2026, Vol. 46
2. 郑州大学附属肿瘤医院普外科, 郑州 450008;
3. 中美(河南)荷美尔肿瘤研究院, 郑州 450003;
4. 郑州大学基础医学院, 郑州 450001
2. Department of General Surgery, Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450008, China;
3. China-US(Henan) Hormel Cancer Institute, Zhengzhou 450003, China;
4. Basic Medical College of Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China
新辅助放化疗为局部进展期直肠癌患者的标准治疗方法之一，可以有效减轻肿瘤负荷，降低分期，有利于手术完整切除肿瘤，减少复发[1]。然而，由于肿瘤异质性，部分患者表现出放疗抵抗。据统计，新辅助放化疗后完全缓解的患者较未达到完全缓解的患者具有较好的生存率，而且肿瘤复发和进展发生率显著下降[2]。如果能够在治疗启动阶段筛选出一些预测新辅助治疗效果的标志物，有利于及时调整患者治疗方案，从而实现个体化治疗[3-4]。在直肠癌中，传统评估放化疗疗效依赖影像学或病理学检查，通常需数周至数月；其他一些常用的治疗前临床、病理参数等在疗效预测方面亦存在特异性不足等缺点[5-6]。目前，鲜有令人满意的生物标志物来预测局部进展期直肠癌新辅助放化疗疗效并对患者进行分层。
血浆含有大量的生物分子，能够反应机体微环境状况；自血浆筛选生物标志物具有取样方便、侵入性小、样本稳定的特点[7]。基于质谱的血浆蛋白质组学是一种高通量检测手段，能够通过全面探索血浆蛋白质组成及其丰度的变化，筛选出与放化疗疗效相关的生物标志物[8]。同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)蛋白质组学可以同时提供定量信息和肽段的鉴定[9]。本研究采用iTRAQ蛋白质组学技术筛选并鉴定预测局部进展期直肠癌患者新辅助放化疗疗效的血浆标志物，并进行验证评估其应用价值。
资料与方法1.患者入组标准：经病理活检确诊为直肠腺癌；根据美国癌症联合委员会(AJCC)第8版分期标准为T3~4；直肠腔内超声、盆腔磁共振(MR)或计算机体层成像(CT)检查局部淋巴结阳性(N+)；无远处转移。
2.患者一般资料：本研究获得郑州大学附属肿瘤医院伦理委员会的批准(伦理号：82403140)，回顾性分析了2018年1月至2023年12月在该院治疗的直肠癌患者，共有127例初治局部进展期直肠癌患者符合上述纳入标准，其中15例患者被除外，原因如下：中途退出治疗，拒绝完成全部放疗计划，未能完成化疗。共有112例患者完成新辅助放化疗联合手术，年龄(56.18 ±8.64)岁(表 1)。
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表 1 患者一般资料 Table 1 The characteristics of eligible patients |
3. 新辅助放化疗：放化疗前所有患者均签署知情同意书。采用同步放化疗模式，调强放疗剂量为50.4 Gy/28次，化疗采用卡培他滨(825 mg/m2)联合奥沙利铂(130 mg/m2)或伊立替康(180 mg/m2) 方案。
4.血浆采集与分离：采集患者放疗前(1周内)、放疗早期(放疗开始第5天)血液标本。以肝素管采集5 ml空腹血液样本，在4℃、1 150 × g离心10 min得到血浆样本，分装至1.5 ml离心管，保存于-80℃冰箱备用。
5.术后评估：放疗结束后8~10周行手术，术后由专门的病理医师对新辅助放化疗效果进行评价。采用肿瘤退缩等级(TRG)分级，具体为：0级：肿瘤完全消退，组织纤维化或者坏死，无残存肿瘤细胞，完全应答；1级：单个或少部分肿瘤细胞，中度应答；2级：残余癌伴随纤维化，轻度应答；3级：仅杀伤较少的肿瘤细胞，应答差。对所有纳入的患者定期进行随访。
6.蛋白质组学分析：选取TRG 0级和TRG 3级患者血浆标本，首先去除高丰度蛋白质(人去血清高丰度亲和色谱柱，美国安捷伦公司)。通过二喹啉甲酸(BCA)法测定所获得的低丰度蛋白样品，分别进行十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白酶解、肽段分离(C18 Cartridge，美国赛默飞世尔公司)、iTRAQ标记(美国应用生物系统公司)、阳离子交换色谱分级、高效液相色谱及质谱分析鉴定。
7.生物信息学分析：采用Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4软件对质谱初始数据进行分析和鉴定。比值＞1.5或＜0.667作为差异蛋白选取标准。分别进行基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。
8.酶联免疫吸附试验(ELISA)：取50 μl血浆标本，加入同等体积的0.9%生理盐水稀释。采用人补体C3-ELISA试剂盒(英国Abcam公司)测定样本含量。分别设置标准孔、空白对照孔及样品孔。除空白孔外，其他孔依次加入酶标试剂，孵育、洗板及显色后，酶标仪读取450 nm处吸光度(A)。
9.动物实验：选取6~8周龄的BALB/C雄性小鼠，平均体质量约为21 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(豫)2023。饲养于无特定病原体动物房，采用12 h光照，12 h黑暗的循环模式，温度20~26℃，湿度40%~70%。在小鼠背部皮下种植对数生长期的CT26结直肠癌细胞(磷酸盐缓冲液与基质胶1∶1配置，106个/100 μl)。待肿瘤体积为100 mm3时，以随机数表法将小鼠随机分为对照组、地塞米松组、照射组、照射+地塞米松组，每组6只，照射剂量为2 Gy×5次，剂量率0.01 Gy/s，1次/d，连续照射5 d，射野1 cm × 1 cm，源皮距100 cm，照射采用美国拉德索斯公司RS 2000 Pro 160 kV X射线生物辐照仪。自照射开始，每日腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液(0.3 mg/kg)，共10 d。实验期间，定期测量肿瘤体积，监测小鼠体质量。第21天处死小鼠，摘取肿瘤组织，保存于液氮。
10.免疫荧光实验：取冷冻的肿瘤组织，-20℃解冻并制备厚度为7 μm的切片，固定后，室温下在封闭液(磷酸盐缓冲液内含10%胎牛血清及0.1%聚乙二醇辛基苯基醚，北京索莱宝科技有限公司)中孵育1 h。以磷酸盐缓冲液洗涤，在4℃下与封闭液稀释后的一抗(鼠C3b/iC3b/C3c单克隆抗体，荷兰Hycult Biotech公司，绿色荧光；Alexa Fluor 647鼠CD31抗体，美国Biolegend公司，红色荧光)孵育过夜。再次以磷酸盐缓冲液洗涤，室温下与封闭液稀释后的荧光素偶联二抗(美国Biolegend公司)孵育1 h。再次洗涤后，加入4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，北京索莱宝科技有限公司)，室温避光孵育5 min。洗涤干燥后，以荧光淬灭剂(北京索莱宝科技有限公司)封片，激光共聚焦显微镜(日本Olympus公司)下观察分析。
11.统计学处理：应用GraphPad prism 9.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布，采用x±s表示。两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。
结果1.术后病理分级：术后病理分析显示，19例患者为TRG 0级，其中，男性9例，女性10例，平均年龄(62.9±9.6)岁，均为中分化腺癌，术后病理分期T0N0共14例，T0N1 5例。TRG 1级39例，TRG 2级40例，TRG 3级14例。
2.差异表达蛋白质筛选：选取TRG 0级患者放疗前和放疗开始后1周的血浆标本，进行iTRAQ定量蛋白质组学分析筛选差异蛋白质。结果显示，在直肠癌患者血浆中共鉴定到蛋白质439个，放疗前后差异表达蛋白质98个，其中67个蛋白表达上调，31个下调。
3.差异表达蛋白质GO功能和KEGG通路富集分析：对差异表达蛋白质进行GO功能富集分析，结果表明放疗过程中，差异蛋白主要参与对外界应激反应的调节，补体活化、免疫应答和炎症反应等重要生物学过程(图 1)。差异表达蛋白KEGG分析显示，补体和凝血级联反应通路显著富集(图 2)。
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图 1 TRG0级患者放疗前后差异表达蛋白GO富集分析(前10位) Figure 1 Go enrichment analysis of differentially expressed proteins in patients achieved TRG0 after radiotherapy (Top 10) |
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图 2 TRG0级患者放疗前后差异表达蛋白KEGG通路分析(前15位) Figure 2 KEGG pathway analysis of differentially expressed proteins in patients achieved TRG0 after radiotherapy (Top 15) |
4.差异蛋白定量分析及验证：为明确放疗诱导的免疫应答，对差异表达蛋白进行了定量分析。如图 3所示，补体和炎症级联反应在放疗后显著上调。通过对112例新辅助放化疗前后血浆补体C3含量比较分析发现，放化疗开始1周内，TRG 0及TRG 1组患者补体C3表达量呈现明显上升趋势。而TRG2和TRG3患者血浆补体C3在放化疗过程中呈现出轻度上升或减少趋势。TRG 0和TRG 1级补体C3表达水平较TRG 2及TRG 3级显著升高，差异具有统计学意义(t=4.55~9.01，P＜0.05)。
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注：TRG.肿瘤退缩分级；a与TRG0比较，t=4.55~9.01，P < 0.05 图 3 直肠癌患者放疗前后差异蛋白定量分析及验证 A.差异蛋白定量分析热图(前10位)；B.患者肿瘤退缩分级与放化疗过程中血浆补体C3含量变化分析 Figure 3 Quantitative analysis and verification of differentially expressed proteins before and after radiotherapy in patients of rectal cancer A.Heatmap of top 10 differentially expressed proteins derived from quantitative analysis(Top 10); B.The relationship between tumor regression grade and serum concentration of complement C3 |
5.动物实验：采用补体抑制剂地塞米松处理接受照射的荷瘤小鼠，以验证补体在放射诱导的肿瘤应答中的作用。如图 4所示，照射组小鼠肿瘤控制显著优于照射联合地塞米松组(t=3.07，P＜0.05)。肿瘤组织免疫荧光分析显示，地塞米松处理降低了放射诱导的局部补体的活化程度(t=8.57，P＜0.05)。
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注：与对照组比较，at=1.19~3.78，P < 0.05；bt=5.03~9.71，P < 0.05；图C中红色为CD31，黄绿色为补体C3 图 4 各组小鼠移植瘤抑制补体活化对肿瘤组织的影响 A.小鼠肿瘤控制情况；B.肿瘤组织补体活化情况定量分析；C.肿瘤组织补体免疫荧光染色×200 Figure 4 The effect of inhibition of complement activation on tumor tissues in tumor-bearing mice A. Mice tumor control; B. Quantification of complement activation in tumor tissues; C. Immunofluorescence of tumors that stained with antibody recognizing complement ×200 |
讨论
对于局部进展期直肠癌，如果能够在治疗前准确地预测新辅助放化疗的疗效并对患者进行分层，有助于提升治疗效果，提高保肛率，改善患者预后[1]。治疗前中性粒细胞/淋巴细胞比值、新辅助放化疗与手术间隔时间、TRG、术后病理分期、血管和神经侵犯、术后辅助化疗、基因分型和新辅助放化疗前的CA19-9等都与治疗效果密切相关[10-11]。尽管新辅助放化疗后达到TRG 0级比例较低，但此类患者的总生存期和无进展生存期明显优于其他患者[12]。然而，鲜有研究关注TRG 0级患者放疗早期机体内环境变化情况。本研究中，所纳入标本均为直肠腺癌患者，通过差异表达蛋白质富集分析，发现补体水平发生显著变化；治疗早期补体通路的激活与患者新辅助放化疗疗效相关，补体水平的升高可改善抗肿瘤免疫应答，提高放疗疗效。
补体作为血清蛋白的组成成分，在先天免疫系统中发挥重要作用。虽然大多数补体因子在肝脏中产生，但已知的补体成分，尤其是C3，可以由各种不同类型的组织和细胞在局部产生，包括肿瘤细胞[13]，这种局部产生的补体导致C3a和C5a的活化。有研究显示，肿瘤微环境中的补体活化并未产生抗肿瘤作用，反而加速肿瘤生长和疾病进展[14]。然而，少有研究探讨补体活化和放疗疗效之间的联系。放疗除了通过直接诱导DNA损伤控制肿瘤的生长，还可电离水分子产生活性氧自由基，导致肿瘤细胞凋亡、坏死、衰老和有丝分裂灾难[15]。在此过程中，濒临死亡的肿瘤细胞会释放损伤相关分子模式(DAMPs)、细胞因子及补体成份，激活免疫系统并增强抗肿瘤免疫[16]。本研究发现放疗可促进局部产生补体，放疗过程中补体的激活增加了抗肿瘤效应。
肿瘤中补体系统活化所产生的这种截然相反的效应，具有争议。既往有学者认为，补体活化增加了对凋亡肿瘤细胞的清除，创造了一个抗炎环境，存活下来的肿瘤细胞可以在其中生长，故产生促进肿瘤进展作用；使用补体C3抑制剂可以调节放疗后的免疫应答，促进中性粒细胞的内流，减少凋亡细胞的清除，并产生更多可用的新抗原，诱导产生促炎的肿瘤微环境。分割放疗模式可能会产生更多凋亡状态的细胞[17-19]。然而，Nolan等[20] 认为肿瘤微环境中募集的中性粒细胞在炎症应答早期阶段处于活化状态，通过脱颗粒激活Notch信号通路促进肿瘤进展。因此，肿瘤微环境中补体的促瘤作用有待进一步研究鉴别。Gadwa等[21] 发现补体C3a和C5a拮抗剂促进微环境中Treg细胞浸润，加速肿瘤生长；局部产生的补体C3a和C5a则有利于CD4+T细胞内稳态和发育成熟。本研究从蛋白组学水平证明了放疗早期补体系统的激活对提高肿瘤退缩率具有重要意义。尽管如此，补体激活产生促癌或抗肿瘤反应仍不明确，需要更多的研究来揭示其生物学效应。
以地塞米松为代表的糖皮质激素是放化疗中常用的抗炎药物，主要用于减轻炎症反应，抗过敏、减轻呕吐等症状[22]。Battaglia等[23] 给予小鼠皮下移植瘤单次15 Gy照射，后采用皮下注射方式给予地塞米松，发现地塞米松可抑制小鼠杀伤性T细胞的活化及功能。本研究发现应用糖皮质激素可以抑制补体系统的激活，削弱射线的肿瘤杀伤效应。值得注意的是，本研究采用的是常规分割放疗模式，地塞米松采用每日腹腔注射，这可能不同于单次大分割放疗的补体激活效应。因此，糖皮质激素对放疗的肿瘤杀伤效应的影响，有待进一步证实。尽管如此，需要潜在的糖皮质激素替代方案来处理放化疗相关不良反应；在放疗早期阶段，宜谨慎使用糖皮质激素等，尽量避免补体系统抑制减弱治疗效果。
此外，本研究中，除补体系统外，HMOX1、白介素6(IL-6)、IL-1β，NFKB1等表达水平在放疗后也发生了显著上调。在细胞内受到外界的氧化应激时，HMOX1蛋白表达会逐渐升高，通过产生一些中间代谢产物，发挥保护作用[24]。这从侧面证实了放疗后受照射组织氧化应激水平升高，即低传能线密度(LET)的射线作用于生物大分子，主要表现为间接作用。而IL-6、IL-1β，NFKB1等则反映了受照后组织发生了炎症反应和免疫应答[25]。总之，放疗不仅通过直接杀伤肿瘤细胞发挥作用，还可重塑肿瘤微环境，活化免疫系统，发挥抗肿瘤效应。
综上所述，本研究采用iTRAQ质谱技术，对接受新辅助放化疗的局部进展期直肠癌TRG 0级患者血浆蛋白质进行研究，筛选出部分与放疗疗效相关差异蛋白质。在这些差异蛋白质中，以补体系统相关蛋白变化最为明显，这将为下一步改善直肠癌新辅助放化疗疗效提供思路和理论基础。
利益冲突 无
志谢 感谢瑞士洛桑大学附属医院放疗科团队对本文的指导与帮助
作者贡献声明 杨成梁、彭良群、罗辉、聂文娜负责标本收集与处理，数据整理分析及论文撰写；刘慧、张燕平、徐萌、王义武、吴明霞负责部分论文撰写及文献整理；葛红指导实验设计及修改论文
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