2025, Vol. 45
14C既是天然放射性核素，也是重要的人工放射性核素[1]，其半衰期为5 730年，属于纯β射线辐射体。环境和食品中14C的人工来源主要为早期核试验落下灰、核事故，极少量来源于核电运行的流出物等。14C主要以气态CO2形式存在于环境中[2]，流动性高，易通过食物链进入人体，14C在人体内99%的剂量贡献来自食入途径[3]。体内若蓄积一定量的14C，其β辐射作用不仅会引起生物体分子结构和分子键的破坏，使细胞核电离而受到损伤，引起躯体效应，也可使细胞的DNA单键断裂而导致基因突变引起遗传效应[4]。此外，由于14C半衰期长的特性，可对生物体造成长期内照射风险，其累积辐射剂量不容忽视。
海产品中14C的分析可分为样品采集、样品预处理、样品制备和测量几个步骤。现阶段各实验室预处理使用的设备多为管式燃烧炉，该设备可处理样品量大，多通道管式燃烧炉还可同时处理多个样品[5]。氧弹燃烧装置则可提供高压、富氧环境，燃烧效率可达95%以上，多用于14C的测量[6]。氧化燃烧-液闪测量法原理为通过催化氧化燃烧的方式来获取并收集CO2，再通过粉末悬浮法或吸收法制备含14C的沉淀或溶液，与闪烁液充分混合后测量。如何提高燃烧效率和收集过程中14C的回收率以及保证方法的准确性和精确度，一直是国内外学者研究的重点[7-9]。我国现行14C的测定标准有《生物样品中14C的分析方法氧弹燃烧法》(GB/T 37865-2019)[10] 和《生物中氚和碳-14的分析方法管式燃烧法》(HJ 1324-2023)[11]，以上标准使用了单一设备或单一制样方法进行检测，本研究使用管式燃烧炉和氧弹燃烧装置两种设备，分别要用吸收法和悬浮法两种制样方法分析海产品中14C活度浓度，并通过优化海产品的氧化燃烧条件、CO2收集条件和液闪测量条件，建立用管式燃烧炉/氧弹燃烧-液闪法测定海产品中14C活度浓度的方法。
材料与方法1.样品：将牡蛎、海虾、海鱼、海藻等海产品清洗后取可食用部分，干燥后粉碎备用。
2.主要仪器与试剂：管式燃烧炉(OTCS 11/3，上海怡星机电设备有限公司)，氧弹燃烧装置(1121，美国Parr仪器公司)，元素分析仪(UNICUBE，德国Elementar Analysensysteme GmbH公司)，热分析仪(TGA/DSC 3+，瑞士METTLER TOLEDO公司)，液体闪烁谱仪(Quantulus GCT 6220，美国PerkinElmer公司)；14C标准溶液(碳酸钠基质，比活度100 Bq/ml，英国国家物理实验室)；氢氧化钠、氯化铵、盐酸、氯化钙、二甲苯、3-甲氧基丙胺为分析纯、2, 5-二苯基恶唑(PPO)、1, 4-双-[5-苯基恶唑基-2]-苯(POPOP)、乙二醇聚氧乙烯异辛基酚醚(Triton X-100) 为闪烁纯均购自上海麦克林生化科技有限公司，实验室用水为MilliQ(德国Merck Millipore公司)制得的超纯水；闪烁液(LLT、Insta-Gel Plus，美国Perkin Elmer公司)，自配闪烁液(取PPO 1.4 g, POPOP 0.07 g，溶于200 ml二甲苯中，再加入100 ml Triton X-100，混合均匀)。
3.分析方法
(1) 管式燃烧炉升温程序的设定：对不同种类的海产品分别进行热重测试(TG-DTG)及脂肪含量分析(索氏抽提法)，研究不同类型样品的热解区间分布。然后燃烧已知碳元素含量的样品，在其热解温度区内分别以1、1.5、2℃/min的速度进行程序升温，燃烧效率为转化得到的CaCO3沉淀质量与理论值的比值。
(2) 氧弹燃烧装置二氧化碳吸收的优化：氧化燃烧后的尾气需连接装有NaOH溶液的吸收瓶吸收CO2，实验中氧化燃烧同等质量已知碳元素含量的样品，分别将含有同等摩尔质量NaOH溶液(足量)放置在氧弹尾气端、内部及尾气端和内部同时吸收(图 1)，比较不同吸收方式得到的CaCO3沉淀质量。
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图 1 氧弹燃烧装置示意图 Figure 1 Schematic diagram of the oxygen bomb combustion devices |
(3) 二氧化碳的固定：用NH4Cl溶液调节吸收CO2后的NaOH吸收液pH值至10.0~11.0，然后加入过量的饱和氯化钙溶液使其生成CaCO3沉淀，待沉淀完全后进行抽滤，并分别用蒸馏水和无水乙醇冲洗两次。取出沉淀放入烘箱在105℃下烘干至恒重，研磨备用。
(4) 样品制备：①悬浮法制备样品，称取2 g烘干并研磨过的CaCO3沉淀粉末，放入液闪计数瓶中，加入超纯水和闪烁液(水∶闪烁液=4 ml ∶14 ml)，混合均匀后待测。实验中，分别用LLT闪烁液，Insta-Gel Plus闪烁液和自配闪烁液进行样品制备，比较不同组合的本底、效率、稳定性、成本等参数。②吸收法制备样品，向液闪计数瓶中加入9 ml 3-甲氧基丙胺，称重后放入冰水浴中。取一定量碳酸钙沉淀至三颈烧瓶中，加入适量超纯水，安装分液漏斗(图 2)，向分液漏斗中注入2 mol/L盐酸溶液，通氮气净化气路后，与放置于冰水浴中的计数瓶连接。将分液漏斗中的酸液逐渐滴入到三颈烧瓶中，用氮气将生成的CO2气体赶入装有吸收剂的计数瓶中，直至沉淀完全消失。擦干液闪计数瓶外壁后称重，计算吸收的CO2的重量，最后向液闪计数瓶中加入9 ml闪烁液，振荡混合均匀。实验中，分别取1 ~10 g碳酸钙沉淀进行吸收法样品制备，称量各液闪瓶中吸收的CO2质量，并上机测量，比较吸收不同质量CO2样品的测量结果。
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图 2 吸收法制备样品示意图 Figure 2 Schematic diagram showing sample preparation using the absorption method |
(5) 样品测量：分别将悬浮法和吸收法制备的待测样品放入液闪谱仪中测量，测量时间300 min/次，连续测量15个循环，比较计数率的变化。
4.计算：悬浮法的生物样中碳-14活度浓度和方法探测限的计算见式(1)和(2)：
| $\begin{aligned} A & =\frac{\left(N_x-N_b\right) \times C \times 1000}{60 \times m_{C 1} \times E \times 0.12}\end{aligned} $ | (1) |
| $\begin{aligned} L_{D 1} & =\frac{4.65 \sqrt{N_b / t_b} \times C \times 1000}{60 \times m_{C 1} \times E \times 0.12} \end{aligned} $ | (2) |
吸收法的生物样中14C活度浓度和方法探测限的计算见式(3)和(4)：
| $ \begin{aligned} A & =\frac{\left(N_x-N_b\right) \times C \times 1000}{60 \times m_{C 2} \times E \times \omega} \end{aligned} $ | (3) |
| $ \begin{aligned} L_{D 2} & =\frac{4.65 \sqrt{N_b / t_b} \times C \times 1000}{60 \times m_{C 2} \times E \times \omega} \end{aligned} $ | (4) |
式中，A为生物样中14C活度浓度，Bq/(kg·干)；Nx为14C样品的计数率，min-1；Nb为14C本底样品的计数率，min-1；mC1为测量时称取的碳酸钙质量，g；mC2为测量时吸收二氧化碳的质量，g；E为仪器对14C的探测效率，%；C为样品干样中碳的含量，%；0.12为碳酸钙中碳元素质量分数；ω为二氧化碳中碳的质量分数，%；tb为本底测量时间；LD为方法探测限。
5.方法验证：验证样品为天然海蛎干粉，取6份平行样品分别使用管式燃烧炉和氧弹燃烧装置预处理，再分别采用吸收法和悬浮法进行制样，测量14C活度浓度。
结果1.氧化燃烧炉升温程序的设置：通过热重分析(thermogravimetry-derivative thermogravimetry，TG-DTG)联合曲线得出不同样品的热解区间，见图 3。结果表明，拥有相同脂肪含量的样品热解温度区间相似。海藻等脂肪含量少(2%左右)的样品，热解温度为180℃~250℃，虾类样品(脂肪含量4%左右)热解温度为200℃~300℃，黄花鱼等脂肪含量多(10%左右)的样品热解温度为200℃~400℃。
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注：DTG.样品质量随温度的变化速率 图 3 不同海产品的热重分析曲线 Figure 3 Thermogravimetry analysis curves (DTG) of various seafood samples |
不同升温速率下样品的燃烧现象见表 1。海藻和海虾样品在热解温度区内升温速率为1和1.5℃/min时，吸收液较为清澈，燃烧效率高；2℃/min时均发生爆燃，燃烧效率降低；黄花鱼样品在热解温度区内升温速率为1℃/min时，吸收液呈黄色，混有少量油状物；在1.5℃/min的升温速率下，吸收液较为清澈；2℃/min时，燃烧过程发生爆燃，吸收液带有少量黑色颗粒。为使样品充分燃烧，在热解温度区内以1.5℃/min的速率升温最佳。
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表 1 不同升温速率下各种海产品的燃烧现象 Table 1 Combustion phenomena of various seafood samples at different heating rates |
2. 二氧化碳吸收的优化：在氧弹燃烧装置完成点火燃烧后，只在尾气端连接200 ml 2 mol/L的NaOH吸收液，经转化后，得到8.713 1 g沉淀；只在氧弹装置内部放置100 ml 4 mol/L的NaOH吸收液，沉淀质量为8.887 8 g；在装置的内部和尾气端分别放置100 ml 3 mol/L和200 ml 0.5 mol/L的NaOH吸收液，将两份吸收液混合后进行沉淀转化，得到沉淀质量最多，为9.875 8 g。
3.悬浮法样品制备的优化：不同闪烁液制备的样品比较性能见表 2，LLT闪烁液配制的样品摇匀后会在短时间内分层，不能满足样品至少测试300 min的要求；Insta-Gel Plus闪烁液配制的样品稳定性达1~2周，效率较高，闪烁液保质期长；实验室自配闪烁液配制的样品稳定性可达1个月，本底低，效率高，但自配闪烁液保质期短，久置后无法使样品长时间保持悬浮状态。
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表 2 不同闪烁液制备样品的性能 Table 2 Performance comparison of sample preparation using different scintillation cocktails |
4.吸收法测量的优化：吸收法制样时二氧化碳的吸收曲线见图 4，当三颈烧瓶中的碳酸钙质量为1~6 g时，液闪瓶中吸收的二氧化碳质量随碳酸钙质量的增加而增加，碳酸钙质量>6 g后，吸收的二氧化碳质量便不再增加，约为1.6 g，同时吸收二氧化碳越多的样品，外标准转换谱指数(transformed spectral index of the external standard, tSIE)值越大。
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注：tSIE.外标准转换谱指数。值越低，样品的淬灭越严重 图 4 吸收法制样时二氧化碳吸收曲线 Figure 4 CO2 absorption curve after absorption-based sample preparation |
5.液闪测量时间优化：测量时间对计数的影响见图 5，对于悬浮法样品，样品制样后的0~20 h内计数较高，20 h后计数趋于稳定；对于吸收法样品，样品制样后的0~10 h内计数较高，10 h后计数趋于稳定。
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图 5 液闪测量时间对计数的影响 Figure 5 Effect of measurement time on liquid scintillation counting |
6.方法验证：取6份平行样，使用管式燃烧炉氧化燃烧，悬浮法制样得到的结果为79.07~101.10 Bq/(kg ·干)，相对标准偏差(RSD)为9.00%；吸收法结果为95.71~104.87 Bq/(kg · 干)，RSD为3.61%。使用氧化燃烧装置氧化燃烧，悬浮法制样得到的结果为89.12~109.09 Bq/(kg · 干)，RSD为8.27%；吸收法结果为95.29~102.12 Bq/(kg · 干)，RSD为3.29%。
讨论在使用管式燃烧炉对海产品干样氧化时，不同样品由于其组织成分的差别，需要的升温程序也不尽相同。升温速率过快可能导致样品爆燃，使其无法完全氧化，而升温速率过慢则造成不必要的时间损耗，也可能导致样品燃烧不充分，所以优化原则是在保证样品不发生爆燃的前提下找到燃烧效率最高的升温速率。可根据海产品干粉的脂肪含量将样品粗分为3类，并在相应的热解温度区间内设置升温速率为1.5℃/min，燃烧效率均能达到95%。
为提高实验回收率，增加CO2的吸收量至关重要。在氧弹装置中，由于CO2的密度较大，在释放尾气后仍会有一定量残存在氧弹内部，同时在氧弹装置的内部和尾气端放置NaOH吸收液，与仅在尾气端放置一个吸收瓶相比可提高10%的吸收量。
悬浮法制备样品时需使碳酸钙粉末均匀悬浮在液闪测量瓶中，液闪测量常用的LLT闪烁液不能使碳酸钙稳定悬浮，而Insta-Gel Plus闪烁液可与水混合形成凝胶状，使碳酸钙粉末均匀悬浮在闪烁液中[12]，但Insta-Gel Plus价格昂贵，本研究数据表明，自配闪烁液的性价比较高于可替代商品化产品，但其保质期较短，建议现用现配。
影响吸收法制备的样品液闪测量的一大因素是淬灭效应，淬灭会导致计数和探测效率的降低。tSIE为外标准转换谱指数，该值与样品活度和计数无关，仅表示样品的淬灭程度，值越低，淬灭越严重。吸收1.6 g以上CO2的样品淬灭程度较低，这是由于未反应的吸收剂是一种强淬灭剂，样品的淬灭程度取决于CO2吸收量，吸收液将CO2吸收至饱和则可有效减少淬灭[13]。本研究的实验表明，液闪瓶中的吸收剂为9 ml时，取6 g碳酸钙沉淀可确保产生足够的CO2使吸收剂饱和，从而减小淬灭效应。
此外，样品搁置时间的长短对测量结果也有一定的影响，样品处理后立即进行测量得到的结果往往偏大，因为样品和闪烁液混合后需要一个化学平衡、淬灭稳定以及消除光致影响的时间，悬浮法样品成分复杂，相比吸收法需要更长的暗适应时间，且受悬浮法样品稳定性的时间限制，当样品分层时，计数会显著下降。因此在实验中为了消除影响，需要根据制样方法设置适宜的暗适应时间。
本研究基于对大量海产品中14C的检测，通过优化实验条件，建立了使用管式燃烧炉或氧弹燃烧装置两种样品预处理手段，联合液体闪烁计数测定海产品中14C活度浓度的方法，研究结果表明，该方法精密度高且探测限相对较低，适用于海产品中14C的测定。
利益冲突 无
作者贡献声明 钱宇欣负责实验部分、数据汇总分析及文章撰写；谢雨晗、石岑负责样品制备和数据分析；尹亮亮、吉艳琴负责方案设计、组织并指导实验研究、数据分析及论文修改
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