放射治疗在有效抑制肿瘤生长的同时，常伴随正常组织损伤。研究表明，对于接受全脑放疗的患者，辐射诱导认知障碍(radiation-induced cognitive impairment, RICI)的发生率远高于30%^[1-3]，具体表现为记忆衰退、执行功能障碍及信息处理能力下降。即使未直接照射脑部，照射胸部等其他部位同样可能通过辐射诱导远端效应(radiation-induced abscopal effect, RIAE)引发认知衰退^[4-8]，且这一有害效应随着患者生存期延长而愈发显著，严重影响长期生存质量。

近年来，FLASH照射以其极短照射时间(≤ 500 ms)和高于常规剂量率照射(conventional dose rate irradiation, CONV)3~4个数量级的剂量率，在有效控制肿瘤的同时，显著降低了对正常组织的放射不良反应^[9-13]。已有研究显示，电子束FLASH可减轻脑组织急性炎症、维持海马区神经发生，并降低幼年动物认知损伤风险^[14]。然而，当前研究仍存在以下局限：其一，多数研究集中于脑部直接照射模型^[15-16]，对非脑部照射所引发的晚期远端行为效应尚缺乏系统评价；其二，因穿透力限制，电子束FLASH难以覆盖深部肿瘤，而更具临床普适性的X射线FLASH照射在行为保护效应方面的数据仍显不足^[17]；其三，关键转化研究的随访期普遍不足6个月，缺乏照射后伴随衰老进程的长期行为观测。尽管当前进行的临床试验初步验证了FLASH的安全性，但受样本量和观察时间所限，其对于远期功能影响的评估仍不充分^[18-19]。

为解决上述问题，本研究通过12个月的长期追踪，系统评估了小鼠胸部FLASH照射后的行为表现动态变化，为X射线FLASH照射在缓解辐射远端行为效应方面的时效特性提供关键证据。

1.实验动物：SPF级BALB/c雌性4周龄健康小鼠60只，体质量14~16 g，购于广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(粤)2022- 0002，已通过南方医科大学实验动物伦理委员会审查批准(No.L2023039)。所有小鼠饲养于南方医科大学SPF级屏障环境动物实验室，在标准饲养条件下[(22 ± 1)℃，12 h光/暗循环，湿度(50 ± 5)%]，自由获取食物和饮水，适应性饲养1周。

2.辐照装置和剂量学：本实验采用南方医科大学kV级光子FLASH照射平台。实验动物按随机数表法分为3组：假照射(SHAM)组、CONV组和FLASH组，每组20只。小鼠麻醉后，固定于2 cm厚亚克力平台，通过十字交叉激光束与照射等中心点对齐定位，照射野1 cm×1 cm，能量为150 kV，上臂源皮距为10.5 cm，下臂源皮距为12 cm。使用6 mm厚铅屏蔽装置遮挡小鼠身体其他部位，实施胸部X射线照射，具体照射参数详见表 1。假照射组操作同照射组，但X射线源关闭。同时使用EBT-XD胶片(美国Ashland公司)测定小鼠腹、背部照射区域沉积剂量，剂量分布如图 1所示。

表 1(Table 1)

表 1 FLASH组和常规剂量率组照射参数 Table 1 Irradiation parameters of the FLASH and CONV groups 组别 小鼠数 剂量(Gy，x±s) 平均剂量率(Gy/s) 脉宽(ms) 脉冲数 曝光时间(s) FLASH组 20 22.82±0.78 80 128 2 < 1 CONV组 20 20.64±0.67 0.2 3.2 80 40 注：CONV.常规剂量率

表 1 FLASH组和常规剂量率组照射参数 Table 1 Irradiation parameters of the FLASH and CONV groups

注：CONV.常规剂量率照射 图 1 两种照射方式EBT-XD胶片剂量分布  A. FLASH剂量热图；B.FLASH剂量剖面图；C.CONV剂量热图；D.CONV剂量剖面图 Figure 1 EBT-XD films showing dose distributions under FLASH and CONV irradiation  A. Dose heat map under FLASH irradiation; B. Dose profile under FLASH irradiation; C. Dose heat map under CONV irradiation; D. Dose profile under CONV irradiation

3.行为学实验：所有实验在暗光条件下进行，保持室内恒温、安静。实验前让小鼠适应60 min，每次实验结束后用75%乙醇彻底清洁装置以消除气味干扰，使用摄像设备记录实验全过程，后续使用Smart 3.0软件分析相应数据指标。

(1) 旷场实验：用于评价小鼠在新异环境中的自主性、探索行为和焦虑抑郁程度^[20]。将小鼠放置于40 cm× 40 cm× 40 cm的黑色旷场箱中央，记录其在5 min内的运动轨迹，分析总运动距离及中心区(中央9格)停留时间等指标。

(2) Y迷宫自发交替实验：旨在评估小鼠在短时间内的工作记忆能力。开放三臂自由探索8 min，分析总进臂次数与自发交替率；Y迷宫空间认知实验用于测试小鼠的辨别性学习与空间记忆能力^[21]。训练期关闭新臂自由探索15 min，2 h后在测试期开放新臂记录探索路径，分析新臂进入次数、时间与路程等指标。

(3) 新物体识别实验：用于考察小鼠对新异物体的探索偏好^[22]。在训练日放置两相同物体(A/A’) 自由探索10 min(有效探索≥ 20 s)，24 h后保持物体(A)不变，将物体(A’)更换为新型(B)进行测试，计算并分析识别指数(recognition index, RI)与辨别指数(discrimination index, DI)，计算公式如下：

式中，F_n为探索新物体次数；F_f为探索旧物体次数；T_n为小鼠探索新物体的时间，s；T_f为探索旧物体时间，s。若RI > 0.5，表示小鼠倾向于探索新物体；若DI > 0，表明小鼠对新物体有探索偏好。

(4) 筑巢实验：用作衡量小鼠日常活动执行能力与动机水平^[23]。夜节律前2 h将质量约2.0 g的5 cm × 5 cm无菌棉块放入单只小鼠笼中，24、48 h后由3名研究者采用5分制盲法，依据材料破碎度、巢穴致密性及组织结构的情况，对筑巢质量进行量化评分。实验安排见图 2。

图 2 实验流程图 Figure 2 Experimental flow chart

4.统计学处理：数据分析采用SPSS 27.0软件，计量资料符合正态分布，以x±s表示。首先进行方差同质性检验，随后根据自变量的数量，分别进行单因素或双因素方差分析。在组间差异分析中，采用最小显著性差异(LSD)或Dunnett′s T3检验，P < 0.05为差异具有统计学意义。所有图表由GraphPad Prism 9.7.1软件生成，确保数据可视化清晰准确。

1.X射线FLASH照射提高小鼠长期生存率：生存曲线显示，在照射后4个月，3组小鼠存活率均为100%；随时间推移，CONV组小鼠数量逐渐下降，照射后8个月共存活17只，至照射后12个月下降到12只，显著低于SHAM组的19只(χ² = 6.22, P < 0.05)。与之相比，FLASH组的存活率与SHAM组差异无统计学意义，表明X射线FLASH照射有效地减轻了常规剂量率照射所导致的晚期不良效应(图 3)。

注：a与SHAM组比较，χ2 = 6.22，P < 0.05 图 3 各组小鼠照射后存活曲线 Figure 3 Survival curves of mice in the three groups post-irradiation

2.X射线FLASH照射维持旷场探索行为并减轻边缘趋触性：照射后4个月，FLASH组中心区域活动时间、路程与总运动路程均显著高于CONV组(t = 4.29、4.14、3.51，P < 0.01)。CONV组的边缘停留时间显著高于FLASH组(t = 3.50，P < 0.01)。照射后8个月，FLASH组的中心区域活动时间与路程仍显著高于CONV组(t = 2.61、3.06，P < 0.05)，其边缘停留时间则显著低于CONV组(t = 2.40，P < 0.05)。照射后12个月，尽管FLASH组中心区域活动路程显著高于CONV组(t = 2.94，P < 0.05)，且边缘停留时间显著低于CONV组(t = 4.86，P < 0.01)，但此时两组的总运动路程及中心区域活动时间差异已无统计学意义(P > 0.05)。见图 4。

注：照射后4个月，a与FLASH组比较，t = 4.29、3.50、3.51、4.14，P < 0.01；b与CONV比较，t = 2.72、3.87、5.54，P < 0.05；照射后8个月，a与FLASH组比较，t = 2.61、2.40、3.06，P < 0.05；b与CONV比较，t = 3.29、4.74、4.82，P < 0.01；照射后12个月，a与FLASH组比较，t = 4.86、3.39、2.94，P < 0.05；b与CONV比较，t = 3.09、8.54、3.63，P < 0.05； 图 4 照射后4(A)、8(B)、12(C)个月各组小鼠旷场实验活动情况 Figure 4 Open field test-revealed exploratory behavior of mice in the three groups at 4(A), 8(B), and 12(C) months post-irradiation

总体来看，在旷场实验中，接受X射线FLASH照射的小鼠表现出更强的新环境探索动机与更低的焦虑样行为，该优势在照射后早期最为显著。虽随照射后时间延长，各组的自发运动水平均呈生理性下降，导致部分指标组间差异逐渐缩小，但FLASH组始终维持了与SHAM组更为相似的行为特征。

3.X射线FLASH照射提升Y迷宫工作记忆能力与空间记忆表现：照射后4个月，CONV组小鼠首次选择延迟时间与中心停留时间均显著高于FLASH组(t = 2.70、2.45，P < 0.05)。相比之下，FLASH组自发交替率显著高于CONV组(t = 3.31，P < 0.01)，反映其工作记忆处于较高水平。同时，FLASH组在三臂交替的探索率也显著高于CONV组(t = 4.70，P < 0.01)，提示空间信息整合能力增强。尽管各照射组新臂运动距离与区域转换次数均低于SHAM组，但接受X射线FLASH照射的小鼠在关键探索行为指标上更接近SHAM组水平(图 5)。

注：a与FLASH组比较，t = 3.31、4.70、2.40、2.70、2.31、2.45，P < 0.05；b与CONV比较，t = 3.02、3.15、2.49、2.48，P < 0.05 图 5 照射后4个月各组小鼠Y迷宫实验结果 A.自发交替率；B.三臂交替探索率；C.首次选择延迟时间；D.新臂运动距离；E.中心停留时间；F.区域转换次数 Figure 5 Y-maze test results of mice in the three groups at 4 months post-irradiation  A. Spontaneous alternation rate; B. Triple arm alternation rate; C. Latency to first-arm entry; D. Distance of exploration in the new arm; E. Time spent in the central area; F. Number of entries into different arms

4.X射线FLASH照射改善早期新物体识别能力并实现长期保全：新物体识别实验结果显示，照射方式对小鼠识别能力的影响随检测时间点而异，见图 6。照射后4个月，SHAM组的RI与DI值最高，FLASH组次之，且两组均显著高于CONV组(t = 4.99、6.65、3.87、4.09，P < 0.01)；照射后8个月，各组间的RI与DI值差异均无统计学意义；至照射后12个月，FLASH组的RI值显著高于同期SHAM组(t = 2.87，P < 0.05)。

注：RI.识别指数；DI.辨别指数；a与FLASH组比较，t = 3.87、2.87、4.09，P < 0.05；b与CONV比较，t = 4.99、6.65，P < 0.05 图 6 照射后4、8、12个月各组小鼠新物体识别指数和辨别指数 Figure 6 Novel object recognition and discrimination indices of mice in the three groups at 4, 8, and 12 months post-irradiation

对各组进行纵向分析发现，FLASH组表现出良好的功能保全，其RI与DI均值在整个观察期内始终为正值，表明小鼠保有基本的识别能力。CONV组则呈现异常的动态变化，其DI值在照射后8个月显著降低至负值，提示小鼠在此期间出现了明显的辨别障碍；值得注意的是，其DI值在照射后12个月回升至正值，且高于照射后4个月时水平。SHAM组的RI与DI值随月龄增长呈下降趋势，提供了自然衰老的行为基线对照。

综上所述，接受X射线FLASH照射的小鼠在照射后早期显著改善新物体识别能力，并在长期范围内有效保全认知功能，且未出现CONV组所见的异常波动。

5.X射线FLASH照射保持长期筑巢行为：在筑巢实验中，如图 7观察结果显示，照射后12个月，FLASH组小鼠的筑巢表现优于CONV组。实验开始24 h后，SHAM组的筑巢评分介于FLASH组与CONV组之间；至48 h，FLASH组的筑巢评分最高，SHAM组次之，且两者均显著高于CONV组(t = 5.01、3.27，P < 0.01)，表明X射线FLASH照射能有效维持小鼠与执行功能动机相关的长期复杂行为。

注：a与FLASH组比较，t = 2.52、5.01，P < 0.05；b与CONV比较，t = 3.27，P < 0.05 图 7 照射后第12个月各组小鼠0、24与48 h筑巢情况(A)及得分统计图(B) Figure 7 Nest-building performance at 0, 24, and 48 h (A) and corresponding score statistics (B) of mice in the three groups at 12 months post-irradiation

本研究通过为期12个月的纵向行为学追踪，系统探讨了X射线FLASH照射对小鼠胸部照射后远期行为表现的影响。结果表明，X射线FLASH在生存率和多项行为学指标上均优于常规剂量率照射。纵向数据显示，FLASH组在生存率、探索行为及认知功能等多个维度上均表现出显著优势；尽管部分行为指标在晚期未呈现组间显著差异，但其整体行为表现仍系统性优于CONV组。相较而言，CONV组虽在新物体识别等部分行为指标中随时间呈现动态变化，提示可能存在适应性改变，但仍伴随探索行为减少、筑巢能力低下及生存率显著下降等现象；SHAM组则提供了与自然衰老相关的行为变化基线。

X射线FLASH照射的核心优势在于其对生存率和行为功能的整体维护。生存分析表明，FLASH组生存率与SHAM组差异无统计学意义。在行为方面，FLASH组在各时间点均表现出较高的自主探索水平和积极的环境互动能力，包括更好的旷场中心探索表现、更优的新物体识别指标，以及更佳的筑巢完成度等。值得注意的是，本研究中观察到X射线FLASH的行为学优势提示，胸部X射线FLASH照射可能通过减轻有害的辐射远端效应，从而对中枢神经系统功能产生了积极作用。学界针对FLASH效应的潜在机制提出了多种假说，例如Chow和Ruda^[24]提出的辐射分解氧耗竭模型，认为FLASH可通过瞬时降低局部可用氧并减少·OH等有害ROS的传播，从而减少正常组织的辐射化学损伤；Jo等^[25]的研究在全脑照射模型中发现，FLASH可减轻神经胶质活化并更好地保存神经结构与功能。尽管本研究在胸部照射与上述模型存在差异，且未对脑组织进行分子生物学检测，但基于上述文献证据，推测X射线FLASH照射可能通过减轻全身性或远隔部位的炎症/氧化应激反应等类似机制，间接介导其对行为表型的积极影响，这一假设亟待后续研究结合病理生化检测加以验证。

异常现象在于，CONV组在新物体识别实验中表现出RI与DI值先降低后回升的变化趋势，并且晚期数值高于照射后早期，提示其行为模式存在动态适应或改变，可能存在某种代偿性或适应性过程。然而，该组同时表现出探索行为受限和生存率下降，这说明任何可能的适应性改变都不足以抵消常规照射的整体负面影响。既往研究表明，辐射可诱发强烈的局部与全身性炎症反应，包括通过DAMPs诱导的促炎细胞因子释放^[26]。而独立的神经免疫综述指出，系统性炎症可干扰皮质-杏仁核及皮质-纹状体环路功能，进而诱发情绪与奖赏处理障碍，导致焦虑、快感缺失等行为异常，最终降低生活质量^[27]。CONV组观察到的复杂行为表型或许反映了全身性辐射响应与局部适应性机制之间的失衡，这一设想需要进一步的分子生物学实验证据支持。

基于以上发现，未来将从以下几方面进一步探索：在机制层面，结合分子生物学和影像学技术，系统阐释X射线FLASH照射是否通过调节系统性/中枢性炎症来介导其保护效应的生物学基础；时程维度上，延长观察时间至更晚期(如24个月)，重点考察FLASH照射能否长期将功能维持在生理性衰老水平，并关注CONV组晚期行为变化趋势的最终走向；在技术优化方面，着重突破X射线FLASH在深部肿瘤中的剂量分布研究与照射方案优化，利用大型动物或发育期动物模型评估其效应的普适性，并为后续潜在的临床应用提供坚实的实验依据。

总体而言，X射线FLASH照射在长期生存率和行为功能的维持上体现明显优势，表明其在控制辐射远期不良反应方面具有重要潜力。鉴于X射线在深部剂量分布方面更具临床适用性，本研究为评估X射线FLASH照射的远期全身性效应提供了关键的行为学证据，为其后续的临床发展与安全性评估奠定了重要基础。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明  崔靓负责实验操作、实验数据分析与撰写论文；陆星宇参与实验方案设计、实验操作与论文修改；商航、黄玮睿参与实验操作与文献整理；周凌宏提供研究思路，指导论文修改