近年来，FLASH放疗(FLASH-RT)作为一种新兴放疗模式，以其“超高剂量率(≥40 Gy/s)、超短照射时间(ms级)、强组织保护效应”而受到国际学术界的广泛关注^[1-3]。动物实验和初步临床试验均表明，FLASH-RT能够在控制肿瘤的同时，显著降低正常组织的急性与慢性损伤风险，尤其在肺部、小肠、皮肤等组织中展现出明显优势^[4-6]。这一突破性进展为放疗技术发展带来了新的转机，亦为大幅提高患者生活质量、扩大放疗适应证提供了可能。

然而，FLASH效应的具体生物学机制尚未完全阐明，尤其是在细胞水平上，不同剂量率照射对细胞存活、氧化应激、DNA损伤修复及细胞周期调控的影响仍缺乏系统性研究。目前，关于FLASH效应的潜在机制主要存在几种假说，包括瞬时氧耗竭假说^[7-8]、自由基时空分布假说以及差异DNA损伤修复假说^[9-11]，这些假说仍需更多实验证据支持，本研究通过比较常规剂量率(CONV)与FLASH照射对BEAS-2B和A549细胞的影响，分析细胞差异生物效应，阐述相比CONV照射，FLASH诱导正常细胞产生较少辐射损伤的优势，为其临床转化提供理论支持。

1. 主要仪器与试剂：多功能酶标仪(美国ThermoFisher公司)，BD FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)、LSM700激光共聚焦显微镜(德国蔡司公司)，胎牛血清、DMEM培养基(美国GIBCO公司)，CCK-8试剂盒(日本东仁化学研究所)，含0.25%EDTA的胰酶(美国HyClone公司)，γ-H2AX抗体(美国CST公司)，青霉素-链霉素溶液、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒购置于上海碧云天生物技术有限公司。

2.细胞培养与照射：肺腺癌细胞株A549和人肺上皮样细胞株BEAS-2B分别使用DMEM培养基(含10%胎牛血清和1%青-链霉素)和DMEM培养基(含丙酮酸钠、10%胎牛血清和1%青-链霉素)培养在条件为37℃、5% CO₂的培养箱中。本研究的照射均在常规氧环境(氧浓度约为21%)中通过清华大学6 MeV电子线直线加速器实验平台进行，源靶距为60 cm，照射野为10 cm × 10 cm，超高剂量率分别为200、400 Gy/s，常规剂量率为0.3 Gy/s，将细胞分为对照(CON)组、常规剂量率(CONV，0.3 Gy/s)照射组和FLASH照射组(200、400 Gy/s)。用于存活、氧化损伤、DNA损伤检测的细胞样品照射剂量点为6和15 Gy，照后培养24和48 h。用于细胞周期检测照射剂量点为6 Gy，照后培养4、8、24、48和72 h。

3.细胞存活能力检测：取对数生长期的BEAS-2B和A549细胞，分别以4 000和3 000个/孔铺于96孔板中，照射后继续培养24和48 h，弃去旧培养基，每孔加入100 μl按9∶1比例配置新培养基与CCK-8溶液混合液，在37℃培养箱中继续孵育4 h。使用酶标仪，采用450 nm单波长检测吸光度(A)，绘制各时间点的存活曲线。

4.细胞氧化应激指标检测：分别将1×10⁶个处于对数生长期的BEAS-2B和A549细胞悬液置于25 cm²培养瓶中培养，在照后24和48 h分别收集细胞样本。加入150 μl裂解缓冲液，冰浴条件下裂解30 min。随后在4℃环境下以12 000 r/min的转速，离心半径8.3 cm离心15 min。收集上清液后，首先使用二喹啉甲酸(BCA)法测定样品蛋白浓度，然后使用硫代巴比妥酸反应法测定MDA，SOD活性检测采用WST-8显色法。

5.免疫荧光检测流程：取对数生长期的BEAS-2B和A549细胞，分别以8 000和6 000个/孔铺于24孔板中，照后4和24 h分别收样。经固定液处理15 min后，用洗涤液清洗3次。随后用封闭液在室温条件下封闭20 min。加入γ-H2AX一抗，4℃孵育过夜。洗涤后加入荧光标记二抗，避光条件下室温孵育1 h。DAPI染色5 min标记细胞核，充分洗涤后制片观察。使用荧光显微镜采集图像，通过Image J软件定量分析焦点数量。每个实验组至少检测100个细胞，实验重复3次。

6.细胞周期检测：取对数生长期的BEAS-2B和A549细胞，每孔2×10⁵个接种于6孔板中，细胞在照射后4、8、24、48和72 h收集到1.5 ml EP管中，2 000 r/min，离心半径8.3 cm，离心5 min。弃上清，加入预冷的磷酸盐缓冲溶液(PBS)离心，弃上清，加入300 μl PBS重悬细胞，再加入预冷的700 μl无水乙醇混匀，-4℃固定细胞过夜，使用PBS清洗1~2次，保留细胞沉淀，加入200 μl PI/RNase染色液，重悬细胞，将细胞移至管中，37℃避光孵育30 min。然后以标准程序用流式细胞仪检测细胞周期分布，计数10 000个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit 5.0 (美国Verity Software House公司)分析。

7.统计学处理：采用SPSS 26.0软件进行数据处理，数据符合正态分布且符合方差齐性，计量资料用x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，LSD法进行组间两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.不同剂量率照射对细胞存活的影响：由图 1可见，BEAS-2B和A549细胞受CONV和FLASH照射后，细胞存活率明显下降，BEAS-2B细胞200和400 Gy/s组相比CONV组，细胞存活率较高，且差异有统计学意义(t=5.17~7.58，P < 0.05)，同时FLASH照射组BEAS-2B细胞与A549细胞的存活率存在差异，且作为正常细胞的BEAS-2B存活率高于肿瘤细胞A549 (t=3.63~7.79，P < 0.05)。

注：a与同一细胞CON组相比，t=3.74~46.62，P < 0.05；b与同一细胞常规剂量率0.3 Gy/s照射组相比，t=1.63~7.62，P < 0.05；c与同一剂量率BEAS-2B细胞相比，t=3.27~11.72，P < 0.05 图 1 BEAS-2B和A549细胞不同剂量率照射后24和48 h细胞存活率  A.6 Gy照后24 h；B. 15 Gy照后24 h；C. 6 Gy照后48 h；D.15 Gy照后48 h Figure 1 Cell survival rates of BEAS-2B and A549 cells after irradiation to different dose rates   A-B. 24 h after 6 and 15 Gy, respectively; C-D. 48 h after 6 and 15 Gy, respectively

2.不同剂量率照射后BEAS-2B细胞和A549细胞间氧化损伤的差异：如图 2，CONV和FLASH照射后24 h，BEAS-2B和A549细胞SOD活力升高；48 h后，细胞SOD活力降低。BEAS-2B细胞受照后，与CON组相比，200和400 Gy/s SOD活力变化较小，差异无统计学意义(除照射15 Gy 24 h后外)，而CONV组SOD活力变化明显，差异有统计学意义(t=2.90~10.39，P < 0.05)。与CON组相比，照射组A549细胞SOD活力明显改变(t=8.96~10.76，P < 0.05)，且FLASH与CONV照射组相比SOD活力差异无统计学意义。

注：a与CON组相比，tBEAS-2B=1.24~10.39，P < 0.05；tA59=8.47~24.98，P < 0.05；b与0.3 Gy/s照射组相比，t=3.81~7.09，P < 0.05 图 2 BEAS-2B和A549细胞受不同剂量率照射后SOD活力  A-B. 6、15 Gy照后24 h; C-D. 6、15 Gy照射后48 h Figure 2 SOD activity of BEAS-2B and A549 cells after irradiation with different dose rates   A-B. 24 h after 6 and 15 Gy, respectively; C-D. 48 h after 6 and 15 Gy, respectively

由图 3可以看出与未照射组相比，BEAS-2B和A549细胞受CONV照射后MDA含量明显增加(t_BEAS-2B-MDA=8.69~11.94，P < 0.05;t_A549-MDA=10.44~14.08，P < 0.05)，与CONV照射组相比，A549受FLASH照射后MDA的含量无明显差异；而BEAS-2B细胞在受FLASH照射后，MDA含量明显低于CONV照射组(t=6.21~10.12，P < 0.05)，且在以200和400 Gy/s照射6 Gy后24 h，细胞MAD含量与未照射组相比差异无统计学意义。

注：a与CON组相比，tBEAS-2B=2.1~12.08，P < 0.05；tA549=10.04~17.21，P < 0.05；b与0.3 Gy/s照射组相比，t=5.78~10.25，P < 0.05；实际上，A.6 Gy照后24 h；B.15 Gy照后24 h；C.6 Gy照后48 h；D.15 Gy照后48 h 图 3 BEAS-2B和A549细胞受不同剂量率照射后MDA含量  A-B. 6、15 Gy 24 h；C-D. 6、15 Gy 48 h A.6 Gy at 24 h；B.15 Gy at 24 h；C.6 Gy at 48 h；D.15 Gy at 48 h Figure 3 MDA content in BEAS-2B and A549 cells after irradiation with different dose rates    A-B. 24 h after 6 and 15 Gy, respectively; C-D. 48 h after irradiation with 6 and 15 Gy, respectively

3.不同剂量率照射后正常细胞与肿瘤细胞间细胞周期的差异：如表 1，在BEAS-2B细胞中，FLASH组在照后8 h S期升高(t=3.49，P < 0.05)，24 h至72 h时间段呈现出显著的G₂/M期峰值增强(t=5.34~9.16，P < 0.05)，48 h处于G₂期细胞占比较大(66.9%)，72 h维持G₂阻滞(67.4%)，提示更稳定的周期调控。CONV组BEAS-2B细胞则表现为S期滞留至48 h(35.2%)，72 h异常升高(77.0%)，G₂期仅占0.1%，显示周期控制紊乱。而A549细胞，相比于CONV组，FLASH照射后出现早期(4 h)即维持更高G₁期比例(42.1%)，24 h G₂阻滞更显著(28.8%)，更快清除S期细胞，延缓周期崩溃，但由于其肿瘤细胞自身的细胞周期调控缺陷在72 h时仍然出现细胞周期失控(表 2)。

表 1(Table 1)

表 1 FLASH对照后不同时间BEAS-2B细胞周期变化的影响(%，x±s) Table 1 Influence of FLASH on changes in cell cycle of BEAS-2B at different time points (%, x±s) 时间(h) 照射方式 样本数 G0/G1 S G2/M 4 CONV 3 29.63±2.59 44.91±2.79 25.45±1.00 FLASH 3 29.30±1.02 44.40±0.98 26.30±0.14 8 CONV 3 8.29±2.38 54.36±1.25 35.69±0.70 FLASH 3 4.77±4.24 61.79±4.12a 34.11±0.60 24 CONV 3 17.53±1.46 7.64±1.31 74.83±2.67 FLASH 3 19.36±5.39 12.06±6.34 60.59±5.06a 48 CONV 3 19.72±13.58 35.21±6.60 45.06±9.57 FLASH 3 30.03±3.70 3.05±5.30a 66.91±5.70a 72 CONV 3 19.25±2.89 77.01±6.47 0.12±0.11 FLASH 3 24.42±5.47 8.16±7.30a 67.42±5.48a 注：a与同一时间CONV组相比，t=2.15~20.41，P < 0.05

表 1 FLASH对照后不同时间BEAS-2B细胞周期变化的影响(%，x±s) Table 1 Influence of FLASH on changes in cell cycle of BEAS-2B at different time points (%, x±s)

表 2(Table 2)

表 2 FLASH对照后不同时间A549细胞周期变化的影响(%，x±s) Table 2 Influence of FLASH on changes in cell cycle of A549 at different time points (%, x±s) 时间(h) 照射方式 样本数 G0/G1 S G2/M 4 CONV 3 32.68±2.25 62.26±1.71 5.06±2.92 FLASH 3 42.08±0.59a 57.37±5.01 0.55±0.08a 8 CONV 3 16.27±6.64 76.60±19.59 10.83±17.54 FLASH 3 32.66±5.10a 44.63±2.52a 24.26±12.13 24 CONV 3 39.60±1.01 46.30±12.46 14.10±11.48 FLASH 3 63.06±10.26a 10.88±2.68a 28.84±9.00a 48 CONV 3 58.16±1.38 40.29±0.55 0.23±0.12 FLASH 3 61.38±8.01 23.47±12.75a 10.47±5.24a 72 CONV 3 62.87±0.26 37.11±0.05 0.02±0.01 FLASH 3 58.55±3.09 38.21±3.10 0 注：a与同一时间点CONV组相比，t=0.62~5.04，P < 0.05

表 2 FLASH对照后不同时间A549细胞周期变化的影响(%，x±s) Table 2 Influence of FLASH on changes in cell cycle of A549 at different time points (%, x±s)

4.CONV与FLASH照射后BEAS-2B细胞DNA双链断裂与修复：由图 4可知，在CONV照射6、15 Gy后4 h，BEAS-2B细胞内可观察到大量γ-H2AX焦点(红色荧光)，分别达到约3 500与7 400个每100个细胞，显著高于未照射对照组(t=6.73、7.08，P < 0.05)。在24 h，CONV组焦点数量明显减少，但仍高于对照。而在FLASH照射条件下(200和400 Gy/s)，4 h γ-H2AX焦点数量同样升高，但显著低于相应CONV照射组(t=7.54、7.71，P < 0.05)；24 h时焦点数量进一步降低至约1 000~1 800个/100细胞，恢复程度更为显著(t=8.17、9.03，P < 0.05)。

注：a与照射后4 h组相比，t=3.74~11.12，P < 0.05;b与CON组相比，t=2.21~7.11，P < 0.05；c与常规剂量率0.3 Gy/s组相比，t=5.86~9.11，P < 0.05 图 4 不同剂量率照射6、15 Gy后BEAS-2B细胞γ-H2AX焦点形成  A.免疫荧光染色×630；B. 6 Gy后γ-H2AX焦点形成数；C. 15 Gy照后位点数 Figure 4 Formation of γ-H2AX foci in BEAS-2B cells after irradiation at different dose rates   A. γ-H2AX focal immunofluorescence staining ×630; B. Number of focal points at 6 Gy; C. Number of focal points at 15 Gy

本研究结果表明，FLASH电子束在照射6和15 Gy后24和48 h，能显著提高肺上皮正常细胞BEAS-2B的存活能力，且在多数条件下优于CONV照射。肿瘤细胞A549在相同照射条件下表现出较低的存活水平，提示FLASH可能对正常细胞产生更少的辐射损伤。在氧化应激指标方面，FLASH照射BEAS-2B细胞后SOD活力轻微或中度激活和MDA含量增幅较小，产生的氧化应激水平低，且不会出现后期衰竭，SOD活力和MDA含量更快恢复稳态。这些结果提示，FLASH照射或可通过抑制氧化应激相关通路，缓解正常细胞在放疗中的氧化损伤，从而提高其存活与修复能力^[12-13]，为FLASH效应的组织保护机制提供初步生物学证据。

细胞周期的动态变化是细胞对辐射损伤应激反应的重要体现，周期阻滞通常反映细胞进入DNA损伤检查点以开展修复。本研究中，正常肺上皮细胞BEAS-2B在CONV与FLASH照射后均表现出明显的细胞周期停滞现象，但FLASH照射诱导了更持久的G₂期阻滞，为正常细胞提供了更充分的DNA修复时间，从而避免过早进入凋亡程序。与之相比，FLASH照射在早期显著提高了A549的G₁期比例，但在后期出现了S期异常堆积，提示肿瘤细胞基因组不稳定性导致的周期崩溃。这种选择性周期响应可能是FLASH效应诱导正常组织保护的重要机制之一，未来可结合细胞周期调控相关蛋白(如p53、Cyclin B1等)的检测进一步深入解析。

为进一步探索FLASH照射对BEAS-2B细胞产生较少辐射损伤的效应，从DNA损伤与修复方面进行实验。γ-H2AX作为反映DNA双链断裂的经典分子标志物，其在照射后早期的表达变化可有效指示细胞对辐射损伤的应答与修复能力^[14]。本研究中，FLASH组在照射后4 h内诱导的γ-H2AX焦点数量小于CONV组，且24 h后其焦点数量下降更为显著，提示FLASH照射诱导的DNA双链断裂较少、且修复效率更高。这一结果与Manuela等^[15]和Fouillade等^[16]的研究一致，与CONV相比，FLASH照射观察到的DNA损伤较少。这种差异性的结果可能归因于参与DNA修复途径不同因子的激活。在这些过程中，聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)发挥多功能的作用。PARP 1下调转化生长因子β(TGF-β)，其调节辐射诱导的抗肿瘤反应，而PARP 2影响促凋亡DNA损伤的修复^{[14, 17]}。也可能源于FLASH下自由基瞬时爆发、组织内氧耗加快所造成的“瞬时缺氧”环境，从而降低氧依赖性的间接DNA损伤，同时调动更有效的修复机制以促进DNA双链断裂(DSB)修复^{[1, 18]}。该发现不仅进一步支持了FLASH效应在分子层面上的独特性，也为临床放疗中探索最小损伤剂量策略提供了潜在参考。

尽管在细胞模型水平上探索了FLASH照射对正常细胞产生较少辐射损伤的生物效应，但细胞模型无法模拟体内复杂的微环境，缺乏真实的肿瘤组织结构、血管系统、免疫细胞浸润以及细胞外基质，不能复现体内组织的氧分压梯度以及超高剂量率照射可能引发的瞬时氧耗等关键生理过程。后续将在实验动物层面开展研究，构建实验动物荷瘤模型，观察CONV和FLASH照射后肿瘤控制率以及正常组织的辐射反应，在活性氧的瞬时爆发、自由基化学、免疫应答以及信号通路的激活等方面深入探究，以期为临床应用提供指导方向。

利益冲突  无

作者贡献声明  闫娟、李爽负责实验和论文撰写；蔡恬静、陆雪协助实验；刘青杰指导论文修改