2025, Vol. 45
2. 军事科学院军事医学研究院，北京 100850
2. Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China
核技术的普遍应用在带来经济效益的同时也带来了潜在风险，寻找潜在辐射防护靶点进而开发辐射防护剂至关重要[1]。研究发现，低剂量电离辐射对维持基因组完整性和修复受损DNA的能力产生有益影响[2]。低剂量电离辐射已经被证明具有对正常细胞的放射适应性防护作用，转录因子NF-κB、DNA损伤传感器ATM、癌蛋白HER-2、细胞周期蛋白元件cyclin B1等已被证明在放射适应性抵抗中发挥重要作用[3]。低剂量电离辐射诱导的正常淋巴细胞适应性现象也通过损伤修复、存活等指标评估[4]。这些研究均证明低剂量适应性反应激活的相关分子在辐射防护中发挥至关重要的作用，但仍需开展深入研究，以期开发出更有效的辐射防护靶点。
细胞周期蛋白D1(cyclin-D1，CCND1)是细胞周期的重要调节因子，在细胞生长、代谢和细胞分化中发挥作用[5]。已经在一些肿瘤细胞中证明其与辐射诱导的细胞凋亡、损伤修复和放射敏感性密切相关[6]，且近年研究发现，CCND1可通过在G1/S转换时失调细胞周期来增加细胞增殖，还能通过抑制BAX释放进而降低淋巴瘤细胞对化疗药物的敏感性[7]，但其与淋巴细胞辐射抗性相关性亟待进一步研究。
材料与方法1. 细胞培养：人外周血B淋巴细胞系AHH-1细胞及人T淋巴瘤细胞H9为军事医学研究院实验室内保存。AHH-1、H9细胞均于含20%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5%的CO2、饱和湿度条件的培养箱中培养，2~3 d传代1次。
2. 细胞照射与建模：XCELL225辐照仪(美国KUBTEC公司)。0.05 Gy及2 Gy的X射线照射剂量率分别为0.44和1.00 Gy/min。源靶距55 cm。模型构建方法：取对数生长期细胞进行照射，预照射0.05 Gy间隔6 h后进行2 Gy照射，辐照后1 h收样，作为诱导适应性反应组[0.05 Gy(6 h)+2 Gy组]，并设置假照射(0 Gy组)和仅照射2 Gy后1 h收样(2 Gy组)作为对照。转录测序样本及验证的照射方法：0.05 Gy辐照后6 h收样作为低剂量辐照组(0.05 Gy组)，并将2 Gy照射后6 h进行收样(2 Gy组)和假照射(0 Gy组)作为对照，每组设置4个平行样。
3. 主要试剂和仪器：胎牛血清(上海ExCell Bio公司)，青霉素-链霉素溶液(美国Hyclone公司)，RPMI 1640培养基(美国Sigma公司)，DNA损伤检测试剂盒(上海碧云天公司)，鼠抗人γ-H2AX抗体(德国Millpore公司)，山羊抗鼠488抗体(英国Abcam公司)，荧光共聚焦显微镜(日本尼康公司)，细胞计数试剂盒(CCK-8)(日本Dojindo公司)，酶标仪(瑞士Tecan公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天公司)，超敏化学发光成像仪(美国GE公司)，鼠抗人CCND1、鼠抗人β-肌动蛋白抗体(武汉Proteintech公司)，鼠抗IgG(H + L)抗体(美国KPL公司)，TRIzol裂解液(美国Sigma公司)，RNase-free H2O(北京博迈德生物科技有限公司)，紫外分光光度计(美国赛默飞公司)，反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)，2 × M5 HIPer SYBR Premix EsTaq(北京聚合美生物科技有限公司)，引物序列(北京擎科生物技术有限公司)，慢病毒构建及包装(上海吉凯基因医学科技有限公司)，嘌呤霉素(北京索莱宝生物科技有限公司)。
4. γ-H2AX焦点(foci)荧光检测：将待测样品离心1 000 r/min，4 min，离心半径7.2 cm，胰酶消化1 min，常温固定15 min，均匀涂抹于盖玻片上，后续实验步骤按照DNA损伤检测试剂盒说明书进行。简述如下：封闭液封闭20 min，4℃孵育鼠抗人γ-H2AX抗体(1∶500)12 h，洗涤后，室温下孵育山羊抗鼠488抗体(1∶200)2 h。洗涤后进行细胞DAPI核染色，封片后荧光共聚焦显微镜进行图像捕获，利用Image J软件进行结果统计分析，计数至少200个细胞核。
5. 细胞增殖实验：采用CCK-8试剂盒进行测定。根据说明书，将待测细胞离心后制备成单细胞悬液，种于96孔板内。密度2 000个/孔，体积100 μl/孔。分别于接种后0、1、2、3、4 d，加入11 μl/孔CCK-8试剂，37℃培养箱内孵育2 h后利用酶标仪测量450 nm处吸光度(A450)值。
6. BCA蛋白浓度测定及蛋白质印迹分析(Western blot)：将收集的稳定过表达/敲低CCND1的细胞样品加入适量的RIPA裂解液，于冰上静置30 min，4℃下12 000 r/min，离心半径7.2 cm，离心15 min，取上清后按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行测定。随后取60 μg样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(80 V，25 min；120 V，60 min)，将条带转至硝酸纤维素膜(90 V，30 min)，5%脱脂牛奶封闭2 h，于4℃进行一抗孵育12 h，随后进行室温二抗孵育2 h，利用超敏化学发光成像仪进行曝光显影。鼠抗人CCND1、鼠抗人β-肌动蛋白抗体、鼠抗IgG(H + L)抗体均按照1∶5 000稀释。
7. RT-qPCR：按TRIzol裂解液试剂盒说明书进行RNA提取，加200 μl三氯甲烷(TRIzol: 三氯甲烷= 5∶1)，4℃ 12 000 r/min，离心半径7.2 cm，离心15 min；取上清液加入等体积的异丙醇，4℃下离心10 min；加入无水乙醇清洗沉淀，4℃离心5 min，使用RNase-free H2O溶解RNA沉淀，利用紫外分光光度计对RNA进行纯度检测和浓度测定，根据反转录试剂盒说明书进行RNA反转录，并将其作为模板，按照2 × M5 HIPer SYBR Premix EsTaq说明书进行实时荧光定量PCR。反应条件为：95℃ 3 min，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。以β-肌动蛋白为内参基因，利用2-△△Ct法计算相对表达量。引物序列见表 1。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences |
8. 过表达/敲低CCND1稳定株构建：将CCND1全长序列及敲低序列分别克隆到慢病毒载体(携带嘌呤霉素抗性基因)上，并包装入慢病毒，获得过表达及敲低CCND1慢病毒，感染细胞后72 h，利用5 μg/ml嘌呤霉素筛选，用RT-qPCR及Western blot法鉴定CCND1表达水平，最终获得稳定过表达及敲低CCND1的细胞系。
9.统计学处理：采用SPSS 26.0软件分析。所有实验均设置3个平行样，符合正态分布、方差齐，实验数据采用 x ± s表示。两组间的差异使用Student′s t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。
结果1. 低剂量适应性反应模型构建：0.05 Gy(6 h)+2 Gy组细胞核内γ-H2AX点平均数量为1.73 ± 2.38，单纯2 Gy照射组细胞核内γ-H2AX点平均数量为8.72 ± 6.03，0.05 Gy(6 h) + 2 Gy组较2 Gy组Foci点数量显著减少(t = 22.74，P＜0.05)，表明相较于2 Gy组，0.05 Gy预照射能够显著降低DNA损伤水平，0.05 Gy预照射间隔6 h能够诱导出适应性反应(图 1)。
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图 1 AHH-1细胞照射0.05 Gy后适应性反应模型构建的γ-H2AX免疫荧光染色结果×100 Figure 1 Immunofluorescence staining results of γ-H2AX after exposure to 0.05 Gy in the AHH-1 adaptive response model ×100 |
2. 全转录测序结果分析与验证：PCA主成分分析结果如图 2所示，0、0.05和2 Gy组的4个平行样的组间分布具有良好的分离性，同一组别内样品间的组内分布也具有良好的聚类性。但由于LD与HD组(即0.05 Gy组与2 Gy组)内的平行样本4的PCA成分分析点较其他值更为分离，因此后续进行数据分析时已剔除LD4及HD4组数据。为了全面直观地展示不同处理组之间的关系及差异基因的表达，将0.05 Gy组、2 Gy组相对于0 Gy组中P＜0.05，|log2FC| > 0.26的差异基因进行聚类分析并进行热图呈现，发现0.05 Gy组与2 Gy组差异基因存在显著不同(图 2B)。0.05 Gy组vs. 0 Gy组共计筛选出207个差异表达的mRNA，533个差异表达的lncRNA。2 Gy组vs. 0 Gy组共计筛选出2 650个差异表达的mRNA，954个差异表达的lncRNA，低剂量辐照组与高剂量辐照组相较于假照组差异基因的数量存在显著不同(图 2C)。为了验证测序数据的准确性，在0.05 Gy vs. 0 Gy进行了初步的筛选，选取0 Gy或0.05 Gy的荧光均值≥ 0.2，SD/均值≤ 0.5的差异基因，选取差异表达变化倍数最为显著的8个mRNA，进行RT-qPCR验证。RT-qPCR实验结果显示，B3GALT4、FAAH、MAT1A、LOC102723728、NECTIN4、FAM156A等6个基因与测序结果变化趋势一致(图 3)，表明测序数据可靠。
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图 2 AHH-1细胞在0.05 Gy及2 Gy照射后6 h的全转录测序结果分析 A.PCA主成分分析；B.0.05 Gy和2 Gy组分别与0 Gy组的差异基因热图分析；C. 0.05 Gy和2 Gy组分别与0 Gy组的差异基因数量韦恩图 Figure 2 Analysis of whole-transcriptome sequencing results of AHH-1 at 6 h after irradiation with 0.05 Gy and 2 Gy A. PCA principal component analysis; B. Heat map analysis of differential genes in the 0.05 Gy and 2 Gy groups versus the 0 Gy group; C. Venn diagram of the number of differential genes in the 0.05 Gy and 2 Gy groups versus the 0 Gy group |
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注：a0.05 Gy与0 Gy相比，t =3.792~5.241，P＜0.05；b 2 Gy与0 Gy相比，t =3.5~6.767，P＜0.05；RT-qPCR. 实时定量检测基因表达倍数，Sequencing. 全转录组测序检测基因表达倍数 图 3 AHH-1细胞在0.05及2 Gy照射后6 h的全转录测序结果验证A-F分别为B3GALT4、FAAH、MAT1A、LOC102723728、NECTIN4、FAM156A基因表达倍数验证 Figure 3 Verification of whole-transcriptome sequencing results of AHH-1 at 6 h after irradiation with 0.05 Gy and 2 Gy A-F. Fold validation of B3GALT4, FAAH, MAT1A, LOC102723728, NECTIN4, FAM156A gene expression |
3. 低剂量激活辐射防护相关候选基因的验证：对0.05 Gy组vs. 0 Gy组进行KEGG分析发现，在前20个信号通路中，主要集中在ATP转运、ErbB受体酪氨酸激酶、AMP活化蛋白激酶、钙离子等信号通路(图 4A)。进一步进行GO功能富集分析发现，与低剂量适应性反应相关的DNA损伤与修复、氧化还原、细胞增殖与凋亡、周期等功能通路中的多种基因被激活(图 4B)。为了筛选出低剂量激活的辐射防护相关基因，将这些基因利用P＜0.05，|log2FC| > 0.26，任意一组的荧光均值≥ 0.2，SD/均值≤ 0.5的条件筛选出10个差异基因，进一步进行RT-qPCR验证。结果显示ZMAT3、MGAT3、DFFB、CYP4F2、ITGA6、CCND1等6个基因与测序结果变化趋势一致(图 5)，这些基因可能是低剂量激活的具有辐射防护作用的候选基因。使用Pearson相关系数来计算这些mRNA与lncRNA之间的相关性，并设定了P＜0.05，Pearson > 0.8的阈值，共计筛选出60个lncRNA，将ZMAT3相关的1个lncRNA，MGAT3相关的3个lncRNAs，DFFB相关的10个lncRNAs，CYP4F2相关的2个lncRNAs，ITGA6相关的6个lncRNAs，CCND1相关的43个lncRNAs来进行lncRNA-mRNA的网络可视化构建。
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图 4 低剂量激活辐射防护相关候选基因的功能分析 A. 0.05 Gy vs.0 Gy的差异基因KEGG通路功能分析；B. 0.05 Gy vs.0 Gy的差异基因GO通路功能富集分析 Figure 4 Functional analysis of candidate genes related to the low-dose radiation activation of radiation protection A. Functional analysis of the KEGG pathways of differential genes in the 0.05 Gy and 0 Gy groups; B. Functional enrichment analysis of the GO pathways of differential genes in 0.05 Gy and 0 Gy groups. |
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注：a 0.05 Gy与0 Gy相比，t =2.781~9.362，P＜0.05；b 2 Gy与0 Gy相比，t = 3.361~18.38，P＜0.05 图 5 低剂量激活辐射防护相关候选基因的验证 A-F. ZMAT3、MGAT3、CYP4F2、ITGA6、DFFB、CCND1基因表达倍数验证 Figure 5 Validation of candidate genes related to low-dose activation of radiation protection A-F. Fold validation of ZMAT3、MGAT3、CYP4F2、ITGA6、DFFB、CCND1 gene expression |
4. CCND1促进辐射后的增殖及减轻辐射后的DNA损伤：在上一步筛选出了6个辐射防护候选基因，对其中的一个基因CCND1开展了与辐射抗性相关性的功能研究。选择CCND1的低表达细胞系AHH-1细胞构建过表达稳定株，CCND1的高表达细胞系H9细胞构建敲低稳定株(图 6A)。
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注：a过表达/敲低组与对照组比较，t =6.44~26.25，P＜0.05 图 6 CCND1促进辐射后的增殖及减轻辐射后的DNA损伤 A.CCND1蛋白表达水平检测；B.CCK-8检测过表达CCND1细胞增殖速率；C.CCK-8检测敲低CCND1细胞增殖速率；D. CCK-8检测照射对过表达CCND1细胞增殖速率；E.免疫荧光检测CCND1过表达/敲低对DNA损伤水平的影响 Figure 6 CCND1 promoting cell proliferation and reducing DNA damage after irradiation A. Detection of protein expression level of CCND1; B. Cell proliferation rate under CCND1 overexpression detected using CCK-8 assay; C. Cell proliferation rate under CCND1 knockdown detected using CCK-8 assay; D. Cell proliferation rate under radiation-induced CCND1 overexpression detected using CCK-8 assay; E. Influence of CCND1 overexpression and knockdown on DNA damage detected using immunofluorescence assay |
首先，通过CCK-8实验探究了CCND1表达水平对细胞增殖的影响(图 6B)，在AHH-1细胞的过表达组及对照组中，接种细胞后各个时间点的A450值均呈上升的趋势。在铺板后0和1 d，两组的A450值无明显差异，但在2、3和4 d过表达组显著高于对照组(t = 6.44、10.22、16.33，P＜0.05)，表明上调CCND1的表达显著促进AHH-1细胞的增殖。H9细胞照后2、3、4 d，敲低sh CCND1组均显著低于对照组(图 6C)，差异有统计学意义(t = 13.58、19.68、26.25，P＜0.05)，表明下调CCND1的表达可以显著降低H9细胞的增殖速率。
通过CCK-8实验和γ-H2AX焦点荧光实验，对CCND1在辐射抗性中的功能开展研究。CCK-8结果显示，2 Gy照射后，过表达CCND1组的A450值在2、3、4 d显著高于对照组(t = 7.92、9.15、14.76，P＜0.05，图 6D)，表明过表达CCND1可以显著抵抗辐照所导致的细胞增殖抑制作用。AHH-1过表达CCND1照射2 Gy后γ-H2AX免疫荧光结果显示，照后0.5、1、2、4、8、12 h的过表达组细胞核内γ-H2AX焦点数量较对照组显著降低(图 6E、表 2)，4、8、12 h时对照组细胞核内γ-H2AX焦点数量分别为1.93 ± 2.29、1.01±1.67和1.96 ± 2.59，而过表达组细胞核内γ-H2AX焦点数量分别为0.47 ± 1.07、0.36 ± 1.04和1.32 ±2.02，差异具有统计学意义(t = 9.68、4.59、2.79，P＜0.05)，表明过表达CCND1可以显著降低辐射诱导的AHH-1细胞的DNA损伤水平。H9敲低CCND1照射后的免疫荧光γ-H2AX结果显示照射后0.5、1、2、4、12 h的敲低组细胞核内γ-H2AX焦点数分别为7.29 ± 7.11、5.25 ± 5.83、7.50 ± 6.79、7.03 ± 7.16和3.91 ± 6.30，高于对照组的5.43 ± 6.23、4.16 ± 5.42、5.97 ± 6.37、3.80 ± 5.24和2.41 ± 4.41(t = 3.99、2.87、3.33、7.61、3.76，P＜0.05)，表明敲低CCND1可以显著提高辐射诱导的H9细胞的DNA损伤水平。
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表 2 过表达/敲低CCND1后各组免疫荧光点平均数量统计 Table 2 Statistics on the average number of immunofluorescent spots in each group after overexpression/knockdown of CCND1 |
5.CCND1调控辐射抗性的下游分子机制：利用过表达CCND1的AHH-1细胞稳定株及敲低CCND1的H9细胞稳定株，通过RNA-Seq高通量测序技术来分析CCND1表达水平的改变对下游通路的影响(图 7)。PCA主成分分析结果显示，过表达组及敲低组与对照组的样本间均具有显著差异，同一组别内样品具有良好的聚类性(图 7A)。GO功能通路富集分析结果显示，敲低及过表达CCND1后均可以诱导淋巴细胞的免疫和炎症反应过程(图 7B)。进一步对差异表达基因进行KEGG信号通路富集分析，结果显示，在过表达及敲低CCND1后，DNA损伤修复、细胞存活及死亡等相关通路被激活(图 7C)。其中，与DNA损伤修复通路相关的FANCB、GTF2H3、HES1、MCM6、POLR2I、UNG等共6个基因被富集，与细胞存活及死亡通路相关的CACNA1D、SERPINE1等共77个基因被富集。
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图 7 初步探究CCND1调控辐射抗性的下游分子机制 A. PCA主成分分析 B.过表达组及敲低组分别与对照组的GO功能富集分析 C. 过表达组及敲低组分别与对照组的KEGG信号通路富集分析 Figure 7 Preliminary exploration of the downstream molecular mechanism behind the CCND1 regulation of radiation resistance A. Principal component analysis (PCA); B. Functional enrichment analysis of the GO pathway of the CCND1 overexpression and knockdown groups compared to the control group; C. KEGG pathway enrichment analysis of CCND1 overexpression and knockdown groups compared to the control group |
讨论
核技术在医疗、军事、工业等方面的广泛应用导致辐射暴露风险增加，筛选潜在的辐射防护靶点是目前研究面临的主要问题。研究证明，低剂量电离辐射诱导的适应性反应可能通过激活内在辐射防护靶基因来发挥辐射防护作用[8]。在0.05 Gy的低剂量照射的AHH-1细胞适应性反应模型中发现，低剂量照射可以显著降低后续2 Gy照射所导致的DNA损伤水平。经转录组测序筛选出了6个0.05 Gy激活的辐射防护相关候选基因，确定其中一个候选基因CCND1为主要研究对象，并初步探索了其相关机制。
6个低剂量激活的辐射防护候选基因分别为ZMAT3、MGAT3、DFFB、CYP4F2、ITGA6、CCND1，其中CCND1的上调增强了淋巴细胞的辐射抗性，这与文献报道的CCND1的表达增强肿瘤辐射抗性的结论一致，如Romdhoni等[9]研究发现CCND1下调会增加鼻咽癌细胞的放射敏感性，其蛋白的上调会增加鼻咽癌患者的放射耐药性；Shimura等[10]发现人HepG2和HeLa细胞在长期分次照射后辐射抗性增强，而这种放射抗性是由CCND1诱导的DNA损伤修复反应所致的。本研究通过正常淋巴细胞的辐照模型，证明了CCND1可以通过调控损伤修复和增殖通路增强正常细胞的辐射抗性。上述结果表明，CCND1具有成为辐射抗性作用靶点的巨大潜能。另外，本研究虽未对另外5个候选基因开展辐射防护的功能验证，但推测它们也可能成为潜在的辐射防护靶点。例如，ITGA6已经被证明可以分别通过正向调节PI3K/Akt通路和MEK/Erk通路促进非小细胞肺癌细胞[11]以及乳腺癌细胞的抗辐射性[12]；Palumbo等[13]也发现ZMAT3的表达可能与个体的辐射敏感性相关。虽然另外3个基因MGAT3、DFFB、CYP4F2未有与辐射抗性相关的研究报道，但MGAT3可以参与肿瘤药物的耐药性。例如，MGAT3可以通过破坏肿瘤细胞IFN-γ受体α的稳定性，从而导致结直肠癌细胞对IFN-γ的耐药性[14]。因此，推测剩余基因也可能具有潜在的辐射抗性作用，下一步有必要对这些潜在的辐射防护基因进行功能研究。
另外，在筛选低剂量激活的关键候选辐射防护相关基因中，发现了许多lncRNAs与上述6个辐射防护候选基因的表达具有强相关性。尤其是与CCND1具有强相关关系的43个lncRNAs(Pearson系数>0.8)也可能具有辐射防护功能，进而成为辐射防护的关键靶点。有文献报道，lncRNA可以在辐射抗性中发挥重要作用。例如，LINC00839在神经胶质瘤干细胞中的高表达可以通过诱导Wnt/β-catenin激活，从而维持神经胶质瘤干细胞的抗辐射性[15]。在对食管鳞状细胞癌的研究中，敲除LncRNA FAM201A通过负调控miR-101表达，从而使ATM和mTOR等mRNA水平表达上调，进而增强了细胞的放射敏感性[16]。目前，靶向CCND1调控辐射抗性的相关lncRNA至今未有相关报道，但已有一些报道lncRNA可以靶向CCND1来调控细胞周期和损伤修复，例如，LncRNA-OBFC2A可以通过抑制1, 4-苯醌从而诱导的人淋巴母细胞样AHH-1细胞G1/S细胞周期进程[17]。lncRNA SNHG7下调可以显著抑制CCND1表达，从而诱导前列腺癌细胞周期停滞在G0/G1期并抑制肿瘤生长[18]。因此，在本研究中发现的这些lncRNAs可能是重要的辐射防护靶点，下一步可以通过上/下调这些lncRNAs的表达来研究其对辐射抗性的调控作用。
最后，在对CCND1调控辐射防护下游的机制探索研究中，对CCND1下游靶基因进行KEGG信号通路富集分析，结果显示，与DNA损伤修复通路相关的HES1等6个基因被富集。已有一些研究证明这些基因参与辐射抗性的调控。例如，HES1可以通过Notch信号传导通路来增强神经胶质瘤干细胞/祖细胞诱导的恶性基质细胞的放射抗性[19]。一些报道也发现HES1上调可以抑制细胞周期相关基因如CCND1的表达，从而抑制细胞增殖通路[20]。另外，在上/下调CCND1后均可以在细胞存活及死亡相关通路中富集到SERPINE1和CACNA1D。其中，SERPINE1可能通过以ATM/ATR依赖性方式来促进三阴性乳腺癌细胞的放射抗性[21]。鉴于以上这些基因与CCND1的密切相关性，有必要开展这些基因对CCND1调控辐射抗性的介导作用的研究。
综上所述，低剂量0.05 Gy预照射间隔6 h可以诱导出对后续2 Gy照射的适应性反应，筛选出了6个低剂量激活的辐射防护候选基因，并揭示了CCND1在辐射抗性中的功能，本研究证明了低剂量电离辐射激活的相关基因可能作为辐射防护的关键靶基因，为辐射防护剂的开发提供了新的视角。
利益冲突 无
作者贡献声明 蔡丹负责样品采样、实验研究、数据分析、论文撰写及修改；范英、莫云琪、刘瑞雪、吴磊、马佳楠、王琪、戚振华参与样品收集及样品预处理；王治东指导论文修改
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