中华放射医学与防护杂志  2025, Vol. 45 Issue (7): 623-628   PDF    
引用本文
熊利婷, 李春晓, 王俊杰. 高剂量分割照射对NK细胞效应功能的影响及应用[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2025, 45(7): 623-628, DOI: 10.3760/cma.j.cn112271-20250318-00093.
高剂量分割照射对NK细胞效应功能的影响及应用
熊利婷1,2 , 李春晓2 , 王俊杰1,2     
1. 北京大学医学部医学技术研究院, 北京 100191;
2. 北京大学第三医院肿瘤放疗科, 北京 100191
收稿日期: 2025-03-18
通信作者: 王俊杰, E-mail: junjiewang_edu@sina.cn
[摘要] 目的 探讨高剂量分割照射对自然杀伤(NK)细胞功能及免疫检查点表达的影响。方法 取10只6~8周龄C57BL/6N雌性小鼠, 右侧肩背部皮下注射Lewis肺癌细胞, 建立皮下荷瘤肺癌模型。采用随机数表法分为对照组和照射(RT)组, 每组5只。RT组接受分割照射8 Gy×3次的照射, 对照组不照射。照后3 d采用流式细胞术, 比较两组间脾脏、引流淋巴结、肿瘤组织内NK细胞的数量、NK细胞免疫检查点程序性死亡受体1(PD-1)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)以及NK细胞表面抗体溶酶体相关膜蛋白1(CD107a)的表达变化。用NK细胞表面抗体CD107a的表达评估其活化状态和细胞毒性。取20只荷瘤小鼠采用随机数表法分为对照组、单纯照射(RT)组、单纯抗TIGIT治疗(αTIGIT)组和照射联合抗TIGIT治疗组(RT+αTIGIT)4组, 每组5只, RT组和RT+αTIGIT组接受高剂量分割照射, αTIGIT组和RT+αTIGIT组每3天给予αTIGIT抗体0.5 mg/kg, 对照组用同型IgG处理, 监测肿瘤大小。照后20 d, 分别采用Ki67免疫组织化学染色和TUNEL免疫荧光染色检测肿瘤细胞增殖水平和凋亡事件。结果 与对照组相比, 高剂量分割照射导致RT组的脾脏、肿瘤引流淋巴结及肿瘤微环境中的NK细胞数量减少(t=6.79~7.54, P < 0.05), PD-1和TIGIT (t=4.16~5.65, P < 0.05;t= 6.12~21.13, P < 0.05)的平均荧光强度显著上调。CD107a+表达下降(t= 5.64~8.99, P < 0.05)。与RT组相比, RT+αTIGIT组肿瘤质量和体积降低(t=2.50、9.12, P < 0.05), 且Ki67表达下降(t=12.10, P < 0.05), TUNEL表达升高(t=5.42, P < 0.05)。结论 高剂量分割照射会削弱NK细胞功能, 上调免疫检查点表达, 从而限制免疫应答, 照射联合抗TIGIT抗体治疗能够在一定程度上逆转这一趋势, 改善肿瘤治疗效果。
[关键词] 高剂量分割照射    自然杀伤细胞    T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(TIGIT)    
The impact and applications of high-dose fractionated irradiation on the effector function of NK cells
Xiong Liting1,2 , Li Chunxiao2 , Wang Junjie1,2     
1. Institute of Medical Technology, Peking University Health Science Center, Beijing 100191, China;
2. Department of Radiation Oncology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China
Corresponding author: Wang Junjie, E-mail: junjiewang_edu@sina.cn
[Abstract] Objective To investigate the impact of high-dose fractionated irradiation on NK cell function and immune checkpoint expression. Methods A total of 10 female C57BL/6N mice aged 6-8 weeks were subcutaneously injected with Lewis lung carcinoma (LLC) cells on the right shoulder to establish a subcutaneous tumor model. Mice were randomly divided into two groups: the control (Ctrl) group and the radiation (RT) group, with five mice in each group. The RT group received fractionated irradiation of 8 Gy×3 fractions, while the Ctrl group was not irradiated. Three days later, flow cytometry was performed to compare the numbers of NK cells and the expressions of immune checkpoints, including programmed death-1 (PD-1) and T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains (TIGIT), in the spleen, draining lymph nodes, and tumor tissue between the two groups. The activation state and cytotoxicity of NK cells were assessed by the expression of lysosomal-associated membrane protein 1 (CD107a) on the NK cell surface. Additionally, a second experiment was conducted with 20 tumor-bearing mice divided into four groups: Ctrl, RT, anti-TIGIT (αTIGIT) treatment, and RT combined with αTIGIT treatment (RT+αTIGIT), with five mice per group. The RT and RT+αTIGIT groups received fractionated RT, while the αTIGIT and RT+αTIGIT groups were treated with blocking antibody αTIGIT at 0.5 mg/kg every 3 days and the Ctrl group was treated with isotype control IgG. Tumor size was monitored during the experiment. On day 20, mice were euthanized, Ki67 immunohistochemistry and TUNEL immunofluorescence staining were used to evaluate tumor cell proliferation and apoptosis. Results Compared with the Ctrl group, fractionated high-dose RT resulted in a decrease in NK cell numbers in the spleen, tumor-draining lymph nodes, and tumor microenvironment in the RT group (t=6.79-7.54, P < 0.05), together with a significant upregulation of the mean fluorescence intensity of PD-1 and TIGIT (t=4.16-5.65, P < 0.05; t=6.12-21.13, P < 0.05), and a decrease in CD107a+ expression (t=5.64-8.99, P < 0.05). Compared with the RT group, the RT+αTIGIT group showed reduced tumor weight (t=2.50, 9.12, P < 0.05), decreased Ki67 expression (t=12.10, P < 0.05), and increased TUNEL expression (t=5.42, P < 0.05). Conclusions The fractioned high-dose RT can impair NK cell function and upregulate immune checkpoint expression, thereby limiting the immune response. The combination of irradiation with anti-TIGIT antibody treatment can partially reverse this trend and improve tumor treatment efficacy.
[Key words] High-dose fractionated irradiation    Natural killer cells    T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains (TIGIT)    

放射治疗在癌症治疗中发挥重要作用[1]。放疗不仅杀伤癌细胞，还对患者的免疫系统产生影响，诱导肿瘤细胞表面暴露更多的分子标志物，进而影响肿瘤对治疗的反应[1-2]。高剂量分割放疗在肿瘤治疗中具有多方面优势。高剂量分割放疗(如8~10 Gy/次)在较短周期内完成治疗，有助于快速实现肿瘤局部控制，克服肿瘤细胞的放射抗性，特别是对于低α/β比值的肿瘤，治疗效果更为显著[3]。自然杀伤(NK)细胞是人体免疫系统中的重要细胞，能够识别肿瘤细胞并杀伤病毒感染细胞及某些类型的肿瘤细胞[4]。研究表明，放疗联合促进NK细胞活性的治疗方法可产生协同效应。本研究建立小鼠皮下荷瘤模型，观察高剂量分割照射(8 Gy × 3次)后NK细胞在脾脏、肿瘤引流淋巴结及肿瘤微环境中的数量以及功能变化，同时观察免疫检查点分子程序性死亡受体1(PD-1)和具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)的变化，以期探索高剂量分割照射联合免疫治疗对NK细胞功能和肿瘤治疗疗效的影响。

材料与方法

1.主要试剂与仪器：CD45-BV421单抗(A20)购自美国Biolegend公司；CD3-FITC单抗(17A2)、CD49b-eFluor 450单抗(DX5)、TIGIT-APC单抗(MBSA43)、CD279(PD-1)-PE单抗(MIH4)、CD107a(LAMP-1)-PE单抗(eBioH4A3)、DMEM培养基购自美国ThermoFisher公司；1%青霉素-链霉素购自美国Corning公司；胎牛血清购自美国Gemini公司；αTIGIT抗体1B4购自英国Absolute Antibody公司；Collagenase D、DNase I购自瑞士Roche公司；Dispase购自美国Sigma-Aldrich公司；Cytofix/Cytoperm固定/透膜试剂盒购自美国BD Biosciences公司；兔抗小鼠Ki67抗体购自美国CST公司；TUNEL检测试剂盒购自英国Abcam公司；流式细胞仪购自美国Beckton Dickinson公司；直线加速器Trilogy购自美国Varian公司。

2.细胞培养：小鼠路易斯肺癌(Lewis lung carcinoma, LLC)细胞系购自中国医学科学院基础医学细胞中心。于含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，37℃、5% CO2培养。

3.小鼠荷瘤模型构建：实验动物购于北京大学医学部实验动物科学部[动物许可证：SYXK(京)2021-0064]。C57BL/6N小鼠，雌性，6~8周龄，体质量18~22 g。饲养在(22±2)℃、湿度为50%~60%、12 h光照/12 h黑暗周期的标准动物饲养室内。用0.7%戊巴比妥钠麻醉(5 mg/kg)。将小鼠右侧背部备皮，碘伏消毒，将100 μl中1×106 LLC细胞皮下注射，隔天观察小鼠肿瘤生长情况。肿瘤体积达到约100 mm3时，建模成功。每3天使用游标卡尺测量肿瘤尺寸，并计算肿瘤体积，公式为：体积=长×宽2 × 0.5。20 d后小鼠安乐死后，取瘤块称重。

4.照射条件与给药方法：将20只荷瘤小鼠采用随机数表法分为对照组、单纯照射(RT)组、单纯抗TIGIT治疗(αTIGIT)组和照射联合抗TIGIT治疗(RT+αTIGIT)组，每组5只。RT组和RT+αTIGIT组小鼠麻醉后，侧卧固定于治疗板上。机架角270°，单野照射，射野大小为1.5 cm×1.5 cm，使照射野的下缘紧贴小鼠背部肿瘤基底。在小鼠肿瘤表面放置1.5 cm厚的补偿器。源皮距(SSD)100 cm，6 MV X射线，剂量率为600 cGy/min。肿瘤接受分割照射(8 Gy×3次)。随后，αTIGIT组和RT+αTIGIT组小鼠腹腔注射αTIGIT抗体1B4(500 μg/kg)，每3天注射一次。对照组则给予等体积的同型IgG。

5.流式细胞术检测：将10只荷瘤小鼠采用随机数表法分为对照组和RT组，每组各5只。RT组进行照射。照射后第3天，麻醉小鼠后通过颈椎脱臼法处死小鼠，并取出脾脏、引流淋巴结(dLNs)和肿瘤组织。脾脏和dLNs采用300 μm尼龙网筛进行机械解离，在冰上使用红细胞裂解液裂解红细胞3 min，磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，并以350 ×g离心10 min。弃上清，细胞重悬于冰PBS以备后续实验。肿瘤组织，加入20 ml消化液(含1 mg/ml Collagenase D、2 mg/ml DNase I和100 ng/ml Dispase)，置于37℃振荡培养箱消化30 min。过滤，350 ×g离心5 min，去上清液，再于冰上裂解红细胞3 min，PBS稀释，再次350 ×g离心5 min，去除上清，并重悬细胞以备后续实验。制备得到的小鼠脾脏、dLNs和肿瘤组织单细胞悬液，在避光条件下用荧光抗体进行染色，并使用流式细胞仪分析。

对于表面标志物染色：细胞在冰上孵育20 min，孵育溶液为含2%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS。对于细胞因子的细胞内染色，用GolgiStop、佛波酯(PMA，10 ng/ml) 和离子霉素(ionomycin，100 ng/ml) 在37℃刺激细胞4 h，随后进行表面染色，并使用Cytofix/Cytoperm固定/透膜试剂盒进行固定和透膜处理。将脾脏、引流淋巴结和肿瘤微环境中的NK细胞亚群用CD3-CD49b+进行标记。NK细胞亚群的PD-1和TIGIT分子的表达，进一步在CD49b+的基础上，标记其平均荧光强度。NK细胞亚群的功能效应，用CD49b+CD107a+进行标记。

6.免疫组织化学染色：肿瘤组织在4%中性缓冲甲醛中固定并包埋在石蜡中。苏木精-伊红(HE)染色。将样品置于pH值为6.0的柠檬酸盐缓冲液中，加压加热20 min抗原修复。样品用含3% H2O2的甲醇处理20 min以淬灭内源性过氧化物酶活性，然后用PBS清洗。用5% BSA封闭20 min后，切片与一抗(抗Ki67抗体和TUNEL检测试剂盒)在4℃下孵育过夜。切片用PBS洗涤3次。样品与二抗在室温下孵育1 h。图像由全景扫描仪获得。Ki67评估肿瘤组织中细胞增殖水平。采用免疫荧光染色TUNEL检测肿瘤细胞中的凋亡。

7.统计学处理：采用SPSS 27和Graphpad Prism 9.0软件分析。流式细胞术(FACS)数据使用FlowJo V10软件进行分析。符合正态分布的数据用x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，方差齐的多组数据比较使用One-way ANOVA。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.高剂量分割照射下调NK细胞功能：由表 1可见，与对照组相比，RT组脾脏中NK细胞的比例减少(t=7.54，P＜0.05)，NK细胞上表面免疫检查点PD-1、TIGIT的平均荧光强度增加(t=5.65、6.12，P＜0.05)。为了直接验证NK细胞的效应功能，测量了NK细胞表面CD107a+的表达。与对照组相比，RT组脾脏中NK细胞上的CD107a+的比例减少(t= 5.64，P＜0.05)。

表 1 对照组和单纯照射组脾脏NK细胞数量、CD107a+比例及PD-1与TIGIT平均荧光强度(MFI)比较(x±s) Table 1 Comparison of NK cell profiles quantity, CD107a+ percentage, and PD-1/TIGIT MFI in spleen between Ctrl and RT groups(x±s)

2.高剂量分割照射下调肿瘤引流淋巴结内NK细胞功能：由表 2可见，与对照组相比，RT组肿瘤引流淋巴结中NK细胞的比例减少(t= 7.19，P＜0.05)，NK细胞上表面免疫检查点PD-1、TIGIT的平均荧光强度增加(t= 4.16、7.36，P＜0.05)。同时，与对照组相比，RT组肿瘤引流淋巴结中NK细胞上的CD107a+的比例减少(t= 8.99，P＜0.05)。

表 2 对照组和单纯照射组小鼠肿瘤引流淋巴结NK细胞数量、CD107a+比例及PD-1与TIGIT平均荧光强度(MFI)比较(x±s) Table 2 Comparison of NK cell profiles quantity, CD107a+ percentage, and PD-1/TIGIT MFI in dLNs between Ctrl and RT groups mice(x±s)

3.高剂量分割照射下调肿瘤微环境(TME)中NK细胞功能: TME内免疫细胞的状态直接反映了局部抗肿瘤效应功能。由表 3可见，与对照组相比，RT组TME中NK细胞的比例减少(t= 6.79，P＜0.05)，NK细胞上表面免疫检查点PD-1、TIGIT的平均荧光强度增加(t= 5.38、21.13，P＜0.05)。同时，与对照组相比，RT组TME中NK细胞上的CD107a+的比例减少(t= 8.18，P＜0.05)。

表 3 对照组和单纯照射组小鼠肿瘤微环境NK细胞数量、CD107a+比例及PD-1/TIGIT平均荧光强度(MFI)比较(x±s) Table 3 NK cell profiles quantity, CD107a+ percentage, and PD-1/TIGIT MFI in TME between Ctrl and RT groups mice(x±s)

4.高剂量分割照射联合抗TIGIT抗体对肿瘤和NK细胞功能的影响：构建的肺癌小鼠模型中，结合分次照射和抗TIGIT治疗。由表 4可见，照后14 d与RT组比较，RT+αTIGIT组的肿瘤体积和质量显著减少(t=9.12、2.50, P＜0.05)。使用TUNEL和Ki67评估肿瘤细胞的状态，由图 1可见，与RT组比较，RT+αTIGIT组的TUNEL相对表达显著增加(138.1±7.01、216.2±23.99, t= 5.42，P＜0.05)，同时，Ki67相对表达显著降低(0.64±0.05、0.23±0.03, t= 12.10，P＜0.05)。

表 4 对照组、RT组、αTIGIT组、RT+αTIGIT组小鼠第20天肿瘤体积与质量比较(x±s) Table 4 Tumor volume and mass of mice in Ctrl, RT, αTIGIT, and RT+αTIGIT groups at 20 d (x±s)

图 1 照射联合抗TIGIT治疗后肿瘤凋亡、增殖情况  ×20   A.  肿瘤TUNEL免疫荧光染色；B.   Ki67免疫组织化学染色 Figure 1 Effects of radiation combined with anti-TIGIT therapy on tumor apoptosis and proliferation   ×20   A.  TUNEL immunofluorescence staining; B.Ki67  immunohistochemical staining

讨论

放射治疗对免疫系统有双重影响[5]。放疗可以激活免疫系统。研究表明，放疗可释放肿瘤抗原，这些抗原可被免疫系统捕获，从而激活特异性免疫应答，靶向攻击肿瘤细胞[6]。此外，放疗还能增强免疫细胞(如T细胞)在肿瘤微环境中的浸润和杀伤能力[7]。另一方面，放疗也可能对免疫系统产生抑制作用。高剂量辐射可损伤骨髓，导致免疫细胞的生成和功能受损，进而引起血液中白细胞数量的减少及免疫系统的削弱[8]。此外，放疗可能改变免疫调控环境，例如增加调节性T细胞(Treg)的数量，Treg可抑制免疫应答，使肿瘤细胞逃避免疫监视[9]。所以研究人员开始探索调整放疗策略的方法，以最大化其对免疫系统的正向作用，同时尽量减少负面影响。例如，一些研究正在探索低剂量放疗与免疫治疗药物联合使用，以增强患者的免疫应答并改善治疗效果[10]。

NK细胞因其在调节肿瘤免疫应答中的关键作用受到越来越多的关注[11]。然而，放疗后的TME通常含有抑制免疫应答的因素，如免疫抑制细胞和免疫检查点受体，这可能会下调NK细胞的功能。因此，研究放射治疗与免疫治疗的联合已成为重要的治疗策略。

本研究观察了高剂量照射后3个部位的NK细胞数量和功能状态变化。脾脏是B细胞、T细胞和巨噬细胞等多种免疫细胞的中心，这些细胞在脾脏内相互作用，并对全身的免疫挑战做出反应。因此，脾脏中免疫细胞的活性状态可以反映身体对外部威胁的反应。而引流淋巴结(dLNs)在肿瘤微环境中发挥着至关重要的作用。它们是肿瘤与宿主免疫系统相互作用的关键场所之一。dLNs是免疫系统最初识别肿瘤抗原的地方。当肿瘤细胞死亡时释放的抗原通过淋巴系统输送到dLNs，在那里激活NK细胞，启动针对肿瘤的特异性免疫应答。dLNs内免疫细胞的组成和状态可以显著影响TME。同时，TME内免疫细胞的状态直接反映了局部抗肿瘤效应功能。TIGIT是一种表达在各种免疫细胞类型上的免疫检查点受体，包括NK细胞、某些T细胞亚群和NKT细胞。TIGIT通过与其配体(如CD155和CD112)结合，可抑制NK细胞的活化和细胞毒性。PD-1和TIGIT是两个重要的免疫检查点受体，它们在NK细胞上的上调可能抑制NK细胞的抗肿瘤活性。这一结果与先前的研究[11]一致，表明肿瘤微环境中的免疫抑制可能是癌症治疗面临的挑战。因此，寻找恢复或增强NK细胞抗肿瘤活性的方法，如抑制PD-1和TIGIT通路，可能有助于提高癌症治疗的有效性。CD107a(亦称为LAMP-1，溶酶体相关膜蛋白1)是一种表达在NK细胞表面的分子，在NK细胞功能中起关键作用[12]。CD107a广泛用作NK细胞活化和脱颗粒的标志物。当NK细胞识别并攻击靶细胞时，它们释放含有穿孔素和颗粒酶等毒性分子的颗粒，这一过程称为脱颗粒。在脱颗粒过程中，CD107a从NK细胞内部转移到细胞表面[13]。因此，通过测量NK细胞表面CD107a+的表达，可以评估其活化状态和细胞毒性。本研究表明，NK细胞在脾脏、肿瘤引流淋巴结和肿瘤微环境中表现出功能活性下降，同时伴随着免疫检查点受体PD-1和TIGIT的显著上调，表明NK细胞可能处于耗竭状态。

本研究还表明，高剂量照射联合抗TIGIT抗体治疗可显著抑制肿瘤进展并增强NK细胞功能。这一结果强调了免疫治疗在癌症治疗中的潜力，特别是高剂量照射后免疫检查点受体被抑制时。为了在分子水平上验证这一点，使用TUNEL和Ki67评估肿瘤细胞的状态。TUNEL用于通过检测肿瘤细胞中的凋亡事件来评估肿瘤治疗的有效性，表明治疗是否成功诱导了细胞死亡[14]。Ki67是一种与细胞增殖活性相关的核抗原，常用于评估肿瘤组织中细胞增殖水平[15]。通过恢复NK细胞的效应功能，观察到肿瘤细胞凋亡增加和细胞增殖减少，进一步支持了免疫治疗的有效性。

总之，本研究结果表明，高剂量照射可能导致NK细胞功能下调，特别是在脾脏、肿瘤引流淋巴结和肿瘤微环境中。这种下调可能与免疫检查点受体如PD-1和TIGIT的上调有关，这可能抑制NK细胞的抗肿瘤活性。然而，高剂量照射通过联合抗TIGIT抗体治疗，观察到NK细胞功能恢复和肿瘤治疗结果的显著改善。因此，本研究强调了免疫治疗在癌症治疗中的潜在重要性，特别是当免疫检查点受体被抑制时。这种治疗策略可能有助于改善患者对治疗的反应，减轻肿瘤负担，提高生存率，并为未来的治疗方法提供有力支持。然而，仍需要更多研究来深入了解这一机制并确定最佳治疗策略，以实现最佳治疗效果。

利益冲突  无

作者贡献声明  熊利婷负责实验设计及操作、数据分析和论文撰写；李春晓负责实验设计、指导论文撰写；王俊杰指导论文修改

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