结直肠癌(CRC)是全球第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因^[1]。放疗是晚期结直肠癌患者的主要治疗手段之一，但在临床实践中，结直肠癌的放疗抵抗往往会影响患者的治疗效果^[2]，因此，研究放疗抵抗的机制至关重要。

CRC放射治疗中，细胞死亡的主要方式是凋亡^[3]，但其他形式的细胞死亡，比如自噬，也参与其中。自噬主要有巨自噬、微自噬、分子伴侣介导的3种形式，其中分子伴侣介导的自噬(CMA)是一种选择性自噬，与癌症的侵袭性相关^[4]。热休克蛋白A家族成员8(HSPA8)和溶酶体相关膜蛋白2A(LAMP2A)是CMA的两种关键调控蛋白，其中HSPA8是一种分子伴侣，通过促进蛋白质的正确折叠，防止蛋白质聚集来维持细胞内的蛋白质稳态。HSPA8可以识别蛋白的赖氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-精氨酸-谷氨酰胺(KFERQ)基序，形成底物-伴侣复合物^[4]，这一结合事件标志着CMA过程的起始阶段，是CMA发生中最具特征性的分子步骤。底物-伴侣复合物通过LAMP2A转位到溶酶体，最终使含有KFERQ样基序的蛋白质被降解^[5]。细胞角蛋白6B(KRT6B)是角蛋白家族中的一员，其表达异常可破坏正常的角质细胞分化和增殖，从而促进鳞状细胞癌的进展，与癌症的预后相关^[6]。本课题前期通过质谱分析发现，KRT6B可能是CMA的靶基因，并且KRT6B含有KFERQ样基序。鉴于此，本研究旨在通过探讨分子伴侣介导的自噬(CMA)在调控结肠癌辐射敏感性的作用及潜在机制，为结肠癌的放疗抵抗提供新的借鉴。

1.主要仪器与试剂：人结肠癌细胞系SW480细胞购自中国科学院细胞库。TRIzol、SYBR PreMix Ex Taq II、PrimeScriptTMRTMaster Mix均购自日本TaKaRa公司。抗体来自美国CST技术公司的LAMP2、HSPA8、MEF2D、FLAG、c-MYC、β-肌动蛋白、GAPDH；购自美国Proteintech公司的KRT6B；二抗为山羊抗兔Ig G(H+L)-HRP偶联物和羊抗鼠抗体(H+L)-HRP偶联物购自美国Bio-Rad公司。免疫印迹化学发光(ECL)溶液购自美国Thermo Fisher公司。ACEA NovoCyte 2040R流式细胞仪为杭州艾森生物有限公司产品，HXFS-IA型血液辐照机购自中国同辐股份有限公司。

2.细胞培养及照射条件：细胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素和1%链霉素的DMEM培养液中，于37℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。使用¹³⁷Cs γ射线照射，照射野10 cm × 10 cm，源靶距50 cm，剂量率为70 cGy/min，总剂量8 Gy。

3.流式细胞术检测细胞死亡：将细胞接种于6孔板中(1.5×10⁵个/孔)，每组设置3个平行孔。1 000转/min，离心半径15 cm，离心5 min，弃上清；磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两次，加入330 μl胰蛋白酶于37℃培养箱中消化2 ~ 3 min，660 μl完全培养基终止消化，1 000转/min，离心半径15 cm，离心5 min，收集细胞；弃上清，200 μl PBS重悬细胞，20 μl台盼蓝染色液染色3 min，流式细胞仪按照每次上样20 000个细胞/20 μl，采用PerLP通道检测细胞死亡率。

4.克隆形成实验：取适当数量SW480细胞(0、2、4、6、8 Gy分别取1 000、1 500、2 000、3 000、4 000个)接种到培养皿中，以生成50 ~ 200个克隆。细胞培养14 d后，用4%多聚甲醛在室温固定30 min，随后弃掉固定液，加入PBS清洗后，室温下用0.1%结晶紫溶液染色，拍照。用Image J图片处软件统计≥50个细胞的集落。

5.细胞转染：取对数生长期的细胞以适量密度接种于培养皿中，待细胞生长至30% ~ 50%融合度时进行转染，利用Lipofectamine 2000转染试剂，按说明书操作，转染48 ~ 72 h后收细胞进行转染效果鉴定以及后续实验。

6.蛋白印迹分析：根据细胞沉淀量，使用放射免疫沉淀法缓冲液(RIPA)裂解30 min，总蛋白经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)80 V 30 min待蛋白Marker分离后110 V 90 min，电泳分离后100 V 100 min转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。在室温下用6%脱脂牛奶在Tris缓冲生理盐水-吐温(TBST)中封闭1 h后，在4℃下与一抗(1∶1 000)孵育过夜，TBST洗涤3次，在室温下与二抗(1∶10 000)孵育1 h，再次洗涤3次后，显色液均匀洒在PVDF膜上，采用分子影像分析检测系统进行曝光。所得图像采用Image J软件进行灰度分析。

7.免疫共沉淀分析：使用1% NP40裂解缓冲液800 μl裂解细胞1 h后，于4℃下，12 000转/min，离心半径15 cm，离心15 min。取720 μl上清液加入1 μg相应抗体，阴性对照组加入1 μg同型对照抗体IgG于4℃下孵育过夜；随后，添加20 μl蛋白A/G琼脂糖珠，在4℃下与蛋白珠孵育1.5 h，随后用裂解缓冲液洗涤5 min × 5次，用40 μl的2 × SDS-PAGE上样缓冲液洗脱，进行蛋白印迹分析。

8.蛋白质质谱分析：分别收集对照组和沉默LAMP2的SW480细胞、辐射或假照的SW480细胞，密封好后送至杭州景杰生物公司进行4 D-FastDIA定量蛋白组分析。

9.统计学处理：采用SPSS 22.0软件进行统计分析，用Graphpad Prism 8.0软件作图，对所有数据进行正态性检验，符合正态分布，方差齐，以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多个样本均数间比较采用单因素方差分析后，采用LSD-t法进行组间的两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.电离辐射诱导SW480细胞中CMA蛋白活性增强：为了确定电离辐射是否诱导结肠癌细胞中CMA活性的增强，在SW480细胞接受8 Gy照射后的不同时间点(4、8、12、24、48 h)检测CMA的关键调控蛋白LAMP2和HSPA8的蛋白表达。结果示于图 1，SW480细胞中LAMP2在照射后24 h表达量为(0.86±0.15)%，48 h为(0.57±0.18)%，与0 h组的(0.38±0.07)% 相比显著上升(t=3.72、3.15，P < 0.05)。HSPA8的表达水平未见显著变化。已有研究表明，LAMP2的表达水平及动态变化可调节CMA通量^[7]，本结果提示电离辐射可以促进结肠癌细胞中CMA活性的增强。

注：a与0 h相比, t=3.72、3.15，P < 0.05 图 1 8 Gy照后不同时间SW480细胞中LAMP2(A)和HSPA8(B)蛋白表达变化及其定量分析结果(C) Figure 1 Changes in the expression of proteins LAMP2 (A) and HSPA8 (B) in cells SW480 at different time points after 8 Gy irradiation and their quantitative analysis results (C)

2.筛选CMA的靶蛋白：为了探究辐射诱导的CMA过程中可能的靶蛋白，采用高分辨率质谱技术对SW480细胞中shNC组与sh-LAMP2组、以及假照组与8 Gy照射组的差异表达蛋白进行了分析比较。鉴于电离辐射可以促进SW480细胞中CMA的活性增强，因此将辐射后表达下调且在LAMP2沉默后表达上调的蛋白取交集，共筛选出15个符合该标准的候选蛋白，并据此选取辐射后表达下降最显著、而沉默LAMP2后表达升高最显著的蛋白KRT6B，作为CMA潜在调控的靶蛋白。通过血清饥饿诱导SW480细胞发生CMA，结果示于图 2，KRT6B的蛋白表达显著抑制。随后，在SW480细胞中过表达LAMP2后，KRT6B的蛋白水平明显下调。类似地，HSPA8的过表达同样导致KRT6B蛋白表达降低。

注：Stra.血清饥饿处理 图 2 在血清饥饿处理后(A)、LAMP2(B)或HSPA8(C)过表达后KRT6B的蛋白表达 Figure 2 KRT6B expression after serum starvation treatment (A), LAMP2 overexpression (B), and HSPA8 overexpression (C)

3.电离辐射促进KRT6B与HSPA8、LAMP2结合：结果示于图 3，免疫共沉淀结果证实了HSPA8、LAMP2与KRT6B之间的相互结合关系，并显示电离辐射能够分别增强两者的结合程度。至此，明确了KRT6B是SW480细胞中CMA途径的靶蛋白，并揭示电离辐射可强化HSPA8与LAMP2对KRT6B的识别和结合。

图 3 8 Gy电离辐射后不同时间LAMP2(A)或HSPA8(B)与KRT6B的免疫共沉淀分析。 Figure 3 CO-IP analysis-derived interactions of LAMP2(A) or HSPA8(B) with KRT6B at different times after 8 Gy ionizing radiation

4.KRT6B促进结肠癌细胞的辐射敏感性：为了研究KRT6B是否对辐射有反应性，检测了SW480细胞中照射后不同时间点KRT6B蛋白的表达情况，示于图 4。KRT6B的蛋白表达在24 h为(0.47±0.30)%，48 h为(0.46±0.25)%，与0 h(0.98±0.33)% 相比显著下降(t=21.35、3.68，P < 0.05)。为检测是否电离辐射通过靶基因KRT6B影响结肠癌细胞的辐射敏感性，在SW480细胞中过表达KRT6B，剂量存活曲线显示，KRT6B过表达组的SW480细胞辐射敏感性明显高于对照组(F=179.70，P < 0.05)。此外，台盼蓝染色检测8 Gy照射后细胞的死亡率，结果显示KRT6B过表达组细胞的死亡率为(32.45±0.77)%，比起对照组的(25.51±1.02)%显著上升(t=9.42，P < 0.05)。

注：a与NC-8 Gy相比, t=9.24，P < 0.05；b与NC-8 Gy相比，t=9.42，P < 0.05； 图 4 照后不同时间KRT6B表达(A)及其对细胞存活(B)和死亡(C)的影响 Figure 4 KRT6B expression at different times after irradiation (A) and its effects on cell survival rate (B) and mortality rate (C)

5.验证HSPA8与KRT6B的结合位点：为进一步确认HSPA8与KRT6B之间的结合位点，使用KFERQ finder V0.8对KRT6B序列进行分析，筛选出其包含的5个KFERQ样基序，示于图 5。针对这5个基序，构建了相应的KRT6B突变体过表达质粒。SW480细胞的免疫共沉淀实验结果显示突变体3(204-208)转染的KRT6B失去了与HSPA8的结合能力，提示HSPA8与KRT6B的结合位点位于KRT6B的第204~208位氨基酸残基区域。

注：WT.KRT6B.野生型质粒；MUT1.KRT6B.突变体1型质粒；MUT2.KRT6B.突变体2型质粒；MUT3.KRT6B突变体3型质粒；MUT4.KRT6B突变体4型质粒；MUT5.KRT6B突变体5型质粒 图 5 KRT6B突变体过表达质粒示意图(A)及与HSPA8的免疫共沉淀实验(B) Figure 5 Schematic diagram showing the overexpression plasmids of KRT6B mutants (A) and CO-IP experiment-derived binding of KRT6B with HSPA8 (B)

6.在SW480细胞中沉默KRT6B后，8 Gy照射后细胞死亡率为(9.86±1.20)%，相比shControl组(13.45±1.16)%显著降低(t=3.73，P < 0.05)；而沉默KRT6B后再沉默LAMP2，则8 Gy照射后细胞死亡率(16.39±1.38)%，相比沉默KRT6B组死亡率升高(t=6.18，P < 0.05)，表明KRT6B可以促进结肠癌细胞的辐射敏感性，且可以被LAMP2的表达所调控(表 1)。综上所述，电离辐射会促进结肠癌细胞中CMA的活化；而HSPA8通过与KRT6B第204~208位点结合介导KRT6B的降解，从而降低SW480细胞的辐射敏感性。

表 1(Table 1)

表 1 沉默KRT6B后再沉默LAMP2对照射后细胞的死亡率的影响 Table 1 Ionizing irradiation-induced cell mortality rates of LAMP2 silencing following KRT6B silencing 组别 样本数 细胞死亡率(%) shControl-0 Gy 3 5.25±0.74 shControl-8 Gy 3 13.45±1.16 shLAMP2-8 Gy 3 18.78±0.10 a siKRT6B-8 Gy 3 9.86±1.20 a shLAMP2+siKRT6B-8 Gy 3 16.39±1.38 b 注：a与shControl-8 Gy相比，t=7.95、3.73，P < 0.05；b与siKRT6B-8 Gy相比，t=6.18，P < 0.05。

表 1 沉默KRT6B后再沉默LAMP2对照射后细胞的死亡率的影响 Table 1 Ionizing irradiation-induced cell mortality rates of LAMP2 silencing following KRT6B silencing

CRC是全球发病率第三位的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因之一。目前，放射治疗是CRC患者重要的临床治疗手段，尤其适用于无法接受根治性手术和化疗不耐受的患者。然而，CRC的低放射敏感性^[8]和对周围正常组织的高毒性，显著限制了临床上CRC患者的放射治疗效果，是目前结直肠癌治疗面临的难题^[9]。因此，深入探究CRC放疗抵抗的分子机制，探索新的临床治疗靶点及辐射增敏药物至关重要。

CMA是自噬的一种特殊形式，该过程中溶酶体可以选择性地降解细胞内特定的蛋白质。CMA通过对底物蛋白的精准识别和降解，在调节细胞稳态及应对应激中发挥重要作用，包括调控糖和脂代谢、DNA修复、细胞重编程和应激反应等多个生物学过程^[10]。已有多项研究揭示了CMA可能影响肿瘤疾病的进程^[11]。一方面，在非三阴性乳腺癌中，CMA通过选择性降解上皮-间充质转化的关键转录因子Snail，从而抑制肿瘤的发生发展^[12]；另一方面，CMA通过增强肿瘤细胞的迁移和增殖能力，促进肿瘤进展^[13]。这些研究提示，CMA在肿瘤学中可能具有双重调控作用，具体效应依赖于细胞类型及病理环境。

HSPA8是HSP70家族结构型同源蛋白，是生物体中普遍存在一种高度保守的热休克蛋白，通过促进蛋白质的正确折叠、移位及降解等过程，维持细胞的正常形态及功能，保证细胞的稳定性^[14]。而在CMA中，HSPA8能够识别并结合含有KFERQ或其类似序列的底物蛋白，形成伴侣-底物复合物后与溶酶体相关膜蛋白2A(LAMP2A)相互作用，通过膜转运到溶酶体腔内，并被腔内蛋白酶降解^[12]。但是，有关CMA对肿瘤辐射敏感性的影响，目前还知之甚少。本研究揭示了电离辐射可显著上调结肠癌SW480细胞中CMA限速因子LAMP2的表达，而HSPA8的总体表达水平未见显著变化。值得注意的是，HSPA8作为CMA靶蛋白转运的载体，其表达量恒定并不意味着介导靶蛋白运输的效率保持不变。后续实验也进一步证明，电离辐射可增强HSPA8、LAMP2与CMA靶蛋白之间的相互作用，提示CMA通路在结肠癌细胞的辐射应答过程中被上调，该发现为阐明CMA介导的结肠癌放射抵抗提供了新的机制依据。

KRT6B是角蛋白家族中的一员，广泛分布于上皮组织中，主要在维持细胞形态、支撑细胞骨架结构及提供机械强度方面发挥关键作用。在肿瘤研究领域中，KRT6B已被筛选为三阴性乳腺癌的潜在生物标志物，与肿瘤转移及患者预后密切相关^[15]。此外，单细胞转录组学研究表明，膀胱癌细胞分泌的外泌体中富含KRT6B，其可能通过诱导上皮间充质转化并调节肿瘤免疫微环境促进肿瘤的浸润与侵袭^[16]。

本研究发现，在结肠癌细胞中KRT6B蛋白位于204~208残基的KFERQ样基序能被HSPA8特异性识别并结合，进而通过CMA途径被降解，其在结肠癌细胞中的降解过程与辐射抗性形成关联，为靶向干预提供了明确的分子靶点，通过设计针对该结合位点的抑制剂或小分子化合物，有望阻断HSPA8与KRT6B的相互作用，抑制CMA介导的KRT6B降解，从而恢复结肠癌细胞的辐射敏感性。这一通路的发现也为联合治疗的设计提供了依据，例如将CMA抑制剂与放疗联合使用，可能通过上调KRT6B表达增强肿瘤的放疗效果。

值得关注的是，本研究中电离辐射仅显著上调CMA关键蛋白LAMP2的表达，而HSPA8的蛋白水平未发生明显变化，但免疫共沉淀实验证实电离辐射可显著增强HSPA8、LAMP2与KRT6B的相互作用，提示在HSPA8表达量恒定的情况下，辐射可能通过诱导HSPA8的构象变化，增强其与底物的结合活性，从而启动CMA通路。

但是，研究还存在一些局限性：首先，研究仅用到了SW480细胞，且缺少动物实验和临床样本的验证；其次，KRT6B在结肠癌细胞中主要影响的细胞死亡方式、调控结肠癌细胞辐射敏感性的具体机制尚不明确；最后，也不能排除是否存在其他通路协同调控KRT6B的表达。未来的研究将针对上述问题重点开展，为临床转化提供更充分的理论依据。

综上所述，研究揭示了电离辐射可以促进结肠癌SW480细胞中的CMA，KRT6B是SW480细胞中CMA新的底物蛋白，KRT6B蛋白表达的下降会增强SW480细胞的辐射抗性，这些发现表明KRT6B在结肠癌的进展中扮演关键角色，可能成为临床预后的标志物或潜在的治疗靶点，为未来结肠癌治疗策略提供新的方向。

利益冲突  无

作者贡献声明  张钰杰负责实验设计、实验操作、数据整理、起草论文；尹玉施、何翔、林德焕、孙以勒协助实验操作和论文修改；刘晓冬和马淑梅指导实验设计和论文撰写