放射治疗是头颈部肿瘤的重要疗法，但其通常受限于正常组织最大耐受剂量，且可能导致不可逆的神经认知功能下降和情绪障碍^[1-2]。闪光放疗是一种超高剂量率(≥40 Gy/s)放疗(Flash)，已经成为放射肿瘤学中的一种创新和变革性的策略。临床前研究表明，Flash通过在超短的时间内向治疗靶点提供高剂量的辐照，产生Flash效应，以减少正常组织的不良反应，同时达到与常规放疗相当的肿瘤控制效果^[3-4]，大大拓宽了放疗的治疗窗口。

虽然Flash在临床前研究和临床研究都显示了积极的研究结果，然而产生Flash效应的确切生物学机制尚不完全清楚。即使目前提出来的氧耗竭^[5-6]、免疫^[7]等假说可以在一定程度上解释Flash现象，但是综合起来并没有给出明确的结论。转录组学是揭示复杂生物学通路和性状调控网络分子机制的重要手段。因此，本研究从转录组学角度出发，对比分析常规电子束照射和Flash电子束照射后小鼠放射性脑损伤的转录图谱差异，希望为Flash效应机制研究提供新思路。

1.辐照装置和实验动物：照射装置是由中国工程物理研究院应用电子学研究所和绵阳中玖闪光医疗科技有限公司联合研发的一台9 MeV加速器。电子束脉冲的重复频率由1~250 Hz可调，脉冲宽度为3.5 μs。6~8周龄C57BL/6雌性小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所，动物许可证号：SCXK(甘)2020-0002。小鼠在标准饲养条件下饲养，温度(20±1)℃，湿度70%±10%；12 h光暗循环。所有动物实验均遵循动物伦理学原则，均经中国科学院近代物理研究所动物实验伦理委员会批准[审批号：第2023(006)号]，在该机构指导方针范围内进行。

2.全脑照射：将小鼠按体质量相近原则分为3个组：对照组、常规照射(CONV)组和Flash组，每组12只。其中Flash组(剂量率约230.0 Gy/s)和CONV组(剂量率约1.9 Gy/s)均分别接受15 Gy单次照射。小鼠腹腔注射1%阿弗丁进行麻醉(0.1 mg/20 g体质量)后将其固定，置于石墨的正后方(接触)，照射野为1.5 cm×1.0 cm，同时限制对眼睛、嘴巴和身体其他部位的剂量。

3.苏木精-伊红染色(HE)：照射后第3天取出完整脑组织，4%多聚甲醛固定后依次进行脱水、包埋、切片、脱蜡、水化、HE染色、脱水、封片等步骤，自然晾干，置于显微镜下观察结构形态学变化并拍照。

4.行为学研究：行为学实验均在VisuTrack软件上进行。

(1) 矿场测试(open field test, OF)：每只小鼠被放置在一个开放的竞技场(1 m×1 m)，并允许自由探索5 min。记录运动的总距离、静止时间等。

(2) 新物体识别测试(novel object recognition, NOR)：将两个相同的积木(颜色、形状和大小相同)放置在需要进行测试的平台中，小鼠有5 min的时间熟悉环境。间隔1 h后，用一个新的物体代替一个熟悉的物体，同时，小鼠被送回测试平台进行5 min的进一步探索。计算认知指数(RR)，RR(%)=探索新目标所花费的时间/总探索时间×100%。

(3) 强迫游泳测试(forced swimming, FS)：在直径为15 cm的透明圆柱形容器中注入20℃左右的水，将小鼠置于水深20 cm左右的圆柱形透明容器(泳池)中，进行6 min的“测试游泳”并录像，导出后4 min数据评价“测试游泳”阶段小鼠的攀爬行为和静止不动行为。

(4) Morris水迷宫：将小鼠头朝池壁放入水中，放入位置在东、西、南、北4个起始位置中随机选择，记录小鼠找到水下平台的时间。在训练过程中，如果找到水下平台的时间超过120 s，则引导动物到平台。让动物在平台上停留10 s后将小鼠移开、擦干。每只动物每天训练4次，两次训练间隔60 min，连续训练4 d。第6天进行空间探索实验，最后一次获得性训练结束后将平台撤除，将小鼠由原先平台象限的对侧放入水中。记录动物找到平台的时间及潜伏期和平台穿越次数。

(5) Y迷宫：Y迷宫由透明丙烯酸管制成，臂长32 cm，在单次8 min的试验中测量自发交替。交替被定义为连续进入3个不同的组。各组小鼠自发交替率的计算公式为：交替率(%)=交替成功次数/(总次数-2)× 100%。

5.有参转录组测序：分别于第1周和第10周行为学试验完成后取出小鼠全脑，置于液氮中速冻，-80℃保存。转录组测序由上海欧易生物技术有限公司完成。使用DESeq2 1.22.2软件^[8]进行差异表达分析。P＜0.05和fold change＞2或fold change＜0.5为差异表达基因(DEGs)的阈值。随后，基于超几何分布算法对差异表达基因进行基因本体论(GO)^[9]富集分析，用于筛选显著性富集功能条目。使用GSEA 4.3.3软件^[10]进行基因集富集分析。

6.小鼠体质量监测：第3~10周小鼠体质量变化用体质量增长率表示。增长率(%)=(W_第10周-W_第3周)/W_第3周×100%。

7.统计学处理：采用EXCEL 2016和R 3.2.0软件进行数据分析。计量指标数据经正态性检验符合正态分布，用 x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.Flash与常规照射后短期内小鼠脑组织的病理学改变：图 1显示小鼠脑的不同区域组织形态的差异。其中CONV组的小鼠额叶和颞叶多见胶质细胞反应性增生。此时海马区并没有显示出很明显的差别。除此之外，对照组和Flash组脑组织排列紧密且有序，而CONV组脑组织结构紊乱、疏松，有较多炎性细胞的浸润。这意味着在病理水平，相比Flash组，CONV组表现出更重的炎症。

注：红色箭头表示胶质细胞增生；黄色箭头表示脑组织结构紊乱；蓝色箭头表示炎性细胞浸润 图 1 不同照射方式全脑照射小鼠不同部位脑组织  HE染色 Figure 1 HE staining results of brain tissues in different parts of mice subjected to whole-brain irradiation under different irradiation modalities

2.Flash与常规照射后小鼠行为学、认知及体质量改变

(1) 对小鼠运动功能的影响：照射后第1周，CONV组小鼠的运动明显受到影响，与对照组和Flash组相比，CONV组总路程显著减少(t=5.51、2.38，P < 0.05)。与对照组相比，CONV组静止时间显著增加(t=3.60，P < 0.05)，与Flash组相比差异无统计学意义(P>0.05，表 1)。照射后第3和10周，3组之间的运动指标差异无统计学意义(P>0.05)。

表 1(Table 1)

表 1 不同照射组第1周旷场实验小鼠的运动总路程和静止时间(x±s) Table 1 Total distance traveled and immobility time of mice in different irradiation groups in the open field test at week 1 (x±s) 组别 只数 总路程(mm) 静止时间(s) 对照组 8 18 855.50±1 615.30 84.12±8.04 CONV组 8 12 303.25±2 633.67a 124.49±28.62a Flash组 8 16 824.14±3 675.72b 96.96±29.28 注：a与对照组比较，t=5.51、3.60，P < 0.05；b与CONV组比较，t=2.38，P < 0.05

表 1 不同照射组第1周旷场实验小鼠的运动总路程和静止时间(x±s) Table 1 Total distance traveled and immobility time of mice in different irradiation groups in the open field test at week 1 (x±s)

(2) 对小鼠认知功能的影响：照射后第1周，CONV组相较于对照组认知指数显著降低(t=2.34，P < 0.05)，而与Flash组差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组和Flash组相比，CONV组认知能力在照射后第3周(t=3.56、3.35，P < 0.05)和第10周(t_Flash=2.36，P=0.06；t_对照组=4.53，P < 0.05)仍然最差(表 2)。

表 2(Table 2)

表 2 不同照射组之间小鼠的认知指数变化(%，x±s) Table 2 Changes in cognitive indices of mice in different irradiation groups (%, x±s) 组别 第1周 第3周 第10周 对照组 77.30±21.17 82.69±19.94 67.22±7.52 CONV组 49.40±18.38a 45.87±11.75a 31.43±11.43a Flash组 57.45±21.84 75.76±16.09b 52.16±11.59 注：第1、3、10周各组小鼠分别为8、5、5只。a与对照组比较，t=2.34、3.56、4.53，P < 0.05；b与CONV组比较，t=3.35，P < 0.05

表 2 不同照射组之间小鼠的认知指数变化(%，x±s) Table 2 Changes in cognitive indices of mice in different irradiation groups (%, x±s)

(3) 对小鼠抑郁程度的影响：照射后第3周，对照组、CONV组和Flash组漂浮时间分别为(57.06±27.39)、(98.43±32.30)和(64.45±13.29)s。与对照组和Flash组相比，CONV组的小鼠展现出明显的抑郁现象，漂浮时间最长(t=2.51、2.39，P < 0.05)。

(4) 对小鼠空间记忆的影响：照射后第3周，排除小鼠个体差异后进行了为期4 d的定位巡航训练，在训练第2天，对照组、CONV组和Flash组到达站台的潜伏期分别为(23.75±7.65)、(39.16± 13.25)和(29.31±8.46)s。CONV组到达站台的潜伏期最长，与对照组差异有统计学意义(t=2.85，P < 0.05)，与Flash组差异无统计学意义(P>0.05)。训练结束后1 d的空间探索实验显示，对照组、CONV组和Flash组访问站台次数分别为4.3±1.9、2.1±1.8、3.0±2.6。CONV组最少，与对照组差异有统计学意义(t=2.29，P < 0.05)，但与Flash组差异无统计学意义(P＞0.05)。照后第10周时由于小鼠的状态不佳，采用Y迷宫来评估空间记忆能力，3组间结果差异无统计学意义(P>0.05)。

(5) 小鼠体质量变化：计算第3~10周小鼠体质量的增长率，发现CONV组小鼠体重增长率为负，与对照组和Flash组比较差异有统计学意义(t= 5.26、3.42，P < 0.05)。

3.Flash和常规照射后转录水平的功能差异：取第1和10周的小鼠全脑进行转录组测序分析，对Flash组和CONV组脑组织差异性表达的mRNAs，从生物过程、细胞成分和分子功能3个层次进行GO富集分析，结果显示第1周Flash组与CONV组的差异基因涉及多种功能，如发生上调的生物过程中对Ⅱ型干扰素的细胞反应、免疫系统进程等；细胞组分中的各种蛋白复合体等；分子功能中双链RNA腺苷脱氨酶活性等，以及发生下调的生物过程中的原子离子的跨膜转运等；细胞成分中的海马CA3突触的苔藓纤维等；分子功能中的神经肽激素活性、抑制性细胞外配体等(图 2)。

图 2 Flash与常规剂量率照射后差异基因功能富集条目 Figure 2 Functional enrichment entries of differentially expressed genes after Flash and conventional dose rate irradiation

4.Flash照射后机体的代谢变化：GSEA基因集富集分析发现，Flash照射后激活多种代谢相关信号通路，图 3展示了这些信号通路的名称、富集程度及该信号通路在不同照射组中的上、下调情况。结果显示，Flash辐照后丝氨酸内肽酶活性、谷胱甘肽转移酶活性显著升高，组氨酸代谢、嘧啶代谢、鞘脂类代谢及谷胱甘肽代谢等代谢途径在Flash组显著上调。

注：ES.enrichment score，富集分数，反映基因集在基因表达数据中富集程度的统计量；NES.normalized enrichment score，标准化富集得分，将富集得分标准化后的值，使不同基因集的富集得分可比较 图 3 Flash与常规剂量率照射后差异基因的代谢相关通路GSEA富集分析 Figure 3 Gene set enrichment analysis (GSEA) of metabolic pathways of differentially expressed genes after Flash and conventional dose rate irradiation

5.Flash照射与常规照射影响成纤维细胞生长因子变化：基于Reactome数据库进行GSEA基因集富集分析，结果显示，内源性配体对TLR的调控这个条目富集分数最大，此外有多个条目富集到成纤维生长因子受体(FGFR)家族相关通路。表 3展示了NES较大的前5条富集条目。这些条目富集的核心基因主要为Fgf20、Fgf17、Fgf6等。

表 3(Table 3)

表 3 Flash与常规剂量率照射后差异基因基于Reactome数据库的GSEA基因集富集结果 Table 3 Reactome-based GSEA results of differentially expressed genes after Flash and conventional dose rate irradiation 条目 富集分数(NES) P值 核心基因 内源性配体对Toll样受体(TLR)的调控 1.78 0.002 S100a8, Fga, Fgg, Tlr6, Fgb, Tlr2, Cd14, S100a9 磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3K)级联：成纤维生长因子受体(FGFR)2 1.59 0.020 Fgf20, Fgf17, Fgf6, Fgf8, Fgf4, Fgf2 胰岛素受体底物(IRS)介导的信号 1.59 0.014 Fgf20, Fgf17, Tlr9, Fgfr4, Fgf6, Fgf8, Fgf4, Fgf2 PI-3K级联：FGFR3 1.59 0.025 Fgf20, Fgf17, Fgf8, Fgf4, Fgf2 磷脂酶c介导的级联反应：FGFR4 1.59 0.028 Fgf20, Fgf17, Fgfr4, Fgf6, Fgf8, Fgf4, Fgf2

表 3 Flash与常规剂量率照射后差异基因基于Reactome数据库的GSEA基因集富集结果 Table 3 Reactome-based GSEA results of differentially expressed genes after Flash and conventional dose rate irradiation

放射性脑损伤是肿瘤患者接受头颈部放射治疗后发生的严重神经系统并发症，严重影响患者的生存质量。而Flash辐照因其可减少正常组织的放射性损伤而备受关注。然而Flash效应的机制并不清楚。本研究从转录组水平发现Flash和常规照射后免疫水平的差异变化，尤其是Flash组上调对Ⅱ型干扰素的细胞反应，而干扰素可维持机体的免疫监视、免疫保护和免疫自我稳定等功能，推测Flash对免疫系统产生保护作用而降低对正常组织的损伤，这与Jin等^[11]和伍丽君等^[12]的研究一致。

代谢相关通路在CONV组和Flash组发生了显著的变化，如氨酸内肽酶活性、组氨酸代谢、嘧啶代谢、鞘脂类代谢及谷胱甘肽代谢等代谢途径在Flash组显著上调。已有研究表明，体内丝氨酸蛋白酶抑制作用可显著抑制全身性炎症^[13]。组氨酸作为人体肌肉和大脑部分肌肽的前体，而肌肽可作为缓冲剂和抗氧化剂发挥重要作用^[14]。除此之外，过量的组氨酸在皮肤中起着重要的保护作用，能通过脂肪细胞的NF-κB通路，抑制促炎性细胞因子表达，与炎症反应和氧化应激呈负相关^[15]。Liu等^[16]发现活跃的嘧啶代谢与更高的再生能力相关。鞘脂类常见于神经系统，参与神经发生和突触发生，维持大脑功能，其中神经节苷脂是一种糖基部分含有唾液酸的鞘糖脂，在中枢神经系统中含量丰富，与细胞信号传导和神经保护有关^[17]。谷胱甘肽(GSH)一直是科学界日益关注的焦点，它通过参与人体和其他生物体的细胞氧化还原反应提供抗氧化防御。它还具有增强代谢解毒和调节免疫系统的功能^[18]。总而言之，这些代谢途径的上调与神经保护相关，为大脑提供了抗氧化防御，这也进一步说明机体代谢，尤其是氨基酸和核苷代谢增强可能是Flash保护效应的潜在机制之一。

基于Reactome数据库的GSEA基因集富集结果显示，内源性配体对TLR的调控这个条目富集分数最大，内源性配体的存在提示TLRs不仅可诱导机体防御性的抗微生物免疫反应，同时还是机体损伤后启动组织再生修复的敏感监测系统^[19]。此外有多个条目富集到FGFR家族相关通路。在哺乳动物中，FGF家族包括23种多肽，它们调节多种细胞的迁移、增殖、存活、代谢活动和神经功能。研究发现，Fgf20是一种新型神经营养因子，不仅在退行性神经系统疾病，还在组织修复、器官发育等方面具有重要的生物学功能^[20-21]。FGF能够保护神经元免受损伤，促进神经再生和功能恢复，为神经系统疾病的治疗提供了新的策略。因此，Flash照射可能通过上调FGFR家族相关通路基因发挥Flash效应。然而本研究的不足之处在于没有进一步实验验证，下一步工作将研究具体哪些代谢通路和FGF(s)在Flash效应中发挥主要作用。

综上所述，Flash组上调的氨基酸和核苷代谢相关通路及成纤维细胞生长因子相关通路均与炎症反应和神经功能保护相关。因此，Flash效应机制不应局限于氧耗竭或免疫假说，还应考虑氨基酸或核苷代谢及成纤维生长因子家族等在Flash效应中的作用，为Flash效应机制研究提供新思路。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  高菲妃负责实验操作和论文撰写；马言熙、张佳豪、程伟、俞博毅参与实验操作和数据分析；王建新、刘贤洪提供实验平台，参与实验操作；金晓东、陈卫强、李强参与实验方案设计及指导论文修改