2025, Vol. 45
2. 广东省职业病防治院放射卫生防护所，广州 510300
2. Institute of Radiation Hygiene and Protection, Guangdong Province Hospital for Occupational Disease Prevention and Treatment, Guangzhou 510300, China
随着全球核能与辐射技术在能源、医疗、工业和农业等领域的广泛应用，接触低剂量电离辐射(low dose ionizing radiation，LDIR)的人群越来越多。根据联合国原子辐射效应科学委员会(United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation，UNSCEAR)报告，LDIR是指低于100 mGy剂量的辐射或剂量率低于0.1 mGy/min的外部X射线和γ射线[1]。天然高本底辐射地区(high background radiation area，HBRA)由于地表层含有高浓度的铀、钍，地表γ射线剂量高于一般地区[2]。流行病学研究表明，HBRA居民所接受的内外照射年吸收有效剂量约为正常辐射水平地区的3倍[3]，为LDIR对人类健康效应研究提供了良好的场所。
内源与外源刺激的反应可诱发衰老，导致细胞功能障碍，进而引起生理功能失调[4]。线粒体自噬是维持细胞稳态的关键，在衰老过程中起重要作用[5]。目前，关于LDIR衰老效应研究较少且证据有限。高通量测序技术作为关键转录组学分析工具，被广泛应用于电离辐射生物学效应机制的体内和体外实验研究。目前电离辐射生物学效应转录组学研究主要集中于细胞与动物研究，关于我国长期居住于HBRA人群的外周血转录组学分析研究甚少。
基于此，本研究以HBRA居民作为调查对象，采用高通量测序技术分析HBRA与对照地区居民外周血mRNA差异表达及相关生物学过程与通路，探讨HBRA居民差异表达基因和其富集生物学过程及通路。
资料与方法1.调查对象：2023年7月至9月，采用二阶段抽样方法，随机抽取HBRA(HBRA组)与恩平地区(对照组)健康居民各7名。纳入标准：出生于本地并居住30年以上；外出或异地居住不超过1年；无肿瘤史或肿瘤家族史；无重大疾病。最终纳入调查对象共14名。本研究经广东省职业病防治院医学伦理委员会(审批号：GDHOD MEC 2021 035)审核通过，并获得调查对象知情同意。
2.环境空气吸收剂量率监测：使用环境γ剂量率仪，根据《环境地表γ辐射剂量率测定规范》(GB/T 14583-1993)[6]进行测量。依据网格式测量方法分别对两组居民房屋及室外进行测量，测量点位上的γ辐射空气吸收剂量率的瞬时值，每个点测量至少3个数据后取平均值，测量高度距地面1.0 m。
3.外照射个人累积剂量估算：根据两组居民居住的室内、室外、公共场所和田野的环境γ外照射水平，按UNSCEAR报告所推荐的模式，结合文献[7]，采用公式(1)估算调查对象的年有效剂量，根据调查对象的年龄、性别、前居房屋剂量、现住房屋剂量、卧室及室内室外停留时间等分别计算各年龄段平均年有效剂量，累计相加计算外照射个人累积剂量。
| $\;\;\;\; \begin{aligned} & H_{\text {E. age }}=\left[f_1\left(K_1-2.59\right)+f_2\left(K_2-2.59\right)+\right. \\ & \left.f_3\left(K_3-2.88\right)\right] \times \theta_{\text {age }} \times 365 / 1000+23.2 \end{aligned} $ | (1) |
式中，HE.age为该年龄段的年有效剂量，10-5 Gy/年；K1为住户床上的自由空气比释动能平均值，10-8 Gy/h；K2为住户室内自由空气比释动能平均值，10-8 Gy/h；K3为住户室外自由空气比释动能平均值，取公共场所与田野的平均值，10-8 Gy/h；f1、f2、f3分别为卧室、室内和室外的停留时间，与年龄、性别有关，h；θage为由γ射线引起的空气比释动能估算人员有效剂量的转换系数，与年龄有关。
4.血样采集：抽取调查对象外周静脉血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，分装好的血液样本保存于干冰中，用于提取RNA进行测序。
5.总RNA提取、文库构建及RNA测序：按照TRIzol总RNA提取试剂(美国Invitrogen公司)说明书提取全血总RNA，并使用NanoDrop ND-1000(美国Thermo Fisher公司)检测吸光度(A)值，通过A260/280和A260/230确定RNA纯度，使用琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测。总RNA使用RiboZero Magnetic Gold Kit(美国Illumina公司)进行rRNA去除处理。处理后产物RNA用KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kit(瑞士Roche公司)构建文库，主要流程包括：①片段化rRNA去除处理后的RNA产物。②反转录生成第一链cDNA。③dUTP加入合成双链cDNA。④各聚合酶作用对双链cDNA进行末端修复并加A。⑤连接酶连接Illumina特异性接头。⑥PCR扩增纯化得到最终的RNA测序文库。不同样品的混合测序文库，通过0.1 mol/L NaOH(广州化学试剂厂)变性生成单链DNA，稀释成8 pmol/L后，在NovaSeq 6000 S4 Reagent Kit(美国Illumina公司)(300个循环)上进行原位扩增，生成的片段末端使用Illumina NovaSeq 6000测序仪(美国Illumina公司)测序150个循环。
6.生物信息学分析：采用R 3.5.0软件Ballgown进行基因水平的Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments (FPKM)计算，对两组中FPKM均值超过0.5的基因进行统计分析。按照基因表达倍数变化(fold change，FC)阈值为1.2筛选差异表达基因。采用R 3.5.0软件对差异表达的mRNA进行聚类分析、基因本体论(gene ontology，GO)- 生物学过程(biological process，BP)分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析等，并进行可视化绘图；采用GSEA 2.2.4软件进行基因富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)分析，根据校正富集分数(NES)和NOM P值对富集结果进行筛选。
7.统计学处理：采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布，数据以 x±s表示，两组间差异比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的数据使用中位数(M)和第25、75百分位数(Q1，Q3)描述，两组间差异比较采用Mann-Whitney U检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1.基本情况：选取HBRA居民7名，其中男性6名，女性1名，年龄M(Q1，Q3)为46(33，53)岁；对照地区居民7名，其中男性5名，女性2名，年龄M(Q1，Q3)为44(38，60)岁。两组居民的性别分布和年龄差异均无统计学意义(P > 0.05)。
2.两地区居民外照射个人累积剂量：HBRA和对照地区居民外照射个人累积剂量分别为(99.59±20.07)和(33.82±10.61)mSv，HBRA外照射个人累积剂量约为对照地区的2.9倍，差异具有统计学意义(t = -5.88，P = 0.001)。
3.两地区居民外周血差异表达基因分析：与对照组相比，HBRA组血共有1 224个差异表达基因，其中上调275个，下调949个。结合Aging Atlas数据库中的人类衰老基因[8]，差异表达基因中包含32个衰老相关基因，均在人类衰老过程中起着重要作用，包括MAPK9、CBX7、ATF2、ATG13和ULK1等基因。其中MAPK9、CBX7和ATF2参与衰老过程中的细胞周期、细胞凋亡和促炎因子水平调节，ATG13和ULK1不仅与细胞周期密切相关，同时也参与线粒体自噬过程，在肿瘤进展中起着重要作用，见图 1。
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注：横坐标中，1~7分别为HBRA组1~7；8~14分别为对照组8~14 图 1 两组居民衰老相关基因差异表达聚类热图 Figure 1 Cluster heatmap showing the differential expression of aging-related genes between two groups |
4.两组居民差异表达基因GO-BP分析：结果显示，与对照组相比，HBRA组外周血差异表达基因生物学过程主要富集于细胞信号调节、细胞生物合成过程、细胞定位、细胞周期和细胞应激等，见图 2。
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图 2 与对照组相比HBRA组外周血差异表达基因GO-BP分析富集图 A. 上调；B. 下调 Figure 2 Enrichment map from the GO-BP analysis of differentially expressed genes in the peripheral blood of HBRA residents compared with the control area A. Up-regulated genes; B. Down-regulated genes |
5.两组居民外周血差异表达基因KEGG分析：结果显示，与对照组相比，HBRA组差异表达基因信号通路主要富集于趋化因子信号通路、MAPK信号通路、细胞周期、自噬和线粒体自噬，见图 3。
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图 3 与对照组相比HBRA组外周血差异表达基因KEGG分析富集图 A. 上调；B. 下调 Figure 3 Enrichment maps from the KEGG analysis of differentially expressed genes in the peripheral blood of HBRA residents compared with the control area A. Up-regulated genes; B. Down-regulated genes |
6.HBRA组差异表达基因GSEA分析：结果显示，与对照组居民相比，HBRA组外周血差异表达基因主要富集于细胞周期和线粒体相关基因，见图 4。
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图 4 HBRA居民外周血差异表达基因GSEA-分析富集分数图 A.线粒体基因；B. KEGG-细胞周期；C.细胞周期G2期通路 Figure 4 Enrichment score plots from the GSEA analysis of differentially expressed genes in the peripheral blood of HBRA residents A. Mitochondrial genes; B. KEGG cell cycle pathway; C. Pathway of the G2 phase of cell cycle |
讨论
本研究选择的HBRA居民与对照地区居民之间的人口结构、膳食构成及生活习惯等具有良好的类同性[9]，且本研究中的调查对象的年龄和性别之间差异均无统计学意义，提示两组别居民具有代表性和可比性。本研究结果表明，HBRA居民外照射个人累积剂量约为对照地区的2.9倍，与以往研究结果相似[10]。提示HBRA居民可作为LDIR长期健康效应研究的天然人群模型。
高通量测序结果显示，与对照地区相比，HBRA居民具有1 224个差异表达基因，其中包括32个衰老基因，如MAPK9、CBX7、ATF2、ATG13和ULK1等。衰老基因的表达在衰老通路中起着重要作用，如MAPK9可调控细胞周期促进细胞增殖和迁移[11]；ULK1与ATG13不仅与细胞周期密切相关，在线粒体自噬中也起着重要作用[12]。提示长期接触LDIR可能诱导衰老基因的差异表达，从而影响衰老通路的改变。Fang等[13]采集人外周血进行50 mGy辐照后，转录组学分析结果发现LDIR诱导外周血差异表达基因876个，本研究结果与其相似。提示长期接触LDIR可对HBRA居民外周血转录组水平产生影响。Resnick-Silverman等[14]采用2 Gy单次剂量辐照C57/BL6小鼠后，脾脏组织差异基因为3 132个。本研究与该研究差异表达基因及数目差异的原因可能与暴露剂量、研究对象种属和组织类型等不同有关。
GO分析结果显示，差异表达基因生物过程主要富集于细胞信号调节、细胞生物合成过程、细胞定位、细胞周期和细胞应激等。Aliper等[15]给予人成纤维细胞50 mGy的X射线辐照后6 h进行转录组学分析，GO分析表明差异表达基因的生物学过程主要富集于细胞周期停滞、凋亡信号和程序性细胞死亡。本研究结果与其部分一致，原因可能在于单次LDIR与长期LDIR的生物学效应差异。电离辐射可通过影响细胞周期从而影响细胞衰老过程[16]。Bouten等[17]采用10 Gy(1.15 Gy/min)X射线辐照原代人肺微血管内皮细胞后进行mRNA测序，GO分析显示，DNA损伤反应等生物学过程具有显著差异。本研究与其不一致的原因在于，他们采用单次高剂量辐照原代细胞，细胞种类、细胞培养条件和辐照参数设置均为影响转录组学分析结果的重要因素，而本研究的调查对象为长期接触LDIR的HBRA居民，研究对象种属和样本来源均不同，长期LDIR与单次高剂量辐射的生物学效应具有一定差异。提示长期接触LDIR可能引起细胞周期、细胞信号调控及应激等生物学过程改变。
KEGG分析结果显示，差异表达基因主要富集于趋化因子信号通路、MAPK信号通路、细胞周期、自噬和线粒体自噬。其中趋化因子参与细胞生长、迁移与凋亡过程[18]。Song等[19]发现给予0.6和1.8 Gy剂量对BALB/c小鼠胸部辐射可促进趋化因子水平升高。Yang等[20]采用4 Gy剂量辐照人胰腺癌细胞与非小细胞肺癌细胞，发现电离辐射可诱导线粒体自噬的发生。张灵钰等[21]分别采用0、50、100和200 mGy剂量辐照人支气管上皮HBE细胞7次后48 h诱导细胞衰老，并进行转录组学分析，KEGG分析结果显示，与对照组相比，各剂量组差异表达基因的信号通路均富集于细胞周期等，本研究结果与其相似。提示长期接触LDIR人群以及分次LDIR细胞，均可对细胞周期信号通路产生影响。Fang等[13]给予5名男性和4名女性外周血50和150 mGy剂量辐照后进行KEGG分析，结果表明，差异表达基因主要富集于抗原加工和呈递、细胞因子介导的信号通路和信号转导通路。本研究与其不一致的原因可能是Fang等[13]采用未受辐照人群的外周血进行单次LDIR，而本研究选取长期接触LDIR的HBRA居民外周血，两者接触LDIR的时间、接受辐照的来源与方式不同，以及调查对象性别和年龄构成存在差异。
越来越多的证据表明，线粒体功能与细胞衰老密切相关[22]。LDIR可引起线粒体形态改变和线粒体自噬功能障碍[23]。但有研究表明，LDIR可通过诱导线粒体自噬来调节细胞内稳态[24]。目前关于LDIR影响线粒体功能的研究尚无一致结论。结合本研究GSEA分析，长期接触LDIR可引起细胞周期、线粒体相关基因的改变，提示MAPK信号通路、细胞周期调控、线粒体功能和线粒体自噬可能在长期接触LDIR诱导衰老相关通路改变中起着重要作用。
本研究首先选取HBRA居民作为长期接触LDIR的调查对象，估算HBRA居民外照射个人累积剂量，为长期接触LDIR的远期效应提供可靠依据；进一步采用高通量测序方法，在转录组水平上分析长期接触LDIR居民外周血差异表达mRNA，为长期接触LDIR健康效应的组学研究和衰老生物学效应研究提供重要参考依据。后续将从细胞分子层面深入探讨线粒体自噬在LDIR诱导衰老效应中的复杂机制，同时，基于本研究结果，开展多中心的大样本人群研究，全面系统阐述长期接触LDIR的衰老效应及作用机制。
综上所述，本研究通过高通量测序分析发现阳江HBRA居民外周血存在差异表达mRNA。差异表达mRNA相关生物学过程和通路与细胞周期、趋化因子信号通路、MAPK信号通路和线粒体自噬等有关。
利益冲突 无
作者贡献声明 李慧娴负责数据收集整理及分析、论文撰写与修改；陈慧峰负责数据收集与管理、论文修订与审核、技术支持；黄伟旭、陈冠友、张敏协助实验、分析数据以及文献资料调研与整理；李道传负责结果分析讨论与论文修订；邹剑明负责提出研究选题、数据审查、数据分析与结果讨论、修订论文
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