电离辐射暴露是重大公共卫生安全挑战，核与辐射事故可能导致大规模伤亡。1944年以来，全球已报告近400起放射性事故，约3 000人受到大剂量照射，其中127人死亡^[1]。在医疗资源有限的情况下，快速、可靠的生物剂量学方法对伤员分类和救治至关重要。染色体畸变分析虽准确，但耗时长，难以满足大规模筛查需求。因此，寻找新的快速、灵敏的辐射生物标志物成为研究热点。

近年来，已有辐射敏感基因、蛋白等分子水平生物标志物的报道^[2-4]，但由于样本前处理复杂、灵敏度不高的问题限制了其实际应用。小分子代谢物作为生命活动的末端，能够更直接地反映机体受辐射后的即时功能状态，且其物理化学性质稳定，易于实现稳定、快速、灵敏的要求。

应用非靶向代谢组学相对定量方法目前已筛选出多种辐射响应代谢物，如氨基酸、鞘脂和酰基肉碱等^[5-9]。然而，相对定量方法存在重复性差、平台间难以比较的局限，阻碍其实际应用。基于靶向代谢组学的绝对定量方法凭借高精度、高重复性及跨平台可比性，更适用于生物剂量估算的应用推广。本研究基于超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)联用技术，测定了前期研究中筛选出的大鼠血浆中15种辐射诱导的代谢物绝对浓度^[10-11]，构建并验证剂量分类和估算模型，为实现辐射暴露人群的快速、准确剂量分类与估算提供实验基础。

1.实验动物与分组：SD大鼠75只，雄性，SPF级，6~8周，200~250 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK京2021-0006。饲养于中国疾病预防控制中心实验动物中心，每笼5只，SPF级饲料，可自由饮水，温度为(22±2)℃，相对湿度为40%~60%，光线昼夜12 h交替。其中50只(训练集)用于构建辐射剂量预测模型，按随机数表法分为1个对照组和5个不同剂量照射组(0、1、2、3、5、8 Gy)，每组8~9只；25只(验证集)用于模型性能评估，按随机数表法分为1个对照组和4个照射组(0、0.5、2.5、4、6 Gy)，每组5只。本研究通过中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所实验动物伦理福利委员会审查(2024-011号)。

2.照射条件：对大鼠进行全身照射，照射源为⁶⁰Co γ射线(北京师范大学钴源室)，吸收剂量率为1 Gy/min。

3.血浆样本制备：照射后3 d，采集大鼠眼内眦静脉血液约1 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，4℃离心半径15 cm，3 000 r/min离心10 min，取上层血浆分装后冻存于-80℃。

4.质量控制(quality control，QC)样品制备：制备空白QC样品和QC样品，用于监测进样过程中仪器的稳定性。取500 μl纯甲醇溶液作为空白QC样品；75份血浆样品各取10 μl混合作为QC样品。具体进样序列如下：首先进样3次空白QC样品，随后进样9个不同浓度的混合标准品以建立标准曲线。再次进样3次空白QC样品和1次QC样品，开始实测样品分析。在正式进样过程中，每9个实测样品后插入1次QC样品。整个序列结束时，最后进样1次QC样品和3次空白QC样品。

5.标准曲线工作溶液的配制：吸取15个代谢物标准品储备液100 μl，置于2 ml离心管中，涡旋混匀，配置成不同浓度的外标混和液。对上述配置好的外标混和液使用甲醇进行1、1.6、2、4、10、25、50、100和200倍逐级稀释，配置9个不同浓度梯度的标准曲线工作溶液(表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 标准曲线工作溶液稀释浓度(μg/ml) Table 1 Dilution concentrations of calibration standards (μg/ml) 代谢物 1倍 1.6倍 2倍 4倍 10倍 25倍 50倍 100倍 200倍 琥珀酸 270 168.75 135 67.5 27 10.8 5.4 2.7 1.35 牛磺酸 305 190.625 152.5 76.25 30.5 12.2 6.1 3.05 1.525 脯氨酸 310 193.75 155 77.5 31 12.4 6.2 3.1 1.55 缬氨酸 250 156.25 125 62.5 25 10 5 2.5 1.25 苏氨酸 150 93.75 75 37.5 15 6 3 1.5 0.75 苯丙氨酸 164 102.5 82 41 16.4 6.56 3.28 1.64 0.82 瓜氨酸 83 51.875 41.5 20.75 8.3 3.32 1.66 0.83 0.415 丁酰肉碱 1 0.625 0.5 0.25 0.1 0.04 0.02 0.01 0.005 缬酰肉碱 0.06 0.038 0.03 0.015 0.006 0.002 0.001 0.000 6 0.000 3 己酰肉碱 0.05 0.031 0.025 0.012 0.005 0.002 0.001 0.000 5 0.000 2 棕榈酰肉碱 0.165 0.103 0.082 0.041 0.016 0.007 0.003 0.001 6 0.000 8 肌酸 50 31.25 25 12.5 5 2 1 0.5 0.25 亮氨酸 100 62.5 50 25 10 4 2 1 0.5 丙氨酸 100 62.5 50 25 10 4 2 1 0.5 N-乙酰鸟氨酸 2.5 1.562 5 1.25 0.625 0.25 0.1 0.05 0.025 0.012

表 1 标准曲线工作溶液稀释浓度(μg/ml) Table 1 Dilution concentrations of calibration standards (μg/ml)

6.内标混标工作液的配置：吸取12个内标对照品适量，涡旋混匀，配置成L-瓜氨酸-13C、牛磺酸-13C2、DL-3-苯丙氨酸-13C-1、L-缬氨酸-1-13C、L-脯氨酸-13C5、L-苏氨酸-13C4、L-己酰肉碱-d3、肌酸-d3、丁酰肉碱-d3盐、L-亮氨酸-d3、L-丙氨酸-d3、N-乙酰鸟氨酸-d2浓度分别为25、10、25、25、10、10、5、25、5、5、50、5 μg/ml的内标混和工作液。

7.样品前处理：采用蛋白沉淀法(protein precipitation，PPT)进行样品前处理。空白QC和ST1~ST9现配现用，血浆4℃解冻。精密吸取QC、ST1~ST9和血浆50 μl，分别置于1.5 ml离心管中，加入25 μl内标混标工作液，涡旋1 min混匀，其中内标混标由12种同位素内标混合配置，再加入乙腈蛋白沉淀剂150 μl冷乙腈，振荡混匀，4℃静置10 min，然后4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液100 μl，使用乙腈稀释进行5倍稀释，转移至进样瓶中待测。

8.液相色谱-质谱联用(LC-MS)条件：用超高效液相色谱(美国ThermoFisher公司)分离血浆样品，色谱柱为Hypersil GOLDTM VANQUISH C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美国ThermoFisher公司)。流动相A为0.02% HFBA-0.2% FA水溶液，流动相B为乙腈。柱温为26℃，流速为0.2 ml/min，进样量为1 μl，自动进样器进样盘温度4℃。采用梯度洗脱程序(0 ~ 6 min，10% B；6 ~ 7 min，10%~25% B；7 ~ 10 min，25% B；10 ~ 11 min，25% ~ 80% B；11 ~ 15 min，80% B；15 ~ 15.5 min，80% ~100% B；15.5 ~ 20.5 min，100% B；20.5 ~ 21 min，100%~10% B；21 ~ 24 min，10% B)，运行时间为24 min。采用TSQ Altis Plus三重四极杆质谱系统(美国ThermoFisher公司)，电喷雾电离模式(H-ESI)，选择反应监测(SRM)。正负模式喷雾电压分别为3 500 V，3 200 V。离子源气体为N₂，其中鞘气流速为40 L/min，辅助气流速为15 L/min。离子传输管温度为325℃，雾化温度为350℃。碰撞气为Ar，压力1.5 mTorr。

9.统计学处理：用TraceFinder 5.1 General Quan软件进行峰提取和数据导出。用R 4.3.3软件进行数据处理。用SPSS 26.0进行剂量估算模型的建立以及统计学分析。用GraphPad Prism 8.0.2软件进行图片的绘制。组间代谢物浓度的比较经正态性检验、方差齐性检验后采用单因素方差分析或非参数检验(Kruskal-Wallis H检验)，两两比较采用LSD-t检验、Welch′s t检验或Mann-Whitney U检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。

1.标准曲线建立：以待测物质峰面积(S_ES)与内标峰面积(S_IS) 的比值为纵坐标，标准曲线工作溶液的浓度为横坐标，采用“等权重”的最小二乘法进行回归计算。在线性范围内，15种代谢物均显示出良好的线性关系(R² >0.98，表 2)。

表 2(Table 2)

表 2 15种代谢物标准曲线的回归方程及线性关系 Table 2 Regression equations and linear range of the standard curves for 15 metabolites 代谢物 回归方程 线性范围(μg/ml) R2 丙氨酸 y=3.778×10-2x-1.849×10-2 0.5~100 0.999 7 丁酰肉碱 y=2.902×10-4x-2.127×10-3 0.005~1 0.999 3 瓜氨酸 y=4.564×10-2x+7.74×10-2 0.415~83 0.992 8 肌酸 y=6.81×10-2x-1.394×10-2 0.25~50 0.998 9 己酰肉碱 y=1.014×10-3x+9.187×10-4 0.003~0.5 0.992 7 N-乙酰鸟氨酸 y=4.092×10-1x-1.075×10-3 0.013~2.5 0.998 1 棕榈酰肉碱 y=2.698×10-4x+1.864×10-3 0.004~0.825 0.972 9 苯丙氨酸 y=4.371×10-2x+1.766×10-1 0.513~102.5 0.982 9 脯氨酸 y=1.194×10-1x-6.844×10-2 1.55~310 0.999 1 琥珀酸 y=5.084×10-2x-1.812×10-1 1.35~270 0.993 0 牛磺酸 y=9.025×10-2x-1297×10-1 1.525~305 0.999 7 苏氨酸 y=1.437×10-1x+2.532×10-2 0.75~150 0.999 3 缬酰肉碱 y=6.646×10-4x+3.681×10-4 0.002~0.3 0.978 5 缬氨酸 y=5.419×10-2x+7.721×10-2 1.25~250 0.997 9 亮氨酸 y=3.373×10-2x+1.635×10-2 0.5~100 0.997 7

表 2 15种代谢物标准曲线的回归方程及线性关系 Table 2 Regression equations and linear range of the standard curves for 15 metabolites

2.辐射诱导的差异代谢物的绝对定量：为构建基于辐射诱导的差异代谢物浓度的辐射剂量分类和估算模型，对训练集大鼠血浆样本(n=50)进行了15种潜在辐射差异代谢物的绝对定量分析。定量时对样本中的目标代谢物进行检测，依据S_ES和S_IS的比值与标准曲线计算得到绝对浓度(表 3)。为严格控制浓度检测质量，实验全程采用含同位素标记内标的差异代谢物进行质量控制，以校正基质效应与仪器波动。

表 3(Table 3)

表 3 大鼠0~8 Gy 60Co γ射线全身照射后3 d 15种代谢物浓度(x±s) Table 3 Plasma concentrations of 15 metabolites in rats at 3 days after total body irradiation with 0-8 Gy 60Co γ-rays (x±s) 代谢物 0 Gy (n=8) 1 Gy (n=8) 2 Gy (n=8) 3 Gy (n=8) 5 Gy (n=9) 8 Gy (n=9) 丙氨酸 45.29 ± 8.45 46.21 ± 6.71 48.34 ± 4.59 43.76 ± 7.70 46.42 ± 10.21 29.77 ± 5.74 丁酰肉碱 (11.00±4.13)×10-2 (8.29±2.76)×10-2 (8.46±2.90)×10-2 (5.76±2.89)×10-2 (5.93±2.13)×10-2 (4.24±2.66)×10-2 瓜氨酸 24.27 ± 1.80 22.47 ± 4.27 19.17 ± 2.55 15.89 ± 2.15 10.99 ± 3.69 4.60 ± 1.87 肌酸 18.59 ± 4.88 20.37 ± 7.09 26.31 ± 4.67 18.48 ± 5.04 27.43 ± 2.19 38.79 ± 7.80 己酰肉碱 (1.28±1.40)×10-3 (1.01±1.41)×10-3 (1.47±1.18)×10-3 (3.21±1.06)×10-3 (2.23±0.65)×10-3 (5.28±0.67)×10-3 亮氨酸 13.09 ± 3.78 11.84 ± 1.16 13.71 ± 3.32 12.31 ± 3.86 11.02 ± 2.03 18.74 ± 6.94 N-乙酰鸟氨酸 0.42 ± 0.17 0.45 ± 0.15 0.47 ± 0.17 0.35 ± 0.12 0.26 ± 0.17 0.18 ± 0.15 棕榈酰肉碱 (9.54±5.89)×10-3 (3.11±5.89)×10-3 (5.77±6.45)×10-3 (17.50±7.27)×10-3 (13.40±6.17)×10-3 (36.00±5.66)×10-3 苯丙氨酸 22.17 ± 2.96 23.03 ± 4.57 22.28 ± 2.17 22.96 ± 3.30 26.88 ± 2.92 31.53 ± 6.72 脯氨酸 35.81 ± 3.42 41.05 ± 3.00 36.38 ± 4.75 26.41 ± 5.79 24.63 ± 5.59 19.14 ± 3.97 琥珀酸 5.60 ± 1.17 4.81 ± 0.75 5.25 ± 1.18 5.03 ± 0.71 4.61 ± 0.18 4.59 ± 0.46 牛磺酸 16.43 ± 6.50 16.77 ± 4.25 18.19 ± 6.86 17.22 ± 5.09 20.38 ± 5.64 27.02 ± 10.28 苏氨酸 33.92 ± 12.65 40.60 ± 11.24 31.94 ± 14.44 36.16 ± 9.02 44.62 ± 2.72 46.02 ± 11.49 缬氨酸 17.01 ± 1.95 21.24 ± 4.75 18.83 ± 2.99 18.82 ± 5.03 16.39 ± 2.55 27.47 ± 11.57 缬酰肉碱 (1.10±2.46)×10-3 (1.27±3.96)×10-3 (1.27±5.05)×10-3 (1.41±1.64)×10-3 (2.17±1.53)×10-3 (2.22±1.10)×10-3

表 3 大鼠0~8 Gy 60Co γ射线全身照射后3 d 15种代谢物浓度(x±s) Table 3 Plasma concentrations of 15 metabolites in rats at 3 days after total body irradiation with 0-8 Gy 60Co γ-rays (x±s)

3.线性回归模型的建立

(1) 一般线性回归模型的建立：基于获得的代谢物浓度数据，对每种代谢物分别拟合了其浓度与辐射剂量之间的单变量线性剂量-反应模型(表 4)。其中瓜氨酸、苯丙氨酸模型拟合后R²＞0.9，丁酰肉碱、N-乙酰鸟氨酸、脯氨酸、牛磺酸R²＞0.8。

表 4(Table 4)

表 4 15个辐射诱导的差异代谢物的单变量线性剂量-响应模型 Table 4 Univariate linear dose-response models for 15 radiation-induced differential metabolites 代谢物 模型 R2 P值 丙氨酸 y = -1.826 4x + 49.083 0.619 3 0.000 2 丁酰肉碱 y = -0.007 5x + 0.096 6 0.819 8 ＜0.000 1 瓜氨酸 y = -2.525 9x + 24.23 0.993 2 ＜0.000 1 肌酸 y = 1.417 9x + 19.118 0.399 8 ＜0.000 1 己酰肉碱 y = 0.000 5x + 0.000 9 0.797 6 ＜0.000 1 亮氨酸 y = 0.598 9x + 11.556 0.404 2 0.016 7 N-乙酰鸟氨酸 y = -0.036 6x + 0.471 7 0.868 8 ＜0.000 1 棕榈酰肉碱 y = 0.003 5x + 0.003 0.767 2 ＜0.000 1 苯丙氨酸 y = 1.208 5x + 20.983 0.900 9 ＜0.000 1 脯氨酸 y = -2.603 0x + 38.813 0.819 3 ＜0.000 1 琥珀酸 y = -0.104 5x + 5.313 0.598 3 0.035 2 牛磺酸 y = 1.296 3x + 15.232 0.888 4 0.000 5 苏氨酸 y = 1.530 4x + 34.029 0.600 8 0.014 8 缬氨酸 y = -0.387 2x + 19.308 0.154 2 0.011 0 缬酰肉碱 y = -0.000 3x + 0.003 7 0.397 3 0.001 0

表 4 15个辐射诱导的差异代谢物的单变量线性剂量-响应模型 Table 4 Univariate linear dose-response models for 15 radiation-induced differential metabolites

(2) 多元线性回归模型的建立：选定15个辐射诱导的代谢物因子作自变量，受照剂量为因变量，使用逐步回归法建立多元线性回归模型(R²=0.950，表 5)。得到的受照剂量与瓜氨酸(x₁)、苏氨酸(x₂)、肌酸(x₃)、N-乙酰鸟氨酸(x₄)的多元线性回归模型为：y=-0.237x₁+0.046x₂+0.058x₃-3.246x₄+5.126。

表 5(Table 5)

表 5 多元线性回归模型评价参数 Table 5 Evaluation parameters of multivariable linear regression model 自变量 系数 标准误 标准化系数 系数P值 VIF值 常量 5.126 0.851 — ＜0.001 — 瓜氨酸 -0.237 0.035 -0.611 ＜0.001 3.371 苏氨酸 0.046 0.012 0.207 0.001 1.277 肌酸 0.058 0.020 0.194 0.008 1.817 N-乙酰鸟氨酸 -3.246 1.221 -0.198 0.015 2.325 注：“—”为无数据。F=99.87，R2=0.950，调整后R2=0.941

表 5 多元线性回归模型评价参数 Table 5 Evaluation parameters of multivariable linear regression model

图 1 大鼠受到0~8 Gy 60 Co γ射线照射后血浆样品中瓜氨酸(A)、N-乙酰鸟氨酸(B)、肌酸(C)、苏氨酸(D)浓度变化趋势 Figure 1 Plasma concentration trends of citrulline (A), N-Acetylornithine (B), creatine (C), and threonine (D) in rats following 0-8 Gy 60Co γ-ray irradiation

4.回归模型验证：为验证建立的多元线性回归模型的有效性及理论计算的准确性，参照单变量模型中R²大于0.9的标准，并结合纳入多变量模型的变量情况，本研究对0~6 Gy ⁶⁰Co γ射线照射后验证集(n=25)样本中5种代谢物进行了定量分析(瓜氨酸、肌酸、苯丙氨酸、N-乙酰鸟氨酸、苏氨酸)。其中1~5号样本、6~10号样本、11~15号样本、16~20号样本、21~25号样本实际照射剂量分别为0、0.5、2.5、4、6 Gy。使用5个一般线性模型与多元线性模型对受照剂量进行估算，其中M1~M6模型分别对应瓜氨酸(M1：y = -2.525 9x + 24.23)、苏氨酸(M2：y = 1.530 4x + 34.029)、肌酸(M3：y = 1.417 9x + 19.118)、N-乙酰鸟氨酸(M4：y = -0.036 6x + 0.471 7)、苯丙氨酸(M5：y = 1.208 5x + 20.983)单变量一般线性模型和多元线性模型(M6：y=-0.237x₁+0.046x₂+0.058x₃-3.246x₄+5.126，x₁：瓜氨酸，x₂：苏氨酸，x₃：肌酸，x₄：N-乙酰鸟氨酸)。

利用UPLC-MS/MS对5种代谢物进行靶向定量分析，获得其浓度数据，并代入模型以估算受照剂量。进一步将估算剂量与实际照射剂量进行比较，使用相对标准偏差(RSD)评估估算误差。

6个模型的RSD对比结果示于图 2。总体而言，与0~0.5 Gy剂量范围相比，所构建的6个模型在2.5~6 Gy范围内表现出更好的预测性能。M1和M6在0~6 Gy的预测效果优于M2~M5。M1~M6分别有48%、36%、28%、28%、32%、48%样本的剂量预测RSD不超过40%。

图 2 6个模型对60 Co γ射线照射样本的预测相对标准偏差(RSD)比较 Figure 2 Comparison of predicted relative standard deviation (RSD) of six models for 60Co γ-ray irradiated samples

基于6个模型对25个样本预测结果的RSD分布比较，本研究评估了单变量与多变量建模策略在辐射剂量估算中的准确性和可靠性。结果显示，M1在单变量模型中为最佳模型，其25个样本中有12个样本(48%)的RSD绝对值< 40%。多元线性回归模型(M6)RSD绝对值< 40%的样本比例也达到48%，但与M1相比，M6的离散程度降低75.3%，体现出显著的预测稳定性优势。

5.受试者工作特征曲线(ROC)分析：对于0 Gy与>0 Gy，瓜氨酸、脯氨酸、丁酰肉碱、己酰肉碱在训练集和验证集中的曲线下面积(receiver operating characteristic curve，AUC)均>0.7，提示具备一定的区分能力。对于 < 2 Gy与≥2 Gy，瓜氨酸、脯氨酸、丁酰肉碱、肌酸、己酰肉碱、棕榈酰肉碱在训练集和验证集中的曲线下面积均>0.75，提示其也具备一定的区分能力。将瓜氨酸、脯氨酸、丁酰肉碱、己酰肉碱代谢物进行组合后，0 Gy与> 0 Gy样本的AUC值在训练集和验证集中分别为0.923和0.910，提示具有较强的区分能力；将瓜氨酸、脯氨酸、丁酰肉碱、肌酸、己酰肉碱、棕榈酰肉碱代谢物进行组合后，< 2 Gy与≥2 Gy样本的AUC值在训练集和验证集中均大于0.9，提示区分能力良好。

表 6(Table 6)

表 6 6种代谢物受试者工作特征曲线区分不同剂量组(曲线下面积) Table 6 Distinguishing different dose groups using receiver operating characteristic curve of 6 metabolites (area under the curve) 代谢物 0 Gy与＞0 Gy 2 Gy与≥2 Gy 训练集 验证集 训练集 验证集 瓜氨酸 0.872 0.778 0.956 0.786 脯氨酸 0.721 0.747 0.893 0.936 丁酰肉碱 0.839 0.811 0.822 0.807 肌酸 0.759 0.565 0.820 0.701 己酰肉碱 0.718 0.722 0.769 0.893 棕榈酰肉碱 0.564 0.847 0.751 0.855 代谢物组合 0.923 0.910 0.994 1.000

表 6 6种代谢物受试者工作特征曲线区分不同剂量组(曲线下面积) Table 6 Distinguishing different dose groups using receiver operating characteristic curve of 6 metabolites (area under the curve)

辐射生物剂量估算是核与辐射事故医学应急救援的核心环节之一，其关键在于对受照人员实现快速分类诊断，从而优化医疗资源的配置。在面对大规模核与辐射事故时，我国目前广泛应用的生物剂量估算方法，如染色体畸变与微核分析，均需要细胞培养流程，通量有限且耗时较长，难以满足应急响应中对快速、高通量筛查的迫切需求^[12-14]。代谢物作为生命活动的终端产物，对辐射响应迅速，为发展新型生物剂量计提供了全新视角。本研究使用UPLC-MS/MS联用技术，对辐射诱导的15种差异代谢物进行靶向绝对定量，为建立快速、可靠的辐射生物剂量分类和估算模型提供了可靠的数据基础。

尽管已有非靶向研究提示瓜氨酸、苏氨酸、肌酸等代谢物与辐射暴露相关，但不同研究之间常存在结果不一致的问题。本研究发现瓜氨酸在多元模型中对剂量估算贡献显著，与Nie等^[15]在大鼠模型及Carpenter等^[8]在恒河猴模型中观察到的瓜氨酸下调结果一致，这种跨物种、跨平台的一致性进一步支持了其作为辐射敏感标志物的可靠性。此外，Salah等^[16]报道苏氨酸在小鼠肠组织中呈剂量依赖性上升；Tyagi等^[17]与Maan等^[18]也分别在尿液与多组织样本中观察到肌酸在照后显著上调，这些结果共同构建了本研究中代谢物组合的理论基础，也凸显了其在辐射损伤代谢调控中的潜在生物学作用。

本研究结果显示，基于多种代谢物构建的多元线性回归模型，在剂量预测稳定性与高剂量区间分类性能方面均显著优于单变量模型，体现了多生物标志物组合策略在应对复杂辐射生物响应中的优势。该结论与Pannkuk等^[19]的研究相一致，其在非人灵长类动物实验中也发现，单一代谢物在区分4 Gy照射时效能有限(AUC: 0.610~0.890)，而6种代谢物组合可将AUC提升至0.950。这表明代谢物组合模型通过协同与补偿机制，能够有效校正单一代谢物响应的个体间变异，从而提高模型整体稳健性与适用性。

过往研究多采用非靶向代谢组学筛选潜在辐射生物标志物^[20-21]。近年来，靶向代谢组学方法的应用显著推动了该领域的发展，其中基于绝对定量的策略因具备更高的检测精度与灵敏度而备受关注^[22-23]。本研究基于靶向绝对定量技术，构建了辐射剂量估算和分类模型。LC-MS/MS靶向绝对定量方法虽能实现对代谢物的精准定量，并展现出良好的重现性与准确度，但仍存在无法发现新的代谢标志物、方法开发严重依赖昂贵的稳定同位素内标和纯化标准品、前处理步骤与色谱条件需针对不同性质的代谢物分别优化等不足。未来的研究将着眼于受照后多个时间点的剂量估算模型构建，并深入探讨相关代谢物的调控机制，从而为应用辐射敏感代谢物进行受照人员分类诊断提供更为坚实的科学基础。

值得强调的是，代谢物作为生物标志物的时间动态特性直接影响其实际应用价值。基于前期探索的结果，在照射后早期(如4 h和1 d)，代谢物响应仍处于急性应激与动态波动阶段，所建模型准确性较低。该现象与Pannkuk等^[19]的研究相符，其在非人灵长类模型中也观察到，多数辐射响应代谢物在24 h内变化剧烈，直至3~7 d才趋于稳定，并与剂量呈现更好的一致性。因此，本研究选择照后3 d作为检测窗口，有助于避开早期非特异性干扰，提升代谢物与剂量关系的可靠性。本研究结果显示，代谢物组合在此时间点具有良好的分类性能。未来研究有必要在照后多个时间点进行连续监测，以精确绘制其动态变化曲线，从而进一步确定最优检测窗口，并探索构建融合时间因素的动态估算模型。

综上所述，本研究应用靶向代谢组学方法精确测量了大鼠血浆中15种辐射诱导的差异代谢物绝对浓度，建立并验证了单一代谢物模型及代谢物组合模型，能够对2.5~4 Gy受照样本进行较为准确的辐射剂量估算，对0 Gy与> 0 Gy和 < 2 Gy与≥2 Gy受照情况进行准确的区分。本研究为应用靶向代谢组学技术对受照样本进行快速、准确检测提供了实验依据，也为在辐射暴露事故中大量受照人员的快速剂量分类和估算奠定基础。

利益冲突  无

作者贡献声明  代清池负责实验设计和实施、数据采集和撰写论文；闫宇康协助数据处理；习聪、李爽负责论文修改；蔡恬静、陆雪协助样本采集；刘青杰、赵骅指导实验设计和论文修改