食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的放射治疗抵抗是制约临床疗效的主要挑战，其机制涉及复杂的肿瘤微环境调控^[1]。近年来，辐射旁效应(radiation-induced bystander effect, RIBE)逐渐成为研究热点，即受照射细胞通过分泌信号分子引发邻近或远隔未受照射细胞的生物学改变^[2]，这一现象可能加剧肿瘤复发与转移。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1, HMGB1)作为关键的损伤相关分子模式(damage associated molecular pattern, DAMP)，在电离辐射后可发生核-质转位并通过外泌体或主动分泌等途径释放至细胞外，参与调控细胞间通讯^[3-5]。本研究发现，辐射诱导的细胞外HMGB1可直接增强ESCC细胞的增殖、侵袭能力并抑制凋亡，通过旁分泌途径激活未受照射细胞的恶性表型，提示其可能是介导辐射旁效应的核心分子。进一步实验证实，敲低HMGB1显著减弱受照射细胞培养上清对受体细胞的促癌作用，表明HMGB1依赖的细胞间信号传递在放射抵抗中具有关键地位。该研究揭示了HMGB1在ESCC辐射旁效应中的调控作用，为通过靶向DAMP分子微环境重塑以增敏放疗提供了新策略。

1.主要试剂与仪器：人类HMGB1酶联免疫吸附(ELISA)测定试剂盒(武汉Elabscience公司)、CCK-8试剂盒(美国MCE公司)、Annexin V+PI凋亡试剂盒(美国BD公司)、靶向抑制HMGB1表达的小干扰RNA(HMGB1 shRNA)及阴性对照(negative control，NC)(武汉吉因宝生物科技有限公司)；辐照装置为6 MV直线加速器(瑞典医科达公司Elekta synergy)，设定机架角180°，源靶距100 cm，培养瓶下置1 cm组织补偿膜。

2.细胞株来源：ECA109和TE13人食管鳞癌细胞株，由河北医科大学第四医院科研中心提供。

3.ELISA技术测定培养基中HMGB1蛋白水平：收集贴壁培养的食管鳞癌细胞在不同照射剂量(0、2、4、6、8和10 Gy)以及照射后不同时间点(0、1、2、4、8、12和24 h)培养基上清液，以1 000 × g离心20 min，过滤器过滤上清液以备检测。样本存放于4℃，在1周内检测，按照HMGB1/ELISA试剂盒说明书操作步骤进行测定。

4.细胞分组及相应上清液收集：辐射后将食管鳞癌细胞分为S-IR-对照组、S-IR-阴性对照组和S-IR-HMGB1-shRNA组。上清液的收集：相同数量ECA109及TE13细胞的对照组、阴性对照组及HMGB1-shRNA组细胞，铺入培养瓶。待细胞贴壁后给予10 Gy辐射，照射后立即更换新鲜培养基。照射后12 h收集对照组、阴性对照组和HMGB1-shRNA组细胞培养上清，置入15 ml离心管。无菌条件下1 000 × g离心20 min，取上清过滤。离心、过滤处理后的上清液用于培养ECA109及TE13细胞。

5.检测细胞增殖能力：通过CCK-8进行检测，收集ECA109和TE13细胞上清液，将10 Gy辐射后12 h的上清液分为S-IR-对照组、S-IR-阴性对照和S-IR-HMGB1-shRNA组，相应的未经照射的培养上清液分为S-对照组、S-阴性对照组和S-HMGB1-shRNA组。利用以上6组细胞上清液来培养ECA109和TE13细胞，取指数生长期细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液(5×10⁴个/ml)，混匀后移液器吸取100 μl接种于96孔板待测样品孔，放入5%CO₂、37℃无菌培养箱中生长，在特定时间点(24、48、72和96 h)向96孔板待测样品孔中每孔加入10 μl CCK-8检测液，放入无菌培养箱中培养2 h，用酶标仪检测各样品孔在450 nm处吸光度(A)值。

6.Transwell侵袭小室共培养模型及分组：1×10⁵个经10 Gy辐射的阴性对照和HMGB1-shRNA细胞铺入下室，各加入600 μl含牛血清培养基，分别标记为S-IR-NC和S-IR-HMGB1-shRNA实验组，对照组下室铺入未经辐射阴性对照、HMGB1-shRNA细胞，分别标记为S-NC、S-HMGB1-shRNA组。数2.5×10⁴个未经辐射的ECA109或TE13细胞，铺入含基质胶的上室，加入200 μl不含牛清培养基。放入培养箱中培养24 h后染色并计数各组穿膜细胞数。

7.流式细胞仪检测细胞凋亡：收集10 Gy辐射后12 h的阴性对照组及HMGB1-shRNA组细胞培养上清，无菌条件下1 000 × g离心20 min，过滤处理后用于培养ECA109及TE13细胞7 d，然后对细胞进行6 Gy辐照，胰酶消化各组细胞，制成密度为1×10⁶个/L的细胞悬液，按Annexin V+PI细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，流式细胞仪检测，Flowjo软件计算细胞凋亡率。

8.克隆形成实验：收集10 Gy辐射后12 h的阴性对照组及HMGB1-shRNA组细胞培养上清，无菌条件下1 000 × g，离心20 min、过滤处理后用于培养ECA109及TE13细胞7 d，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗对数生长期的各组细胞，用胰蛋白酶消化并制备细胞悬液，进行细胞计数并根据接受的照射剂量接种不同数量细胞，按照0、2、4、6和8 Gy的照射剂量分别接种的细胞个数为2 000、4 000、6 000、8 000和10 000个，接种于6孔板中，每组设3个复孔，放于37℃培养箱中培养；各组细胞每天更换1次相应培养基，注意观察细胞克隆集落形成情况，培养14 d后结晶紫染液，使用Image J软件进行细胞集落计数分析。细胞克隆形成率(%)=克隆数/接种细胞个数×100%，运用GraphPad Prism9软件单击多靶模型程序拟合细胞存活曲线，测定并计算放射生物学参数外推数、平均致死剂量(mean lethal dose, D₀)、准阈剂量(the dose quasi-threshold, D_q)、2 Gy射线照射后细胞存活分数(survival fraction of 2 Gy, SF₂)。

9.统计学处理：采用GraphPad Prism9软件进行统计学数据分析。数据符合正态分布及方差齐性，以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，通过方差分析比较多组数据之间的差异，P < 0.05为差异具有统计学意义。

1.辐射诱导食管鳞癌细胞胞外释放HMGB1蛋白：通过ELISA实验检测贴壁培养的食管鳞癌细胞在不同照射剂量(0、2、4、6、8和10 Gy)以及照射后不同时间点(0、1、2、4、8、12和24 h)培养基上清液中HMGB1蛋白的含量。结果显示，随着照射剂量的增加，培养基上清液中的HMGB1蛋白含量也增加，其中以10 Gy照射时的含量最高。进一步检测了10 Gy照射后不同时间点HMGB1的表达和迁移，结果显示随着照射时间的延长，培养基上清液中的HMGB1蛋白含量逐渐增加，在12~24 h达到最高水平(图 1)。在敲低HMGB1基因表达的实验中，观察到ECA109和TE13细胞HMGB1-shRNA组的细胞上清液中HMGB1蛋白含量显著下降，与对照组比较，差异均有统计学意义(t=12.28、5.48，P＜0.05)，与阴性对照组比较，差异也均有统计学意义(t=15.47、7.94，P＜0.05，表 1)。结果表明，射线作用后可促使食管鳞癌细胞向胞外释放HMGB1蛋白，并且随照射剂量升高HMGB1蛋白表达得越多，在照射后12 h内胞外HMGB1蛋白含量持续上升。

注：ELISA.酶联免疫吸附试验；HMBG1. 高迁移率族蛋白B1 图 1 ELISA检测不同剂量照射(A)和10 Gy照射后不同时间点(B)食管鳞癌ECA09和TE13细胞培养上清液中HMGB1蛋白含量 Figure 1 ELISA assay of HMGB1 released in the culture supernatants of esophageal squamous cell carcinoma cells at different doses (A) and different time points after 10 Gy irradiation (B)

表 1(Table 1)

表 1 各组敲低HMGB1后食管鳞癌细胞ECA09和TE13培养上清液中HMGB1蛋白表达(pg/ml, x±s) Table 1 HMGB1 expression in the culture supernatants of esophageal squamous cell carcinoma cell lines ECA109 and TE13 after HMGB1 knockdown(pg/ml, x±s) 组别 样本数 ECA109 TE13 对照组 3 49.04±3.23 46.85±8.28 阴性对照组 3 50.04±2.13 48.57±5.68 HMGB1-shRNA组 3 18.95±2.76ab 18.91±3.09ab 注：a对照组比较，t=12.28、5.48，P＜0.05；b与阴性对照组相比，t=15.47、7.94，P＜0.05

表 1 各组敲低HMGB1后食管鳞癌细胞ECA09和TE13培养上清液中HMGB1蛋白表达(pg/ml, x±s) Table 1 HMGB1 expression in the culture supernatants of esophageal squamous cell carcinoma cell lines ECA109 and TE13 after HMGB1 knockdown(pg/ml, x±s)

2.辐射诱导食管鳞癌细胞胞外释放HMGB1蛋白对其增殖能力的影响：结果显示，ECA109和TE13细胞的S-对照、S-阴性对照、S-HMGB1-shRNA组细胞增殖差异均无统计学意义(P>0.05)，但从48 h开始，S-IR-对照和S-IR-阴性对照组癌细胞的增殖能力显著高于其他组。与S-IR-HMGB1-shRNA组相比，S-IR-阴性对照组细胞增殖能力明显升高(48 h: t_ECA109=5.07，t_TE13=5.43; 72 h: t_ECA109 =10.22，t_TE13 =13.14; 96 h: t_ECA109 =5.07，t_TE13 =5.96；P < 0.05)，而S-IR-HMGB1-shRNA组与未照射组S-HMGB1-shRNA相比，增殖能力差异无统计学意义(P>0.05，表 2)。这些研究数据表明，辐射诱导食管鳞癌细胞释放到细胞外的HMGB1蛋白可能会提高癌细胞的增殖能力。

表 2(Table 2)

表 2 各组细胞培养上清液不同时间处理后食管鳞癌细胞ECA09和TE13的增殖能力(x±s) Table 2 Effect of conditioned media with varying HMGB1 levels on the proliferation of esophageal squamous cell carcinoma cells ECA109 and TE13(x±s) 组别 样本数 24 h 48 h 72 h 96 h ECA109 TE13 ECA109 TE13 ECA109 TE13 ECA109 TE13 S-对照 3 0.86±0.06 1.33±0.09 1.40±0.03 1.82±0.05 1.99±0.19 1.89±0.03 2.11±0.16 2.21±0.10 S-阴性对照组 3 0.83±0.03 1.32±0.09 1.37±0.04 1.80±0.07 2.02±0.11 1.87±0.06 2.06±0.16 2.19±0.10 S-HMGB1-shRNA组 3 0.74±0.10 1.30±0.01 1.32±0.07 1.74±0.06 1.89±0.06 1.81±0.04 2.04±0.15 2.11±0.13 S-IR-对照组 3 0.89±0.02 1.36±0.03 1.68±0.07 1.90±0.02 2.24±0.11 2.35±0.06 2.41±0.19 2.44±0.09 S-IR-阴性对照组 3 0.83±0.03 1.31±0.01 1.71±0.08 1.97±0.03 2.34±0.06 2.33±0.02 2.41±0.11 2.43±0.10 S-IR-HMGB1-shRNA组 3 0.85±0.02 1.33±0.10 1.37±0.09a 1.84±0.02a 2.01±0.01a 1.91±0.05a 2.01±0.08a 2.05±0.05a 注：a与S-IR-阴性对照组的比较，t =5.074、5.430、10.216、13.139、5.07、5.963，P < 0.05

表 2 各组细胞培养上清液不同时间处理后食管鳞癌细胞ECA09和TE13的增殖能力(x±s) Table 2 Effect of conditioned media with varying HMGB1 levels on the proliferation of esophageal squamous cell carcinoma cells ECA109 and TE13(x±s)

3.辐射诱导的外泌HMGB1蛋白对食管鳞癌细胞侵袭能力的影响：应用Transwell侵袭小室模型检测辐射诱导的胞外释放蛋白HMGB1对食管鳞癌细胞侵袭能力的影响。结果发现，ECA109或TE13细胞的S-阴性对照、S-HMGB1-shRNA组之间穿膜细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)；而S-IR-阴性对照组穿膜细胞数(ECA109，37.67±3.06；TE13，68.33±3.51)明显高于S-阴性对照组(ECA109，18.33±2.08；TE13，47.00±6.23)，差异具有统计学意义(t=9.06、5.16, P＜0.01)；S-IR-HMGB1-shRNA组穿膜细胞数(ECA109，22.33±4.16；TE13，49.33±2.03)明显低于S-IR-NC组(ECA109，37.67±3.06；TE13，68.33±3.51)，差异具有统计学意义(t=5.14、5.76，P＜0.01)。以上研究数据表明辐射诱导的食管鳞癌细胞向胞外释放的HMGB1蛋白可能具有促进食管鳞癌细胞侵袭能力的作用。

4.辐射诱导的外泌HMGB1蛋白对食管鳞癌细胞凋亡的影响：结果发现，S-IR-阴性对照作用后的ECA109细胞凋亡率(3.16%±0.49%)较S-IR-HMGB1-shRNA组(16.35%±5.33%)明显降低(t=4.27，P=0.013)；同样，TE13细胞的S-IR-NC组凋亡率(3.23%±0.67%)显著低于S-IR-HMGB1-shRNA组(13.60%±4.24%)，差异有统计学意义(t=4.18，P=0.014)，见图 2。表明辐射诱导的胞外释放蛋白HMGB1可以抑制存活食管鳞癌细胞凋亡的发生，促进放射抵抗的产生。

图 2 6 Gy射线照射后共培养食管鳞癌细胞凋亡流式细胞图  A. S-IR-阴性对照组的ECA109细胞；B. S-IR-HMGB1-shRNA组的ECA109细胞；C. S-IR-阴性对照组的TE13细胞；D. S-IR-HMGB1-shRNA组的TE13细胞 Figure 2 Flow cytometry assay of apoptosis in the co-cultured esophageal squamous cell carcinoma cells after 6 Gy irradiation  A. ECA109 cells treated with conditioned medium from the S-IR-NC group; B. ECA109 cells treated with conditioned medium from the S-IR-HMGB1-shRNA group; C. TE13 cells treated with conditioned medium from the S-IR-NC group; D. TE13 cells treated with conditioned medium from the S-IR-HMGB1-shRNA group

5.辐射诱导的外泌HMGB1蛋白对食管鳞癌细胞放射敏感性的影响：结果列于表 3。克隆形成实验结果显示，与S-IR-阴性对照组相比，S-IR-HMGB1-shRNA组的ECA109细胞有着更低的D₀、N、D_q及SF₂值，差异均具有统计学意义(t=3.85、8.78、3.81、3.51，P < 0.05，表 3)；同样，在TE13细胞系中，两组间的D₀、N、D_q及SF₂值比较，差异均有统计学意义(t=2.81、4.49、2.82、3.32，P < 0.05)。细胞存活曲线结果显示，随着照射剂量的不断升高，ECA109和TE13细胞系中，S-IR-HMGB1-shRNA组两种细胞克隆存活分数与S-IR-阴性对照组相比显著下降，曲线下移。上述结果表明辐射诱导的胞外释放蛋白HMGB1可以显著抑制食管鳞癌细胞对电离辐射的敏感性。

表 3(Table 3)

表 3 食管鳞癌细胞ECA109和TE13的放射敏感性参数(x±s) Table 3 The radiosensitivity parameters of ECA109 and TE13 cells (x±s) 组别 细胞 样本数 D0 N Dq SF2 S-IR-阴性对照组 ECA109 3 1.36±0.06 2.29±0.14 1.12±0.06 0.45±0.01 TE13 3 1.22±0.11 2.61±0.33 1.14±0.11 0.43±0.01 S-IR-HMGB1-shRNA组 ECA109 3 1.03±0.06a 1.95±0.19a 0.69±0.09a 0.26±0.01a TE13 3 0.89±0.04a 2.53±0.30a 0.75±0.08a 0.28±0.01a 注：SF2.2 Gy照射时的存活分数a与同种细胞的阴性对照组相比，t=3.85、2.81、8.78、4.49、3.81、2.82、3.51、3.32，P < 0.05

表 3 食管鳞癌细胞ECA109和TE13的放射敏感性参数(x±s) Table 3 The radiosensitivity parameters of ECA109 and TE13 cells (x±s)

HMGB1作为细胞核内非组蛋白染色质结合蛋白，其生物学功能具有显著的空间依赖性。电离辐射导致水分子分解产生自由基，自由基可以转化为H₂O₂，进而诱导HMGB1的主动分泌^[6]，导致核-质转运增强。值得注意的是，电离辐射引发的氧化应激可诱导细胞膜通透性改变，促进HMGB1通过非经典分泌途径(如外泌体介导)释放至胞外微环境^[7]，这种亚细胞重分布使HMGB1从基因调控因子转化为促肿瘤信号分子。

本研究观察到辐射可导致食管鳞癌细胞内的HMGB1蛋白释放到胞外，这与以往有关结直肠癌^[8]、肺上皮细胞^[9] 等的研究结果一致。并且，本研究证实电离辐射诱导食管鳞癌细胞释放HMGB1具有剂量依赖性，HMGB1蛋白的胞外含量在照射后12~24 h达到峰值，提示辐射通过激活细胞主动分泌或膜通透性改变促进HMGB1外排。HMGB1作为关键损伤相关分子模式(damage associated molecular pattern, DAMP)，其释放可能介导辐射旁效应，通过结合TLR4/RAGE受体激活促生存信号通路^[3]，增强肿瘤细胞侵袭并抑制凋亡。敲低HMGB1显著降低其胞外水平，提示靶向HMGB1可能成为逆转食管癌放射抵抗的潜在策略。此外，Chen等^[10] 关于胰腺癌的研究表明，辐射后的胰腺癌细胞会释放大量HMGB1蛋白到胞外，而这些蛋白可显著促进胰腺癌细胞的侵袭能力，通过调节PI3K/pAkt-EMT信号通路影响细胞迁移过程。本研究中，同样观察到胞外HMGB1蛋白作用下的食管鳞癌细胞的侵袭能力明显增强。既往研究提示，HMGB1可能通过以下途径促进癌细胞侵袭进程：①激活TGF-β/Smad信号通路^[11]，上调Snail、Twist等转录因子表达。②通过NF-κB/STAT3信号通路，影响癌细胞上皮间质转化过程^[12]。③通过与RAGE结合调节巨噬细胞极化，极化的M2型巨噬细胞诱导癌细胞迁移和侵袭^[13]。此外，低氧条件下，HMGB1可通过调控RHOT1的表达将线粒体从高侵袭性肝癌细胞转移到低侵袭性肝癌细胞进而提高后者的迁移和侵袭能力^[14]，但在食管癌放疗过程中HMGB1驱动的促侵袭表型的分子机制仍需进一步探讨。

放射治疗和化疗的目标是诱导肿瘤细胞凋亡。然而，越来越多的证据表明辐射也会引起肿瘤微环境的变化，进而促进肿瘤的复发^[15]。本研究发现，辐射诱导的HMGB1蛋白的胞外释放会增强食管鳞癌细胞对放射线的抗性。胞外HMGB1作为损伤相关分子模式，可能通过RAGE/TLR4受体轴激活下游NF-κB和MAPK信号通路，诱导癌细胞的治疗抵抗。即炎症相关的HMGB1/TLR4/MyD88/NF-κB信号通路可通过调控促炎因子的分泌介导放射性肺损伤，干扰放疗疗效^[16]；此外，HMGB1可增强NF-κB介导的癌细胞凋亡，抑制HMGB1表达可以增强肝癌细胞对多柔比星抗癌药的敏感性^[17]。近年来研究发现，丹参酮、卡贝诺酮等许多中药成分可以通过多种途径抑制HMGB1的释放。这些机制包括刺激细胞质中HMGB1蛋白的自噬降解、抑制调控HMGB1释放的关键信号分子等^[18]。因此，评估这些具有抑制HMGB1释放作用的中药是否可以在不影响电离辐射治疗恶性肿瘤效果的前提下，同时预防辐射诱导的HMGB1过度释放，具有重要的研究意义。

本研究存在的局限性：辐射诱导HMGB1由食管癌细胞胞核向胞外转位并影响受体癌细胞放射敏感性的下游分子机制仍需进一步深入探索，并且辐射旁效应涉及因素较多，仍需要更加严谨的实验来进一步验证HMGB1在辐射旁效应中发挥的作用。此外，本研究仅进行了细胞水平的实验，为了将此项研究成果转化到临床应用，将来需进行动物体内验证，并收集临床患者组织标本和外周血，探索HMGB1作为改善食管鳞癌患者放射敏感性新靶标的可能性。

综上所述，辐射诱导胞外释放的HMGB1蛋白促进食管鳞癌细胞增殖能力、侵袭能力，抑制辐射后凋亡的发生，HMGB1可能是介导食管鳞癌辐射旁效应的关键因子，可作为改善食管鳞癌放射敏感性的分子靶点，但仍需对其机制进行更深入的探索，从而为中晚期食管癌患者提供新的治疗策略。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明  张雪原设计研究方案，完成实验，撰写论文；闫可收集整理数据；宋春洋参与实验操作与论文修改；沈文斌、祝淑钗指导论文修改