电离辐射暴露对人体健康的潜在威胁日益受到关注，特别是对电离辐射高度敏感的生殖系统损伤研究已成为环境健康领域研究的重点。睾丸作为男性生殖系统的核心器官，受到电离辐射后表现出显著的结构和功能损伤^[1-2]。研究表明，电离辐射不仅会造成睾丸结构的损伤，还可能通过调控基因表达，进一步发生功能障碍^[3]。然而，传统的组织学方法和其他的测序技术在揭示电离辐射所致睾丸损伤的分子机制方面存在局限性。单细胞转录组测序技术基于细胞异质性，在单细胞层面分析细胞类型特异性基因表达变化及生物学效应，为探究电离辐射对睾丸细胞的损伤提供了新的视角^[4]。本研究基于课题组既往电离辐射暴露患者的睾丸单细胞转录组数据，探索电离辐射对睾丸不同细胞群的影响及潜在的生殖毒性机制，为电离辐射对男性生殖健康的影响提供数据支持。

1.单细胞RNA-seq的数据来源与背景：本研究所使用的睾丸组织单细胞RNA测序数据来源于课题组前期工作基础，且数据已上传至国家基因组学数据中心(www.ngdc.cncb.ac.cn)，登录号为HRA004161。受照的睾丸组织取自¹⁹²Ir源(32 Ci，1.18×10¹² Bq)意外受照的30岁男性，取样时间为照后9个月，其精子活力在损伤后20个月内呈现典型生殖损伤特征。具体表现为前3个月精子浓度急剧下降；第4个月精子浓度接近0，活动精子完全消失。该状态持续约8个月后精子浓度开始恢复，但正常形态精子比例始终低于4%。受照9个月时睾丸活检显示生精小管结构异常，各级生殖细胞缺失，残留细胞线粒体呈现嵴结构减少等超微损伤^[5]。对照组为1例患附睾旁血管平滑肌纤维母细胞瘤样肿瘤的43岁男性(病理提示正常睾丸组织)。本研究获得了苏州大学附属第二医院医学伦理委员会的批准(审批号：JD-LK-2020-019-02)，患者均已知情同意。

2.单细胞RNA-seq的数据处理：使用Seurat包对单细胞RNA测序数据进行预处理、聚类、差异表达和可视化分析等。实验过程和结果评估使用统一设置进行过滤和标准化。质量控制标准设置为细胞表达的基因>200个，线粒体基因含量＜15%，核糖体基因含量＞1%。利用scDblFinder包去除数据中的双细胞^[6]。使用Harmony包对质量控制后的数据集进行整合，将前20个主成分(principal components，PCs)通过统一流形近似与投影(uniform manifold approximation and projection，UMAP)进行非线性降维处理^[7]，所得的数据集用于后续分析。

3.差异分析和功能富集分析：使用Seurat包中FindMarkers功能和MAST测试参数确定单个细胞簇的差异表达基因(标记基因)，并设置阈值为log2fold change≥0.25、min.pct=0.4。然后，利用clusterProfiler包进行基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)和基因本体(gene ontology，GO)分析^[8]，筛选差异表达基因(differentially expressed genes，DEG)并进一步探讨基因的功能和富集路径。

4.细胞轨迹分析：使用Monocle包运行分支表达分析建模(branched expression analysis modeling，BEAM)函数检测细胞分支之间的差异表达基因^[9]。通过默认流程执行不同细胞类型的伪时间分析，主要参数包括min_expr = 0.1和num_cells_expressed≥10。

5.统计学处理：所有统计分析均在R语言中完成。两组间基因表达和细胞比例的比较依据正态性用t检验或Wilcoxon秩和检验，差异表达基因筛选标准为log₂FC≥0.25、P < 0.05，经Benjamini-Hochberg法进行假发现率(false discovery rate，FDR)多重校正。功能富集分析采用clusterProfiler包，轨迹分析用Monocle包，细胞通信分析用CellChat包，均包含内建的统计检验和多重校正。结果可视化通过Seurat、ggplot2等R包完成。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.受到电离辐射照射后睾丸组织中聚类和单细胞亚群分群分析：对数据进行质量控制后保留了16 377个细胞，根据各亚群的特异性特征进行单细胞亚群注释，鉴定出未分化精原细胞、分化精原细胞、精母细胞、减数分裂期细胞、精子细胞、间质细胞、支持细胞、血管周围细胞、管周肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞、T细胞和肥大细胞。数据显示，在电离辐射(ionizing radiation, IR)影响下，睾丸中生殖细胞数量显著减少，体细胞比例显著上升至99%(图 1)。根据前期研究，该患者生精功能恢复，提示睾丸体细胞在辐射损伤修复发挥重要作用。

注：1.未分化精原细胞；2.分化精原细胞；3.减数分裂期细胞；4.精子细胞；5.巨噬细胞；6.T细胞；7.肥大细胞；8.管周肌细胞；9.间质细胞；10.血管周围细胞；KEGG.京都基因与基因组百科全书 图 1 单细胞转录组分析正常组和电离辐射组人睾丸细胞整体表达谱  A.睾丸单细胞数据的主要分群；B.堆叠图比较正常组与电离辐射组生殖细胞与体细胞比例；C.各细胞群高表达基因的KEGG结果点图 Figure 1 Single-cell RNA-seq analysis of global expression profiles in testicular cells from control and IR groups   A. Testicular cell subgroups; B. Stacked bar chart comparing the proportions of germ cells and somatic cells between control and IR groups; C. Dot plot presenting representative KEGG enrichment results for highly expressed genes in each cell population

2.单细胞测序分析揭示电离辐射暴露后生殖细胞的转录组变化：结果提示电离辐射组与正常组在精子发生的各个阶段存在明显差异。照射后，未分化精原细胞、分化精原细胞和早期精母细胞的比例显著下降，而其他细胞类型的比例则相应增加，表明精原细胞和早期精母细胞对辐射较为敏感。虽然电离辐射组的生殖细胞总数明显减少，但各类细胞仍有存活，意味着患者仍具有生育能力恢复的潜力。利用irGSEA包对照电离辐射暴露前后生殖细胞的变化进行比较分析，发现精子发生通路(P =1.2×10^-10)、PI3K-AKT-mTOR通路(P =3.1×10^-8)、DNA修复通路(P =2.2×10^-5)、Notch信号通路(P =6.7×10^-5)及活性氧(reactive oxygen species，ROS)(P =4.3×10^-6)通路均在受到辐射后显著下调，这表明电离辐射可能抑制了细胞周期调控、DNA修复和细胞能量维持相关的信号通路。此外，氧化磷酸化通路也受到显著抑制，尤其在精子分化的后期，进一步提示电离辐射可能损伤了生殖细胞的线粒体功能和能量代谢能力，见图 2。

注：1.未分化精原细胞；2.分化精原细胞；3.早期精母细胞；4.晚期精母细胞；5.减数分裂期细胞；6.早期精子细胞；7.晚期精子细胞 图 2 电离辐射暴露后人生殖细胞的变化  A.生殖细胞7个阶段细分的细胞比例条形图；B. 半小提琴图显示6个通路基因集的生殖细胞打分 Figure 2 Changes in human germ cells after irradiation   A. Bar chart showing the proportion of cells in seven detailed germ cell stages; B. Halfvlnplot showing irGSEA scores for all germ cells in six pathway gene sets between the two groups

3.电离辐射暴露后睾丸间质区域细胞中差异表达基因：针对睾丸间质区域细胞展开分析，发现电离辐射组与正常组在睾丸间质细胞和支持细胞的分布格局及基因表达特征上存在显著差异。结果示于图 3。电路辐射组中睾丸间质细胞比例由34.62%升至43.16%，内皮细胞比例由28.73%降至18.64%，而其他体细胞，如肥大细胞由8.43%降至2.69%，T细胞的比例由5.92%降至4.03%。这种现象可能源于生精小管萎缩导致体细胞比例相对增加，或辐射损伤后促进了睾丸间质细胞的增殖。进一步分析电离辐照组与正常组的差异，鉴定出7 758个差异基因，灰点为不显著基因，彩色点为通过阈值的基因(log₂倍数变化阈值为0.5)。位于右侧红色且超过阈值的点表示在电离辐射组上调的基因；位于左侧绿色且超过阈值的点表示在电离辐射组下调的基因。其中与细胞周期和增殖相关的plcg2、igf1、dpep1和hellpar等基因受照后显著上调(图 3C)。

图 3 正常组和电离辐照组人睾丸体细胞的表达模式变化  A. 曲细精管管腔外体细胞组成比例；B. 不同处理组的细胞类型组成占比；C.电离辐照组7 758个差异基因相对于正常组的差异表达火山图 Figure 3 Changes in somatic cell expression patterns after irradiation-induced damage   A. Circle plot showing the composition proportions of somatic cells outside the seminiferous tubule lumen; B. Percentage of cell type composition in different treatment groups; C. Volcano plot of 7 758 differentially expressed genes in the ionized irradiated group relative to the normal group

4.电离辐射暴露后睾丸间质细胞转录组变化：为进一步探讨电离辐射对睾丸间质细胞功能的影响，本研究采用了Monocle2包进行细胞轨迹分析。在整体轨迹上，正常组细胞主要聚集于状态2；辐射组细胞沿伪时间方向从状态2逐步偏移，分别指向状态1与状态3两个分支(图 4A)。这表明辐射暴露诱导了睾丸间质细胞群体的命运分化。以状态2为枢纽，辐射后出现两条主要命运分支：一条指向状态1，另一条指向状态3，箭头表示伪时间推进方向(图 4B)。这可能反映了细胞在该阶段的停滞或组成变化，即辐照使部分细胞难以顺利跨越分叉或改变了其进入不同分支的倾向。通过BEAM分析识别的分支特异性基因被归入4个不同的功能簇，其中状态1细胞群主要与能量代谢相关的路径如“三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)代谢”、“有氧呼吸”和“氧化磷酸化”有关，而状态3细胞群则与“轴突发育”、“细胞生长”和“组织修复”等过程相关。这表明，辐射损伤后间质细胞表现出密切的修复作用(图 4C)。

注：top GO BP.显著性最高本体中的“生物过程”的条目 图 4 电离辐射暴露后间质细胞的表达模式变化  A. 基于组别的轨迹嵌入图；B.间质细胞状态与细胞命运分支；C. 不同分支差异表达基因及其top GO BP路径 Figure 4 Transcriptional pattern changes in Leydig cells after ionizing radiation exposure   A. Trajectory embedding based on groups; B. Leydig cell states and cell fate branches; C. Differentially expressed genes across branches and their top GO Biological Process pathways

目前，国内外对电离辐射致睾丸生精障碍的分子机制研究尚不充分。电离辐射可通过直接损伤和间接损伤对睾丸中的生殖细胞和体细胞产生影响，且具有长期积累效应，进而影响男性生殖能力及后代的正常发育^[10-11]。目前针对睾丸细胞中异质性细胞和亚细胞群间的相互作用的研究尚无定论^[12]。因此，单细胞转录组测序方法为研究电离辐射对睾丸组织损伤的分子机制提供了新的视角和研究模式。

研究发现在暴露于电离辐射后，生殖细胞数量急剧减少，显示出在增殖和分化方面的障碍，同时PI3K-AKT和Notch等关键信号通路的表达水平也明显下降。DNA修复在减数分裂的重组和生殖细胞的DNA损伤修复中至关重要，辐射引起损伤后，精原细胞的损伤修复功能受到抑制，这可能是导致精子畸形率增加的原因之一^[13]。PI3K-AKT途径调控着精子的运动和过度活化，一旦受到抑制，可能会导致细胞凋亡，引起活跃精子的比例下降。同时，阻断Notch信号通路也会引起异常精子发生和精子缺陷^[14-18]。活性氧(ROS)在精子发育，获能和功能维持中发挥重要作用。感染或炎症等过程导致的ROS水平升高，可能与精子发育、功能失调以及受精能力的下降有关。而该受辐照影响患者中，检测到的ROS降低，可能与线粒体功能受损以及辐射损伤后生殖细胞中的ROS短暂增高，并引起DNA损伤相关^[19]。此外，精子的代谢方式从糖酵解向氧化磷酸化的代谢转变，这可能是精子分化的重要驱动因素^[17-20]。辐射损伤患者在生精后期显示出氧化磷酸化水平的降低，提示其生殖细胞分化能力受到损伤。这为电离辐射引起精子发生障碍的机制研究提供了新的数据支持。辐射损伤后，间质细胞分化为两类功能状态：一类细胞能量代谢通路富集，表现出高代谢活性；另一类与组织修复及细胞周期相关，具体表现为PLCG2和IGF1等增殖基因表达增高^[21-23]。这些基因的表达上调提示，电离辐射暴露后，间质细胞可能通过促进增殖能力，强化自身功能及发挥内分泌调节的作用以适应损伤环境。这些变化可能进一步破坏精子发生所需的微环境稳态并且影响睾酮的合成与分泌功能。

本研究通过单细胞水平揭示了睾丸组织中不同细胞类型对辐射的响应与变化。尤其是对生殖细胞重要功能相关信号通路的抑制、间质细胞的功能分化及代谢重编程等方面，为后续研究提供了新的理论依据和数据支持。本研究亦存在一定局限性：首先，样本数量相对较少，难以全面了解辐射对睾丸损伤的演变过程；其次，主要基于体内采样，部分分子通路及其功能还没有在体外或动物模型中得到验证；此外，没有系统性地探讨剂量与效应关系以及恢复时间对主要表现型的影响。后续研究应扩大样本规模，并从功能、调控网络及细胞通信等角度对所有睾丸组织的亚细胞群体进行系统探讨，进一步验证关键分子的作用。尽管存在这些不足，本研究仍为理解电离辐射对男性生殖系统的分子机制提供了宝贵的单细胞层面证据。研究结果不仅丰富了辐射引起的生殖损伤的数据库，也为未来在生精障碍的诊断和治疗中寻找潜在的分子靶点奠定基础。通过对相关分子通路动态变化的深入理解，有望优化高危人群的识别和早期损伤的评估模型。

综上，本研究揭示了电离辐射暴露通过干扰睾丸细胞的基因表达、细胞间的通信以及发育轨迹，破坏了精子的发生过程，最终导致男性生育能力的下降。这些结果为电离辐射引起的生殖功能障碍治疗提供了新的思路，未来可能通过调控体细胞功能，协助生精功能的恢复，从而改善男性不育症。

利益冲突  无

作者贡献声明  王华沛负责数据的收集、整理和论文撰写；段能亮、高志翔负责数据的整理和分析、起草论文；冉元帅、孙龙、龚世炜参与论文修改；崔凤梅、陈秋负责论文修改；薛波新、刘晓龙指导实验设计和论文修改