、Web of Science及PubMed数据库2014年1月至2024年12月的中英文文献，采用中英文主题词结合自由词构建检索式，核心检索词涵盖“lncRNA”、“长链非编码RNA”及其同义词，并与“辐射效应”、“辐射损伤”、“radiation effects”、“radiation injuries”等电离辐射相关术语进行逻辑组配。文献纳入标准限定为：实验性研究文献；研究内容同时涉及电离辐射与lncRNAs。排除标准包括：①不同数据库间的重复性文献。②综述、会议摘要、撤稿及无法获取全文的文献。③lncRNAs的表达经确认与辐射诱导无关。④实验模型为非哺乳动物或细胞体系。

2.主要试剂与仪器：TRIzol试剂、PowerTrackTM SYBR Green Master Mix试剂盒均购自美国ThermoFisher公司。miRNeasy^® Serum/Plasma Kit血浆总RNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司；全血总RNA提取试剂盒购自杭州新景生物试剂开发有限公司；cDNA反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；High-Capacity cDNA反转录试剂购自美国Appliedd Biosystem公司。ABI Quant StudioTM 6 Flex实时荧光定量PCR仪购自美国Appliedd Biosystem公司；NanoDrop 2000紫外分光光度仪购自美国ThermoFisher公司。

3.实验动物及分组：6~8周龄C57BL/6J雌性及雄性野生型小鼠各12只，购于北京药康生物科技有限公司，合格证号：SCXK(京)2023，体质量17~24 g，饲养于中国疾病预防控制中心实验动物中心。每笼3只小鼠，SPF级饲料，温度为(22±2)℃，相对湿度为40%~60%，可自由进食进水，光线昼夜12 h交替，适应性饲养1周后开始照射。将小鼠采用简单随机化法分为对照组(0 Gy)和照射组(2、4、6 Gy)，每组雌、雄小鼠各3只。本研究通过中国疾病预防控制中心实验动物福利伦理审查(批准文号：中疾控辐动[2024]014号)。

4.小鼠全身照射及样品采集：使用北京师范大学钴源室⁶⁰Co γ源对小鼠进行单次全身照射，照射剂量为0、2、4、6 Gy，剂量率为1 Gy/min，源皮距2.9 m。照后48 h，通过眼眶取血方式收集小鼠血液样本，于EDTA抗凝的1.5 ml EP管中，随后对小鼠进行脱颈处死，收集心、肝、脾、肺、肾、空肠、大肠及性腺组织样本，于液氮中快速冷冻，保存于-80℃冰箱。在采集血液样本后30 min内，于4℃、3 000 r/min，离心10 min，离心半径84 mm，分离血浆与血细胞组分，分别转移至无RNase的1.5 ml EP管中，并立即进行总RNA提取。

5.总RNA提取与cDNA制备：采用TRIzol法提取样本总RNA；使用miRNeasy^®血清/血浆总RNA提取试剂盒提取小鼠血浆总RNA；使用全血总RNA试剂盒提取小鼠血细胞总RNA。所有样本的RNA浓度与纯度均通过紫外分光光度计测量吸光度(A₂₆₀/A₂₈₀)进行计算。采用cDNA反转录剂盒制备小鼠各组织样本cDNA；采用高效cDNA反转录试剂盒制备小鼠血浆及血细胞样本cDNA。

6.实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)：通过qRT-PCR技术，对通过文献筛选获得的19个候选lncRNAs的表达水平进行验证，所用引物序列见表 1。选用U6和Gapdh为双内参对各样本进行归一化，通过2^-△△Ct法计算照射组与对照组间lncRNAs的相对表达水平。所有样品均设立3个平行样，至少3次重复。

表 1(Table 1)

表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence 基因 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) U6 CTCGCTTCGGCAGCACA ACGCTTCACGAATTTGCGT Gapdh AGGTCGGTGTGAACGGATTTG GGGGTCGTTGATGGCAACA Dino GCAATGGTGTGCCTGACTAT TTCTGGCTTCCCAGAG Meg3 TCCTCACCTCCAATTTCCCCT GAGCGAGAGCCGTTCGATG Trp53cor1 AGTCCCTCCTGCCTCTATCTCC AAGTGTCAATGCTCTCGCTATGAAG Pvt1 ATCCACCCTCTTGTCTGATTTTCT AATCCACAGGGTTCAGGAAGTC LncPint GTAGTGTTCAGCCTCAAG GTGCATCAGCAAGGCAGAGA Snhg8 GACACAAGGTGGCTATGGTGCTG CATGGTGGTCGTCGCGCTAAC Snhg17 GCATACCCTCGTTCCTGTCTA ATGATTTTAGGGCTTTGTGAGA Morrbid TCTGAGAATGAGGGGACTGG TGTGCTGTGAAGATCCCAAG Neat1 CTTGTTCTGGGAGCATCATTCT GCTGGATGGAGGCTTGTTTAG Tmevpg1 GATGTGGGGATCTCGCTTGT GCTGTCGTCTTGTGTGCTAC Gas5 GGAGGATGAAGGCTTACGAGG CAGCCAGCCAAATGAACAAG Malat1 CTTGGCTTGTCAACTGCG CAAGGAATGTTACCGCACC Tug1 CATAGTATCATCTTCGGGTTAC CACAAAATGCATGTAGGTTC Dnm3os GGTCCTAAATTCATTGCCAGTTC ACTCAAGGGCTGTGATTTCC H19 CTAGGCTGGGGTCAAACAGG TTACGGTGGGTGGGATGTTG Anril CTGGCACCTGGGTAGATGTTCTTTG TGGATGGGAGTGTGGTCTTCGTAG Mir22hg ATGGCTCTGCTGTCCTCATCC GTCTTGTGCCTGCCTCTGTTG LncRNA Oip5-as1 AGCGAAGATGGCGGAGTGAG CACACGGTCCAGCACAAGTAC Particle CACTGCCCTCCGCCCTTC TCCTCTTCACTTCCGAGTCTGTAG

表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence

7.统计学处理：采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，用Graphpad Prism 10.1软件作图，服从正态分布的计量资料数据以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较方差齐则采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差(LSD)法，不服从正态分布或方差不齐的计量资料则采用秩和检验。采用一般线性回归分析判断单个lncRNA表达水平与照射剂量间的剂量-效应关系。P < 0.05为差异具有统计学意义。

1.辐射响应lncRNAs的筛选：利用中英文医学主题词表系统检索中英文数据库(包括中国知网、万方数据库、PubMed和Web of Science)，筛选与电离辐射响应相关的lncRNAs研究文献，示于图 1。初步检索共获得文献2 505篇，经剔除重复文献564篇、综述类文献94篇以及未涉及辐射响应机制的文献373篇后，符合纳入标准的文献共149篇(英文97篇，中文52篇)。进一步从纳入文献中提取并整理出19个在电离辐射暴露后表达发生显著变化的lncRNAs，经过National Center for Biotechnology Information数据库验证后证实这些lncRNAs在人类与小鼠之间具有同源性，列于表 1。

图 1 文献检索及筛选流程图 Figure 1 Flowchart for literature retrieval and screening

2.Dino、Trp53cor1及Pvt1为多组织损伤辐射响应lncRNAs的验证：结果示于图 2，与对照组(0 Gy)相比，Dino、Trp53cor1及Pvt1在受照后多个组织中表达均显著上调。Dino在除性腺外的7种组织中均显著上调(t=2.35~10.11, P＜0.05)，且在肝、脾、肺、肾和空肠中表现出剂量依赖性(R²=0.96、0.99、0.92、0.99、0.96，P < 0.05)，其中在空肠中的表达变化程度更为明显。Trp53cor1在8种检测组织中均显示表达上调，在除性腺外的7种组织中，各剂量组与对照组相比差异均具有统计学意义(t=2.56~11.74, P < 0.05)，并呈现一定的剂量依赖性(R²=0.96、0.97、0.96、0.90、0.82、0.93、0.89, P < 0.05)。Pvt1在心脏、脾、空肠、大肠和性腺中显著上调(t=2.22~12.98, P＜0.05)，其中在心脏和脾脏中观察到剂量依赖性改变(R²=0.97、0.89, P < 0.05)。

注: a与心脏0 Gy相比, t=2.61~7.24, P < 0.05; b与肝脏0 Gy相比, t=3.29~11.74, P < 0.05; c与脾脏0 Gy相比, t=2.56~12.98, P < 0.05; d与肺0 Gy相比, t=5.48~10.11, P < 0.05; e与肾0 Gy相比, t=3.76~6.62, P < 0.05; f与空肠0 Gy相比, t=2.24~6.90, P < 0.05; g与大肠0 Gy相比, t=2.35~6.36, P < 0.05; h与性腺0 Gy相比, t=2.56、2.22, P < 0.05 图 2 0~6 Gy 60Co γ射线照射小鼠后48 h各组织中Dino (A)、Trp53cor1 (B)、Pvt1 (C)表达水平变化 Figure 2 Changes in the relative expression levels of Dino (A), Trp53cor1 (B), and Pvt1 (C) in various tissues of mice at 48 h after 0-6 Gy 60Co γ-ray irradiation

3.Tmevpg1作为特定组织辐射响应性lncRNA的验证：对19个候选lncRNAs在多组织中的表达验证结果显示，lncRNA Tmevpg1在电离辐射后的表达变化表现出一定的组织特异性，其表达下调仅在肺和大肠中差异具有统计学意义，示于图 3。在肺组织中，与对照组(0 Gy)相比，各剂量照射组中Tmevpg1的表达均显著下调(t=-8.03~ -2.88, P < 0.05)，并呈现良好的剂量依赖性(R²=0.76, P < 0.05)。在大肠组织中，Tmevpg1在各剂量组均表达下调，但差异仅在2和4 Gy组中具有统计学意义(t=-2.89、-2.14, P < 0.05)。综上，Tmevpg1的辐射响应具有一定的组织特异性。

注: a与肺0 Gy相比, t=-8.03~-2.88, P < 0.05; b与大肠0 Gy相比, t=-2.89、-2.14, P < 0.05 图 3 0~6 Gy 60Co γ射线照射小鼠后48 h各组织中Tmevpg1表达水平变化 Figure 3 Changes in the relative expression levels of Tmevpg1 in various tissues of mice at 48 h after 0-6 Gy 60Co γ-ray irradiation

4.全身照射后小鼠血浆及血细胞中候选lncRNAs的验证：为评估候选lncRNAs作为全身照射诱导组织损伤的潜在生物标志物的可行性，本研究进一步检测了小鼠血浆及血细胞中目标lncRNAs的表达水平。结果示于图 4及表 2，与对照组(0 Gy)相比，血浆和血细胞中Dino及Trp53cor1的表达均显著升高(t=2.45~3.53、2.64~3.73、2.90~5.54、5.19~7.14, P＜0.05)，表现出剂量依赖性(R²=0.91、0.80、0.70、0.63，P < 0.05)，该趋势与组织水平上的验证相一致。Pvt1的表达模式在血浆与血细胞中存在一定的差异，在血浆中，仅2和4 Gy照射组中观察到其表达显著上调(t=3.11、3.83，P < 0.05)；而在血细胞中，各剂量组表达均显著下调，且呈现良好的剂量依赖性(t=-13.77~ -9.89，R²=0.86, P < 0.05)。照射后血浆与血细胞中Tmevpg1的表达均显著下调(Z=-2.88~-2.24、t=-11.12~ -8.32，P < 0.05)，且呈现良好的剂量依赖性(R²=0.81、0.74, P < 0.05)，该变化与肺组织中相一致。

注: a与血浆0 Gy相比, t=2.45~3.83、Z=-2.88~-2.24, P < 0.05;b与血细胞0 Gy相比, t=-13.77~7.14, P < 0.05 图 4 0~6 Gy 60Co γ射线照射小鼠后48 h Dino (A), Tr53cor1 (B), Pvt1 (C)及Tmevpg1 (D)分别在血浆及血细胞中表达水平变化 Figure 4 Changes in the relative expression levels of Dino (A), Tr53cor1 (B), Pvt1 (C), and Tmevpg1 (D) in plasma and blood cells of mice at 48 h after 0-6 Gy 60Co γ-ray irradiation

表 2(Table 2)

表 2 全身照射小鼠后48 h血浆及血细胞中lncRNAs表达水平与照射剂量的一般线性回归分析 Table 2 General linear regression analysis of lncRNA expression levels in plasma and blood cells of mice 48 h after whole-body irradiation with irradiation dose 样本来源 lncRNA R2 F值 P值 血浆 Dino 0.99 19.32 ＜0.001 Trp53cor1 0.66 24.57 ＜0.001 Pvt1 0.12 1.22 0.283 Tmevpg1 0.81 25.47 ＜0.001 血细胞 Dino 0.70 10.05 0.005 Trp53cor1 0.63 16.05 0.001 Pvt1 0.86 84.76 ＜0.001 Tmevpg1 0.74 49.15 ＜0.001 注：R2> 0.5为模型拟合效果较好，R2 > 0.7为拟合效果理想

表 2 全身照射小鼠后48 h血浆及血细胞中lncRNAs表达水平与照射剂量的一般线性回归分析 Table 2 General linear regression analysis of lncRNA expression levels in plasma and blood cells of mice 48 h after whole-body irradiation with irradiation dose

目前，放射治疗为放射性组织损伤发生的主要原因。放疗在许多癌症的治疗中起着重要作用，但其引起的不良反应被认为是患者治疗限制的主要因素之一^[7]。因此，开发能够反映辐射早期所致损伤和识别损伤组织来源的特异性生物标志物，对于评估辐射损伤和预测病程发展具有重要价值。lncRNAs已被证明在肿瘤放射敏感性^[8]及放射性组织损伤^[9]中发挥重要作用，如Martello等^[10]利用Emulate器官芯片系统模拟功能性人肝组织，认为DINO、PURPL、TMPO-AS1和PRC-AS1可作为辐射诱导的肝损伤的潜在生物标志物。由于大多数lncRNAs表现出较低的序列保守性^[11]，既往多数研究未对辐射响应性lncRNAs的保守性进行区分，故本研究所筛选的lncRNAs皆为人鼠同源，以期通过动物模型揭示其表达规律，并可为后续深入探究其生物学功能及转化研究提供理论依据。

基于文献筛选，本研究在0~6 Gy ⁶⁰Co γ射线全身照射小鼠后48 h的多个组织中，验证了19个人鼠同源且辐射响应的lncRNAs的表达特征。既往研究表明，Dino、Trp53cor1和Pvt1在小鼠全身受照后的心、肝及肺中表达上调且具有剂量依赖性^{[9, 12-13]}，而在全血中仅在个别剂量点上响应辐射表达且不具有剂量依赖性^[14]。本研究发现，Dino和Trp53cor1除在上述3种组织外，在其余5种组织中也表现出良好的剂量依赖性，并且Dino和Trp53cor1在血浆和血细胞中均受辐射调控后表达上调且具有剂量依赖性，展现出良好的组织-体液一致性，提示二者可能作为指示辐射暴露的通用性标志物。有研究表明Pvt1在全血中受辐射调控后表达上调^[14]，本研究结果显示Pvt1在受照后小鼠血浆中表达上调，但在血细胞中呈下调趋势。目前尚未有研究表明其分别在血浆和血细胞中受辐射调控后的表达特征，但有研究表明Pvt1的来源可能为T淋巴细胞^[15]。因此，对于Pvt1在血浆及血细胞中所展现出的相反结果，仍需进一步实验以阐述其可能的原因及机制。本研究发现Tmevpg1在小鼠全身照射后表现出肺和大肠特异性，受辐射调控后表达下调，并且其在血浆和血细胞中的变化趋势均与组织水平相一致。目前有关Tmevpg1的研究多聚焦于非辐射领域，仅少数研究表明其在全身照射小鼠全血中受辐射调控后表达下调^[14]，本研究结果与其在全血中的报道相一致。为控制血细胞自身受辐射调节的影响，本研究进一步对小鼠血浆及血细胞进行分离，结果发现Tmevpg1在血浆及血细胞中呈现出一致性剂量依赖性下调，提示其可能作为从外周血中间接评估肺和大肠辐射损伤的替代性指标，有望实现对特定器官辐射损伤的早期微创预警。

LncRNAs可通过靶向DNA损伤修复、细胞周期、凋亡等关键生物学过程在辐射应答中发挥重要作用^[16]。研究表明，机体所有组织均表达功能性p53蛋白，且其参与至辐射诱导的凋亡反应中^[17]。更有学者指出，lncRNAs与p53信号通路之间的相互作用可能是调控机体放射敏感性的关键机制之一。Trp53cor1被证实是p53的直接转录靶标，在DNA损伤后参与p53依赖性凋亡应答^[18]；而Dino则是p53介导的细胞周期阻滞以及DNA损伤诱导的细胞死亡过程中所必需的分子，其缺失可抑制p53信号通路并缓解急性辐射综合征^[19]。故通过现有机制研究进一步支持了本研究中Dino和Trp53cor1在受照后多组织中均表达结果的可靠性。此外，本研究发现二者在辐射应答中存在一定的协同表达现象，后续拟进一步探讨其在放射性损伤中的作用机制。Tmevpg1是免疫系统中的关键调节因子，可调节干扰素γ，与多种自身免疫性疾病的发病机制有关^[20]。研究表明，Tmevpg1在结肠炎患者的结肠组织中表达失调，并可调控广泛的促炎级联反应^[21]。本研究发现，其受辐射调控后具有一定的组织特异性，故其受辐射调控后的表达水平与辐射所致特定组织损伤程度之间的关联性及机制有待进一步验证。

综上，本研究初步证明了Dino与Trp53cor1受辐射调控后在多个组织及外周血中均呈现一致性改变，提示它们具备作为辐射暴露生物标志物的潜力；而Tmevpg1的辐射响应性则表现出一定的组织特异性，主要见于肺和大肠，且其在外周血中的一致变化趋势提示其有作为评估特定组织辐射损伤早期预警标志物的潜力。由于本研究只聚焦于照射后48 h这一时间点，未能全面反映lncRNAs表达的动态变化过程，因此后续将进一步扩大样本规模，增加多个时间点及剂量点以揭示lncRNAs表达的动态规律，从而进一步明确其生物学意义与实用价值。

利益冲突  无

作者贡献声明  王蜜蜜负责实验设计和实施、数据采集和论文撰写；田雪蕾、刘青杰指导实验设计和论文修改