结直肠癌是全球第三大常见癌症，死亡率位居第二^[1]。放射治疗在提高局部晚期直肠癌治疗效果方面发挥重要作用，但许多患者表现出放疗抵抗，并常出现腹泻、肠炎等胃肠道不良反应，影响治疗效果^[2]。因此，提高直肠癌放射敏感性，减少放疗剂量，降低不良反应，改善患者预后是当前研究的关键。

肠道微生物代谢产物如短链脂肪酸、胆汁酸等，是肠道微生物与宿主“沟通”的重要媒介，广泛参与宿主的生理功能和疾病发生^[3-4]，其中，短链脂肪酸由肠道微生物发酵膳食纤维和黏蛋白产生，对肠道健康、免疫调节和抗肿瘤等有重要作用^[5]。

嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila, A. muciniphila)是一种潜在益生菌，能够缓解炎症性肠病及辐射诱导的肠损伤，但低纤维饮食会削弱其保护作用^[6-7]。前期研究已经证实，肠道微生物代谢产物能够缓解电离辐射导致的消化道损伤，并提高结直肠癌放射敏感性^[8-10]。本实验旨在探究其代谢产物丙酸对结直肠癌放射敏感性的影响并探究其机制，为临床上结直肠癌患者的放疗增效提供安全有效的新策略。

1. 照射方案：使用加拿大原子能有限公司Gammacell^® 40 Exactor辐射源，¹³⁷Cs γ射线照射，剂量率为0.8 Gy/min。对于偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(azoxymethane/dextran sulfate sodium，AOM/DSS)诱导的结直肠癌模型小鼠使用特制的屏蔽装置，对小鼠进行15 Gy腹部局部照射(照射野直径30 mm)。细胞进行6 Gy的照射。

2. 细胞培养与分组：人源结直肠癌细胞系HCT-8与人结直肠上皮细胞NCM460均来自美国菌株保藏中心(American type culture collection, ATCC)。在37℃和5% CO₂条件下，使用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI 1640培养基培养HCT-8细胞和NCM460细胞。将HCT-8细胞分为4组：空白对照组(未处理)、单纯丙酸组(加入1 mmol/L丙酸但不接受照射)、单纯照射组(6 Gy照射)、照射+丙酸组(1 mmol/L丙酸处理1 h后接受6 Gy照射)。NCM460细胞分为空白对照组(未处理)、丙酸组(分别加入200、500 μmol/L，1、2 mmol/L丙酸，不照射)。每组细胞均设置6个平行复孔。

3. 实验动物与分组：64只6~8周龄的雄性C57BL/6J小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司[合格证号：SCXK(京)2014-0008]。小鼠饲养在中国医学科学院放射医学研究所的无特定病原体级动物设施中。环境温度保持在(22 ± 2)℃，相对湿度保持在40%~70%，并提供12 h/12 h的光/暗周期，持续供应标准饲料及水。动物实验经中国医学科学院放射医学研究所实验动物伦理委员会审批(伦理批准号：IRM-DWLL-2022022)。AOM/DSS结直肠癌模型：C57BL/6J小鼠腹腔注射10 mg/kg AOM，2 d后饮用含2%DSS的饮用水1周，随后正常饮水2周，重复3次。结直肠癌模型小鼠被分为5组，除造模对照组外均接受15 Gy腹部局部照射，并给予丙酸、丁酸、丙酸与丁酸联合灌胃，造模对照组给予生理盐水灌胃，每组8只。

4. 细菌培养与条件培养基的收集：嗜黏蛋白阿克曼氏菌(A.muciniphila, 菌种编号：ATCC BAA-835) 在厌氧条件下使用硫乙醇酸盐流体培养基(FT) 进行液体培养，培养温度37℃。培养12 h后，将培养基12 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心15 min，吸出上清液，使用0.22 μmol/L滤膜过滤后备用。

5. 丙酸/丁酸处理：丙酸与丁酸均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。对于细胞实验，丙酸工作浓度为1 mmol/L^[11]；对于AOM/DSS小鼠模型，丙酸组和丁酸组小鼠分别接受200 μl 7.5 mg·ml^-1·d^-1浓度^{[10, 12]}的丙酸和丁酸灌胃处理，丙酸+丁酸联合照射组小鼠接受200 μl 7.5 mg·ml^-1·d^-1浓度的丙酸与7.5 mg·ml^-1·d^-1浓度的丁酸(丙酸与丁酸1∶1混合)混合物灌胃处理，照射前连续灌胃5 d，照射后连续灌胃10 d。

6. 克隆形成检测：将HCT-8以800/孔的密度接种到6孔板中，过夜培养后加入1 mmol/L丙酸溶液或以1∶150的比例在细胞培养基中加入A. muciniphila的条件培养基，处理1 h后进行6 Gy照射。照射后继续培养2周。结束培养后使用99%甲醇固定细胞，并使用姬姆萨染色2 h，观察克隆数并统计。

7. 细胞增殖-毒性检测(CCK-8)：将HCT-8细胞或NCM460细胞以2 000/孔的密度接种到96孔板中，过夜培养。按上述分组分别加入对应浓度丙酸溶液预处理1 h。照射后0、24、48 h加入5 μl/孔细胞增殖-毒性检测试剂，继续培养1.5 h后在450 nm处检测吸光度(A)值以评估细胞增殖情况，吸光度值与细胞增殖能力呈正相关。

8. 免疫组织化学检测(IHC)：将小鼠结直肠癌组织置于4%多聚甲醛中固定24 h，脱水并包埋于石蜡中。组织切片厚度为5 μmol/L。经过常规脱蜡步骤后，置于去离子水中静置5 min，在95℃条件下使用3%柠檬酸修复液进行抗原修复。使用5%山羊血清白蛋白于37℃封闭1 h。一抗于4℃孵育过夜，二抗于37℃孵育1 h，再使用二氨基联苯胺显色试剂显色，苏木素复染。经过常规步骤脱水后，中性树胶封片，使用光学显微镜观察并通过Image J软件进行图像分析统计。

9. 酶联免疫吸附检测：取小鼠结直肠癌组织，打碎后溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中使终浓度为0.1 g/300 μl。白介素6(IL-6)与肿瘤坏死因子α(TNF-α)检测试剂盒购自上海通蔚生物科技有限公司。按照试剂盒说明操作，并在450 nm处检测吸光度A值以评估肿瘤组织内炎症因子水平。

10. 组织形态学染色：小鼠安乐死后，取出小鼠结直肠癌组织，置于4%多聚甲醛中固定24 h，脱水并包埋于石蜡中备用。组织切片厚度为5 μmol/L。经过常规脱蜡步骤后，HE染色。经过快速脱水后，使用中性树胶封片，于显微镜下观察。

11. 流式细胞术：选取对数生长期的HCT-8细胞，以10⁵/孔接种于6孔板中，按照上述分组方式分组处理，每组设6个平行复孔。过夜培养后加入丙酸理1 h，接受6 Gy照射，照射后继续培养24 h。培养结束后，收集细胞培养基与细胞。对于细胞周期检测，按照说明书将细胞4℃固定30 min后使用碘化丙锭(PI) 进行染色。对于细胞凋亡检测，按照说明书使用Annexin V-FITC/PI进行染色。使用流式细胞仪检测，FlowJo软件分析结果。

12. 琼脂糖凝胶电泳：将细胞以10⁵/孔接种在6孔板中，在接受6 Gy照射前1 h进行丙酸处理，照射后再培养24 h，采用TRIzol裂解法提取总RNA，反转录获得cDNA，检测p53的mRNA表达水平，以及管家基因GAPDH的表达作为内参。扩增条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，循环30次。引物序列如表 1所示。

表 1(Table 1)

表 1 PCR引物序列 Table 1 PCR primer sequences 基因 正向引物(5′→3′) 反向引物(5′→3′) p53 TTCCTGAAAACAACGTTCTGTC AACCATTGTTCAATATCGTCCG GAPDH TGTTTCCTCGTCCCGTAGA CAATCTCCACTTTGCCACTG

表 1 PCR引物序列 Table 1 PCR primer sequences

13. 结直肠肿瘤面积统计：使用ImageJ软件计算结直肠肿瘤面积。在计算面积时，先根据实际长度设定比例尺，再将每个肿瘤描出轮廓并计算面积占比，将每只小鼠的肿瘤面积加和算出总面积。

14. 统计学处理：每组实验均重复3次。所有实验数据均使用GraphPad Prism 8软件进行分析。数据经正态性检验符合正态分布，用x±s表示。方差齐两组间差异分析采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

1. A. muciniphila代谢产物及丙酸对结直肠癌细胞放射敏感性的影响：克隆形成实验显示，A. muciniphila条件培养基处理对HCT-8细胞增殖无显著影响，空白对照组、条件培养基组、单纯照射组、照射+条件培养基组克隆数分别为296±14.42、301.33±27.23、8.33±2.08、4±1，在照射和照射联合丙酸条件下，细胞活力显著下降(t = 34.19、34.98，P＜0.05)。CCK-8实验表明，＜2 mmol/L浓度的丙酸对NCM460细胞无毒性(P>0.05，图 1A)。在照射条件下，1 mmol/L丙酸处理进一步抑制HCT-8细胞的增殖，见图 1B。克隆形成实验显示，空白对照组、丙酸组、单纯照射组、照射+丙酸组克隆数分别为277.33±12.22、254.67±16.65、9.67±2.52和6±1，与空白对照组相比，单纯照射与照射联合丙酸处理使HCT-8细胞增殖能力显著降低(t = 37.16、38.33，P＜0.05)。

注：a与空白对照组比较，t = 5.24、3.14、11.08、9.42、11.62、11.03、15.65, P＜0.05；b与200 μmol/L丙酸组比较，t = 3.65，P＜0.05；c与1 mmol/L丙酸组比较，t = 4.70，P＜0.05；d与单纯照射组比较，t = 3.30，P＜0.05 图 1 A. muciniphila的条件培养基及丙酸对于正常结肠上皮细胞NCM460(A)及结直肠癌细胞HCT-8(B)增殖及辐射敏感性的影响 Figure 1 Effects of conditioned medium of A. muciniphila and propionic acid on the proliferation and radiosensitivity of normal colonic epithelial cells NCM460 (A) and HCT-8 cells (B)

2. 丙酸提高结直肠癌小鼠模型的放射敏感性：造模对照组、单纯照射组、照射+丙酸组小鼠体质量差异无统计学意义(P > 0.05)，3组结直肠长度分别为(8.02±0.74)、(7.44±0.52)、(7.91±0.64)cm，丙酸能够恢复照射导致的缩短(t=2.72、3.50，P ＜0.05)。肿瘤量化统计结果显示，与造模对照组相比，单纯照射组小鼠结直肠肿瘤数量减少、面积缩小，造模对照组、单纯照射组、照射+ 丙酸组小鼠肿瘤面积分别为(0.52±0.09)、(0.21±0.02)、(0.14±0.01) mm²，照射+丙酸组小鼠肿瘤面积缩小更为显著，如图 2(t=5.97、7.30，P＜0.05)，＜3 mm的肿瘤数量减少更明显(t =3.48，P＜0.05)。

注：a与单纯照射组比较，t =3.48，P＜0.05 图 2 不同处理组对AOM/DSS造模小鼠肿瘤数量的影响 Figure 2 Effects of combined irradiation with propionic acid on tumor number in AOM/DSS CRC mice model

3. 组织学检测结直肠结构与肿瘤增殖能力：结果见图 3，表 2。照射联合丙酸对肿瘤组织的杀伤效果显著优于造模对照组(t = 14.50、3.40，P＜0.05)。ELISA结果显示，丙酸治疗显著降低了照射后结直肠组织中IL-6和TNF-α的表达(t = 2.67、5.04、4.86、5.06，P＜0.05)。

图 3 不同处理组小鼠结直肠肿瘤组织观察×20 Figure 3 Observation of mice colorectal cancer tumor tissues in different treatment groups ×20

表 2(Table 2)

表 2 不同处理组小鼠结直肠癌组织中炎症因子水平(x±s) Table 2 The levels of inflammatory factors in colorectal cancer tissues of mice in different treatment groups(x±s) 组别 只数 K-i67 (%) IL-6 (pg/ml) TNF-α (pg/ml) 造模对照组 8 48.06±2.04 35.93±2.52 290.68±81.10 单纯照射组 8 15.34±1.15a 51.51±8.38a 381.44±49.68a 照射+丙酸组 8 13.29±0.76b 28.04±10.44b 267.78±43.69b 注：IL-6. 白介素6；TNF-α. 肿瘤坏死因子α。a与造模对照组比较，t = 14.50、2.67、5.04，P＜0.05；b与单纯照射组比较，t = 3.40、4.86、5.06，P＜0.05

表 2 不同处理组小鼠结直肠癌组织中炎症因子水平(x±s) Table 2 The levels of inflammatory factors in colorectal cancer tissues of mice in different treatment groups(x±s)

4. 丙酸对HCT-8细胞p53基因表达、细胞周期分布及凋亡的影响：RT-PCR的结果显示，照射或丙酸单独处理均可提高p53表达水平，而丙酸联合照射处理会进一步提高p53的表达水平(t = 3.67、9.94，P＜0.05，图 4A、B)。流式细胞术结果表明，单纯丙酸处理对细胞周期的影响不显著(P>0.05)，单纯照射使细胞G₂/M期比例增加，G₀/G₁期和S期比例减少(t = 3.82、20.35，P＜0.05)，并诱导细胞凋亡。丙酸联合照射使G₀/G₁期和S期分布进一步减少，G₂/M期阻滞更明显(t = 9.75，P＜0.05)，见图 4C。空白对照组、单纯丙酸组、单纯照射组、照射+丙酸组细胞凋亡率分别为(13.47±2.04)%、(19.50±2.54)%、(31.49±2.70)%、(38.11±3.64)%，与空白对照组相比，丙酸和照射单独作用均可增加凋亡率(t = 4.53、13.05，P＜0.05)，照射联合丙酸较单纯照射细胞凋亡率可进一步提高(t =3.58，P＜0.05)。

注：1. 空白对照组；2. 单纯丙酸组；3. 单纯照射组；4. 照射+丙酸组；a与空白对照组比较，t = 3.67、9.94、3.82、20.35，P＜0.05；b与单纯照射组比较，t =3.02、9.75，P＜0.05 图 4 照射及丙酸对HCT-8细胞p53基因表达及细胞周期分布的影响  A. 电泳图；B. p53相对含量；C. 细胞周期分布 Figure 4 The mRNA levels of p53 in HCT-8 cell treated with propanoic acid and effects of irradiation and propionic acid on HCT-8 and cell cycle distribution A. Electropherogram; B. Relative content of p53; C. Cell cycle distribution

5. 不同代谢产物及混合代谢产物对AOM/DSS结直肠癌造模小鼠的放疗增敏作用：对比丙酸与另一种短链脂肪酸代谢产物丁酸对结直肠癌的放射增敏作用。结果表明，丙酸和丁酸单独使用的放射增敏效果相似，但丙酸与丁酸联合使用能更加显著地减少结直肠肿瘤数量(t = 2.37、2.68、3.45、2.82、3.43，P＜0.05，图 5)，对于肿瘤面积，造模对照组、单纯照射组、照射+丙酸组、照射+ 丁酸组及照射+丙酸联合照射组分别为(10.00±0.47)、(7.08±0.73)、(2.49±0.33)、(2.72± 0.13)、(1.59±0.13)mm²，与造模对照组比较，其他4组差异均有统计学意义(t =7.84、12.29、11.63、15.49，P＜0.05)；与单纯照射组比较，照射联合药物差异有统计学意义(t = 3.69、3.55、7.31，P＜0.05)。

注：a与造模对照组比较，t = 2.37、2.68、3.45、2.82、3.43，P＜0.05 图 5 丁酸及丙酸联合照射对AOM/DSS结直肠癌造模小鼠结直肠肿瘤数量的影响 Figure 5 The effect of butyric acid or (and) propionic acid co-irradiation on the number of colorectal tumors in AOM/DSS colorectal cancer modeling mice

结直肠癌是全球常见恶性肿瘤之一，我国其发病率和死亡率分别占全部恶性肿瘤的10.7%和9.3% ^[13]，位居第四。在临床治疗中，中晚期直肠癌患者常因手术难度大、造瘘等问题选择放疗。术前放疗可缩小肿瘤、提高手术切除率、降低局部复发率，新辅助放化疗也能显著提高手术切除率和长期生存率^[14]。然而，结直肠癌细胞的辐射抗性及放疗后的不良反应限制了放疗的应用。因此，开发安全有效的放疗增敏技术具有重要意义。

肠道微生物通过两种方式影响疾病进展与治疗：直接与宿主细胞相互作用，或通过代谢产物发挥作用^[15]。例如，乳酸杆菌的代谢产物α-甘露糖苷酶可显著抑制结直肠癌细胞生长，从而抑制结直肠癌的发展^[16]。前期研究表明，肠道罗斯拜瑞氏菌的代谢产物丁酸通过OR51E1/RALB信号通路提高结直肠癌放疗敏感性^[10]，而戊酸和吲哚-3-丙酸可改善腹部局部照射导致的胃肠道损伤^[8-9]。本研究探讨了嗜黏蛋白阿克曼氏菌(A. muciniphila)代谢产物丙酸对结直肠癌放疗的影响。与健康个体相比，结直肠癌患者中A. muciniphila丰度降低^[17]，且其通过抑制癌细胞增殖和促进凋亡发挥抗肿瘤作用^[18]。在放射和AOM/DSS诱导的肠炎模型小鼠中，灌胃A. muciniphila可改善黏膜炎症、降低炎症因子水平、保护肠道屏障^[6]。然而，A. muciniphila的定植效果存在个体差异，且丰度过高可能加剧肠道炎症^[7]。因此，本研究进一步探讨其代谢产物是否具有放疗增敏作用。

实验结果表明，经A. muciniphila条件培养基预处理1 h后，HCT-8细胞在6 Gy照射下的相对存活力显著低于空白对照组和单纯照射组，提示A. muciniphila代谢产物可能增强结直肠癌放疗敏感性。进一步研究发现，丙酸预处理后，HCT-8细胞的相对存活力和增殖能力显著下降，表明丙酸可增强放疗对结直肠癌细胞的杀伤作用。在AOM/DSS诱导的结直肠癌小鼠模型中，丙酸灌胃可增加受照小鼠结直肠长度，减少肿瘤数量和体积，下调炎症因子IL-6和TNF-α表达，表明丙酸可增强小鼠结直肠癌放疗敏感性，减轻肠道炎症反应。

本研究探讨了丙酸提高结直肠癌放疗疗效的分子机制。p53是放射治疗的主要效应因子，照射后被激活，通过诱导细胞周期阻滞、衰老和凋亡来提高放疗疗效^[19]。实验发现，丙酸处理可进一步提高照射后HCT-8细胞中p53基因的表达水平。细胞周期和凋亡调控细胞生理过程，确保细胞准确复制基因组并维持稳态。细胞周期检查点和凋亡途径的相互作用有助于维持基因组稳定性和生理平衡。例如，肿瘤抑制因子可阻止损伤DNA细胞进入S期，防止未修复的DNA复制至下一代细胞^[20]；严重损伤的细胞则通过凋亡程序被清除。G₂/M期是细胞进入有丝分裂的关键阶段，若存在未修复的DNA损伤，细胞周期会被阻滞并启动凋亡程序。已有研究报道，在直肠癌放射治疗中，调控细胞周期可影响直肠癌的放射敏感性^[21]。本研究发现，丙酸与照射联用可加重细胞G₂/M期阻滞和凋亡，表明丙酸通过诱导细胞周期阻滞和凋亡，提高结直肠癌细胞对放疗的敏感性。此外，丙酸与丁酸联合处理对结直肠癌小鼠的放疗增敏效果更为显著。

本研究证实，A. muciniphila的条件培养基可增强放疗对结直肠癌细胞的杀伤作用。其代谢产物丙酸能提高结直肠癌细胞及模型小鼠的放疗敏感性，减轻肠道不良反应。机制上，丙酸通过调控p53活性，诱导细胞周期G₂/M期阻滞和细胞凋亡，提高放疗敏感性。这为结直肠癌放疗增敏剂的研发提供了实验基础和理论依据。然而，目前丙酸/丙酸盐的实际应用仍存在一定瓶颈。尽管丙酸被美国食品和药物管理局(FDA)认定为公认安全并广泛应用于食品与药品中^[22]，但由于丙酸的代谢速度较快，在一定程度上会限制其在体内的积累和生物利用度。

利益冲突  无

作者贡献声明  肖雨浓负责实验操作及撰写论文；董佳丽、王齐、李源、董妍汐、邱吉巍协助实验；崔明负责实验设计，修改论文