随着核技术的快速发展，核恐怖和核辐射事故发生的可能性也在增加，核辐射事故医学应急工作日益得到重视。在发生核与辐射事故时快速、高通量地估算出受照者的生物剂量，对受照者的早期分类、诊断和治疗具有重要意义^[1]。人外周血淋巴细胞染色体畸变，特别是双着丝粒体(dicentric chromosome，dic)是国际上公认的辐射生物剂量估算的“金标准”^[2]，但是该方法人工分析费时费力，需要工作人员具有丰富的经验以及较高的水平才能准确估算受照者的生物剂量。国际原子能机构(International Atomic Energy Agency, IAEA)2011年出版的技术报告^[3]和国际标准化组织(International Organization for Standardization, ISO)发布的技术标准^[4]已推荐利用dic半自动化分析估算剂量。本研究基于实验室的辐射遗传管理系统，自动识别分析实现双着丝粒体+双着丝环(dic+r)畸变的全自动识别与剂量-效应曲线构建，实现生物剂量估算全流程自动化，满足核辐射事故中快速、高通量生物剂量估算需求。

1.主要试剂与仪器：高通量染色体自动扫描分析系统、自动收获仪和自动滴片仪均购自上海雨琪生物科技有限公司；细胞培养箱购自美国Thermo Fisher公司；RPMI 1640培养基及秋水仙素(天津瑞爱金生物科技有限公司)，冰乙酸(Acetic acid, AR)，0.075 mol/L氯化钾，姬姆萨染液(美国Sigma公司)。

2.样本制备：取3名成年健康志愿者，无烟酒嗜好，半年内无急慢性疾病史、无射线和化学毒物接触史，近1个月内无病毒感染史。用肝素钠抗凝管采集静脉血，每人9管，每管3 ml血样。采样后置于37℃恒温箱里保存，于中国医学科学院放射医学研究所的¹³⁷Cs γ放射源照射离体外周血。设置9个剂量点0、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4和5 Gy，剂量率为0.80 Gy/min。照射后置37℃培养箱中修复2 h。照射后血样培养采用预加秋水仙素法。秋水仙素终浓度为0.04 μg/ml。每个剂量点平行接种3瓶，每瓶细胞培养液(5 ml)0.5 ml肝素钠抗凝血，37℃培养箱培养50 h。使用自动收获仪收获，自动滴片仪制片，姬姆萨染液染色。

3.染色体畸变分析模型构建：自动识别分析系统采用改进型Faster R-CNN框架，整合区域建议网络(region proposal network, RPN)与检测网络，实现端到端训练与高效区域提案。模型中，对输入的染色体图像经Diffusion Net卷积层处理，生成高维特征图，捕捉染色体结构与畸变细节；在特征图每个位置预设多尺寸/比例锚点(如9种基础框)，适应不同畸变形态；对每个锚点同步预测“目标存在概率”及“边界框偏移量”，筛选高置信度候选区域(RoIs)；将候选区域特征统一缩放至固定尺寸，输入全连接层；输出畸变类别(如着丝粒环、双着丝粒体)及边界框精细化坐标；剔除重叠率高且置信度低的冗余锚框，保留最优检测结果；若染色体锚框与畸变锚框存在显著重叠(IoU阈值>0.5)，判定该染色体发生结构畸变。进行全自动分析之前，利用本实验室保存的染色体核型图对该软件进行训练，采用深度学习方法对染色体核型图片进行学习训练，对产生畸变的染色体进行特征标注建立初级模型；通过实施数据扩增技术，对真阳性与假阳性细胞图像进行二次验证；通过采用图像变换和增强处理来扩展数据集，增强模型的泛化能力，以期解决数据集中的类别不平衡问题；通过ConvNeXt网络进行二次分类训练，特别是在负样本数量远超正样本的情况下，引入FocalLoss损失函数以解决数据不均衡导致的模型权重失衡问题，从而提高模型的分类精度。

4.染色体畸变分析：所有样本用自动扫描系统扫描，自动识别分析系统依照GB/T 28236-2011染色体畸变估算生物剂量方法^[5]，自动选择染色体数目为46±1、分散良好、长度适中的分裂中期细胞，进行染色体畸变分析。统计每细胞非稳定性染色体畸变(dic、r)及每细胞“dic+r”数。记录用于生物剂量估算的dic+r数目以及中期分裂相个数，多着丝粒体计为(n-1)个dic。验证实验的生物估算剂量按照射剂量≥1 Gy时，相对偏差≤20%内视为合格^[6]。

5.结果计算：每个剂量点分析一定数量细胞后得出含有“dic+r”的细胞畸变率p，根据公式n=[(1-p)×96.04]/p，计算出每个剂量点应分析细胞数(n)。将各剂量点的分析细胞数和dic+r数输入至由国际原子能机构(International Atomic Energy Agency, IAEA)推荐的CABAS软件中，拟合最佳二次线性方程y=a+bD+cD²，y为每细胞dic+r数；D为照射剂量，Gy；a为本底畸变率；b和c为回归系数。曲线的拟合优度用R²表示。dic+r畸变率(%)以p±S_p描述。p为畸变率、S_p为标准误。估算剂量的相对偏差=(估算剂量-照射剂量)/照射剂量×100%。

1.剂量-效应曲线的拟合：根据自动分析结果，统计“dic+r”数，计算每个剂量点应分析细胞数。通过自动阅片，统计实际分析细胞数和“dic+r”数(表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 人外周血不同剂量照射后染色体畸变分析结果 Table 1 Analytical results of chromosomal aberrations in human peripheral blood lymphocytes after irradiation at different doses 照射剂量(Gy) 分析细胞数 dic r dic+r 数量 畸变率(%) 数量 畸变率(%) 数量 畸变率(p±Sp，%) 0.00 14 284 1 330 9.31 6 0.042 1 336 9.35±0.26 0.50 10 357 1 179 11.38 14 0.14 1 193 11.52±0.33 0.75 3 182 406 12.76 8 0.25 414 13.01±0.64 1.00 2 629 386 14.68 13 0.50 399 15.18±0.76 1.50 2 134 407 19.07 12 0.56 419 19.63±0.96 2.00 2 109 514 24.37 14 0.67 528 25.04±1.09 3.00 1 105 453 41.00 9 0.81 462 41.81±1.94 4.00 808 481 59.53 12 1.49 493 61.01±2.75 5.00 330 277 83.94 18 5.45 295 89.39±5.20 注：dic.双着丝粒体；r.着丝粒环；p±Sp.dic+r/细胞的95%可信限

表 1 人外周血不同剂量照射后染色体畸变分析结果 Table 1 Analytical results of chromosomal aberrations in human peripheral blood lymphocytes after irradiation at different doses

分析细胞总数36 938个。根椐自动分析后各剂量组染色体畸变细胞分析数及dic+r数，应用CABAS软件拟合曲线为y =0.093 65+0.030 21D+ 0.025 31D² (R²=0.999 2，P＜0.05)。估算剂量范围为0.50~5.00 Gy，吸收剂量率0.80 Gy/min。结果显示，每细胞的dic+r数均具有随着照射剂量增加而升高的趋势。

2.剂量-效应曲线验证：应用2024年中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所举办的全国生物剂量A、B、C和D 4个比对样本，其中，2个比对样本的照射剂量分别为0.7和1.5 Gy(⁶⁰Co γ射线，剂量率1.0 Gy/min)、双盲情况下实验室制备2个剂量点¹³⁷Cs γ射线照射，剂量率为0.80 Gy/min。照射剂量为1和3 Gy的染色体畸变分析标本对本实验室拟合的曲线进行验证。结果显示，4组验证样本的估算剂量值与实际照射剂量值的偏差均≤ 20%，该“dic+r”染色体自动识别分析的剂量-效应曲线可以准确地进行生物剂量估算(表 2)。

表 2(Table 2)

表 2 4个对比样本验证染色体畸变自动分析建立的剂量-效应曲线 Table 2 Validating the dose-response curve established through automated analysis for chromosomal aberrations using four comparative samples 验证样本 分析细胞数 dic数量 估算剂量(Gy) 95% CI 实际剂量(Gy) 相对偏差(%) A 911 125 0.84 0.47~1.14 0.7 20.0 B 1 247 226 1.36 1.10~1.58 1.5 15.0 C 814 98 0.86 0.73~0.98 1.0 14.0 D 570 243 3.08 2.78~3.35 3.0 2.7

表 2 4个对比样本验证染色体畸变自动分析建立的剂量-效应曲线 Table 2 Validating the dose-response curve established through automated analysis for chromosomal aberrations using four comparative samples

在核或放射事故发生后，尽早估算出事故人员所受的生物剂量，是及时对其进行医学救治和判断预后的重要依据。随着科学技术的发展，Vaurijoux等^[7]首先应用图像自动分析系统检测dic，并且准确地估算了46例达喀尔辐射事故的生物剂量；欧盟多家实验室也基于dic自动分析，建立了可用于生物剂量估算的剂量-效应曲线^[8]。Lee等^[9]研究的双着丝粒体半自动评分系统，能够快速准确地估算受照射人员生物剂量。Gruel等^[10]报道dic染色体自动分析法可用于大规模核辐射事件发生时的快速、高通量剂量评估；Ishii等^[11]也成功地将dic自动分析应用于生物剂量估算；Bucher等^[12]通过RENEB室间比对发现80%的实验室的半自动化分析系统能够较为准确地估算出生物剂量，部分实验室估算的结果同实际相比偏低；这些自动化检测手段可以显著提高生物剂量估算的通量和效率，在应对发生的大规模核与辐射事故具有重要的意义，这些研究中用到的半自动双着丝粒体(dic)与着丝粒环(r)分析法依然存在人工复核效率低、依赖经验的局限性，在一定程度上限制了生物剂量估算的速度。国内基于细胞遗传指标自动分析估算生物剂量起步较晚，但是也基于dic半自动分析建立了各自实验室的剂量-效应曲线^[13-15]。这些研究结果表明，半自动dic分析系统可作为大规模辐射事故中的高通量筛选工具，目前在生物剂量估算领域，每个进行生物剂量测定的实验室都应建立不同辐射类型和不同剂量范围的剂量-效应曲线^[16]；即使有半自动化分析，仍然是一项浩大的工程，但是随着自动识别分析的快速发展，在检验医学中的应用不断深化，通过深度学习算法对大量图像数据进行学习，能够自动识别和分析淋巴细胞中的染色体畸变类型，这些让自动识别分析估算生物剂量成为了可能^[17]。Gao等^[18]对同一份X射线照射样本建立了全自动分析、半自动分析和人工分析的剂量效应曲线，但是在低剂量(0.7 Gy)时，全自动分析建立的曲线估算的剂量误差达到58.57%，需要进一步训练以提高全自动分析的精确度。因此，本实验室基于细胞自动收获系统、自动滴片仪以及全自动dic分析系统，搭建了从细胞收获、制片、图像采集和染色体人工智能全自动分析的高通量生物剂量估算平台，并建立了本实验室的dic+r全自动分析的剂量-效应曲线，更好地为我国核与辐射事业的发展保驾护航。

自动扫描分析系统有统一的判定标准，减少了人为判断误差；具有不断进化的能力，结合人工不断地训练可以让自动分析系统的识别准确度不断地提升，从而达到接近人工复核的目标①自动扫描系统，可无遗漏扫描全片所有分裂中期细胞，这比普通显微镜下观察所捕获细胞数多，且分析也更全面。②自动成像处理系统成像时图像会自动调节明暗，这让软件分析更容易，减少系统误差。以上优势都让“dic+r”分析速度大幅度提高。但自动分析系统最大问题在于识别“dic+r”时会出现假阳性和假阴性^[19]，本实验室通过训练人工智能软件，使软件识别“dic+r”的能力不断提升，准确率达到95%以上，结合自动分析软件统一的判定标准，可以抵消假阳性对结果造成的误差，从而实现完全以自动分析系统分析的剂量-效应曲线，达到染色体“dic+r”辐射生物剂量估算高速化的目的。

采用本研究拟合的自动分析的剂量-效应曲线估算的4份染色体样本的剂量值相对误差均在20.00%以下，实际剂量均在估算剂量的95%置信区间内。一般认为，对于生物剂量测定，误差为±20.00%以内的剂量估算被认为良好，可为临床医生提供患者管理的信息，满足剂量估算的要求。

本研究中全自动分析dic的自发畸变率为9.35%，远高于近年来对中国人群DC本底水平的研究(0.12%)，原因是为了避免漏掉一些“dic+r”，自动分析系统的“dic+r”识别灵敏度提高了很多。此外，本研究发现，在低剂量照射样本分析中，dic假阳性率要高于高剂量的样本，并且DCScore软件自动化检测到的dic假阳性率有随照射剂量的增加而降低的趋势，这与Gao等^[18]和韩林等^[20]的研究一致，但是在本研究中，由于高低剂量的样本都是采用同一个判定标准，因此，曲线验证时，不同剂量的偏差基本没有太大的变化，这也说明本研究的曲线适用于0.5~5.0 Gy剂量范围内，基于“dic+r”自动识别分析估算的剂量用于临床分类诊断是可行的^[21]，并且优于一些半自动分析建立的剂量-效应曲线。

利益冲突  无

作者贡献声明  张天喜负责实验设计、实验操作、数据整理、撰写论文；叶海朋、乐燕娜指导实验设计和论文修改；俞慧娟、刘艳、毕亚萍负责协助部分实验和论文修改