放射性损伤(radiation-induced injury, RI)是指机体在超出其所能耐受剂量的高能电磁辐射及粒子的作用下所发生的损伤，作为放射治疗的常见并发症，严重影响患者的生存时间和治疗疗效^[1]。根据症状出现的时间，放射性损伤可分为急性损伤和慢性损伤，主要损伤部位包括脑、心血管、肺、肠道、皮肤和造血系统等。不同类型的放射性物质和不同的辐射剂量会对机体产生不同程度的损伤，因此，了解放射性损伤的发病机制，及其对机体的影响至关重要。

传统的高通量RNA测序虽然已被用于生物学研究中的多个领域，但通常混合了成千上万个细胞的RNA，掩盖了单个细胞之间的差异，不能体现细胞间的异质性。单细胞转录组测序(single cell RNA sequencing, scRNA-seq)能够捕捉到单个细胞上的基因表达信息，弥补了在传统测序中无法观察到的细胞异质性和稀有细胞类型，为放射性损伤的细胞和分子机制研究提供了一个全新的视角，并能够深入了解放射性损伤对机体组织的影响，更好地探究细胞之间的相互作用和调控作用。本文对scRNA-seq在放射性损伤研究中的应用进展进行综述。

scRNA-seq技术是一种在单细胞水平对mRNA进行全转录组扩增和高通量测序分析的技术，其主要包括单细胞分离和捕获、核酸提取和反转录、文库构建、高通量测序和数据分析等5个步骤^[2]。单细胞分离和捕获是从组织中捕获高质量的单个细胞的过程，从而提取精确的遗传和生化信息，促进独特的遗传和分子机制研究。通过连续稀释法、荧光激活细胞分选、显微操作法、激光捕获显微切割、微流控技术或市场上成熟的商业平台如10×Genomics的Chromium系统(液滴法)和BD公司的Rhapsody(微孔法)来实现^[3]。从分离的单细胞中提取RNA，将mRNA分子转换成互补的DNA(cDNA)，同时引入特异性分子标签对细胞内的每个mRNA分子进行条形码编码，从而提高数据的定量准确性，最后通过特定的文库构建流程将其扩增和标记化，以便后续的高通量测序和数据分析^[4]。一般来说，scRNA-seq技术分析方法主要有：差异表达基因(DEG)分析、基因本体(GO)富集分析、京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析及GSEA分析等方法研究细胞的功能富集；伪时间轨迹分析推测细胞的发育轨迹；主成分分析(PCA)或t-分布随机邻域嵌入(t-SNE)等方法降低数据的维度；聚类算法将具有相似表达模式的细胞分为相同或不同的亚群；高级分析常包括细胞间通讯分析、转录因子活性预测、代谢通路分析等^[5]。

1. 脑损伤：放射性脑损伤(radiation-induced brain injury, RIBI)主要表现为脑组织水肿、坏死、颅内压增高、脑白质脱髓鞘、认知功能障碍等，脑放射性坏死的发生率为14%~15%^[6-7]。Shi等^[8]通过10 × Genomics scRNA-seq对2例鼻咽癌放射治疗后RIBI患者的脑组织进行测序，发现RIBI患者脑实质中CD8+ T细胞的密度和比例与RIBI患者的病变大小呈正相关，小胶质细胞(microglia, MG)通过趋化因子CCL2/CCL8趋动外周CD8+ T细胞浸润，加重了放射性和缺血性脑损伤，提示阻断这种趋化作用可以阻止表达带有CCR2和CCR5的CD8+ T细胞的浸润。此外，该团队在另一项研究中分析了4名RIBI患者脑病变中3934个CD4+ T细胞，发现6个不同的亚群，验证了CD4+ T细胞在RIBI中浸润，并在RIBI的周围和病变中发现一个CD4+ CTL亚群在中枢神经系统中克隆扩增，呈现出终末分化状态，其中细胞毒性相关基因NKG7、GZMH、GNLY、FGFBP2和GZMB在CD4+ CTL中高表达^[9]。研究结果揭示CD4+ CTL可能作为RIBI发病机制中的潜在生物标志物或治疗靶点，应用scRNA-seq有助于理解细胞功能和分子机制，确定克隆扩增的CD4+ CTL亚群可能与RIBI的发生发展有关。但由于CD4+ CTL亚群在脑中代表相对较小的细胞群体，且研究的样本量相对较小，结论需要在更大的样本队列中进行验证。Osman等^[10]对辐射后的幼年小鼠海马体中的MG进行scRNA-seq发现辐射触发MG发生短暂激活，但一周内就恢复至正常，并上调与促炎性和抗炎性MG表型相关的转录本；同时发现幼鼠和成年鼠的MG在辐射早期阶段就表现出不同的转录特征，MG参与了辐射反应的初始阶段，但不一定是导致青少年大脑长期炎症的原因。scRNA-seq能够识别不同转录状态的MG亚群，揭示MG在辐射后的异质性反应，以及追踪MG转录组的动态变化和随时间变化的基因表达模式，进而了解MG在辐射后的激活和恢复过程。

2. 心血管损伤：放射性心脏损伤(radiation-induced heart disease, RIHD)是胸部肿瘤放疗患者非癌性死亡的主要原因之一，能引起心脏的一系列改变，包括心包疾病、瓣膜功能不全、心肌损伤、冠脉疾病和传导系统异常等^[11-13]。scRNA-seq有助于了解心脏巨噬细胞在不同时间点的功能特征，Cao等^[14]对心脏组织中的免疫细胞进行scRNA-seq，鉴定7个巨噬细胞簇，发现两种阶段特异性巨噬细胞即衰老相关巨噬细胞和干扰素相关巨噬细胞，前者在第7天表现为炎症性衰老表型，趋化性和炎症因子表达增强，而后者在第35天则表现为吞噬增强，炎症减轻。Mo等^[15]通过建立RIHD小鼠模型，对辐照后的心脏细胞悬液进行scRNA-seq，发现在RIHD的不同阶段(急性损伤期、代偿期和失代偿期)参与的细胞亚群有30个且表现出不同的分布和功能，表明RIHD是一个动态的过程，此外，scRNA-seq分析发现CXCR2在心脏驻留巨噬细胞(cMAS)亚群中显著表达，并且心脏成纤维细胞分泌的CXCL1主要与CXCR2和cMAS结合，共同参与心脏纤维化相关的细胞外基质(ECM)的形成，加重RIHD。研究结果为RIHD的治疗提供新的视角，即针对CXCL1-CXCR2轴的干预可能有助于缓解心脏纤维化，从而改善RIHD患者的预后。Benadjaoud等^[16]利用流式细胞术、scRNA-seq和伪时间轨迹分析，分析不同辐射剂量和时间点的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，发现辐射诱导的内皮细胞衰老和衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)具有非细胞自主效应，内皮细胞可以通过旁分泌效应影响其他细胞类型的衰老表型，同时识别出IL-1信号通路可作为辐射诱导的内皮细胞过早衰老的关键参与者，并参与了内皮-间质转化(EndMT)过程。将组织样品进行有效地单细胞分离是完成scRNA-seq的重要前提条件，但由于心脏的细胞组成是复杂的，且不同细胞类型在尺寸外观方面差异巨大，因此单细胞的高效分离、细胞捕获效率、RNA完整性等都会显著影响数据的准确性和可靠性。

3. 肺损伤：放射性肺损伤(radiation-induced lung injury, RILI)是胸部恶性肿瘤放射治疗常见的并发症，包括急性放射性肺炎(RP)和慢性放射性肺纤维化(RPF)^[17]，其中RP发生在放疗后1-3个月，而RPF则发生在放疗后数月甚至数年^[18]。scRNA-seq可以同时分析多种细胞类型，生成全面的单细胞转录组图谱，有助于系统地了解细胞群体的组成和功能变化，Ma等^[19]通过scRNA-seq建立小鼠急性期RILI肺组织单细胞转录组图谱，生成18 500个单细胞转录组，发现免疫细胞比基质细胞具有更高的放射敏感性，说明不同类型的细胞放射敏感性存在差异。RILI后肺内多种细胞群体出现动态变化，Currs-Alonso等^[20]利用scRNA-seq发现AT2细胞向AT1细胞转分化，成纤维细胞和肌成纤维细胞在ECM沉积中的作用增强，以及巨噬细胞亚群表现出促炎或促纤维化的极化状态，因此通过分析细胞从一种状态过渡到另一种状态的基因表达变化，scRNA-seq可以推断细胞的发展轨迹和命运，此外，内皮细胞发生了与EndMT相关的显著转录组变化，且不同细胞群体间的通讯在辐射后出现增强。在RILI后细胞亚群的比例也会出现明显变化，Shi等^[21]研究发现中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞在辐射后均表现出明显的亚群差异，并发挥了潜在的促炎效应，平滑肌细胞则显示出ECM沉积的高度倾向性，表明平滑肌细胞在修复过程中可能通过增加ECM的产生来支持肺组织的重建和结构恢复，因此，利用scRNA-seq可以识别出即使是同一类型细胞中的不同亚群，这些亚群在基因表达、功能和行为上可能存在显著差异。肺纤维化是RILI的晚期并发症，有研究表明B细胞和T细胞共同参与了肺纤维化^[22]。Sun等^[23]对RPF组中的B细胞和T细胞进行DEG分析，发现这两种细胞的丰度变化最为显著，通过比较scRNA-seq的结果，筛选出表达水平存在差异的细胞因子，其中细胞因子CCL5、ICAM1、PF4和TNF-α变化明显改变。这些细胞因子不仅是细胞间通信的重要媒介，而且可能直接参与到RPF的损伤修复过程中。一项研究表明，Fcn1、Spp1和Fabp4在特发性肺纤维化的单核细胞源性、促纤维化和正常肺泡巨噬细胞群中表达增强^[24]。Yang等^[25]对辐照后小鼠右肺和外周血单核细胞的未分选细胞进行scRNA-seq，鉴定出7种肺上皮细胞类型，发现辐照后Ⅱ型肺泡细胞和Club细胞数量均减少，肺泡巨噬细胞(特别是Fabp4low和Spp1high亚群)扩增，而Fabp4high巨噬细胞亚群则几乎耗尽，值得一提的是Fcn1⁺巨噬细胞在对照组和辐照组中几乎没有被发现，这表明所有观察到的巨噬细胞都不是单核细胞衍生的，而是组织驻留的肺泡巨噬细胞群。在RILI中，部分低丰度细胞类型如NK细胞、树突状细胞等，scRNA-seq对其捕获率较低，可能难以获得足够的测序深度来准确反映其基因表达情况，导致特定细胞类型的表达信息缺失。

4. 肠损伤：放射性肠损伤(radiation-induced intestinal injury, RIII)是腹盆部肿瘤放射治疗的常见并发症，包括小肠损伤和结直肠损伤，其中放射性直肠损伤最常见^[26]。为研究RIII相关肠道微环境的动态变化过程，Lu等^[27]利用scRNA-seq对辐射后不同时间点的肠道组织进行分析，描绘肠道微环境的动态景观，发现肠道干细胞、免疫细胞、杯状细胞表现出不同水平的放射敏感性，而内皮细胞和基质细胞对放射不敏感。Qu等^[28]构建出具有辐射损伤再生特征的新型小肠类器官，通过scRNA-seq分析“增生态”小肠类器官中的细胞异质性，研究结果显示，在这些细胞群体中，肠道干细胞群和修复型干细胞群显著增多，进一步分析发现，表观遗传调控小分子VPA和EPZ6438可协同促进肠道损伤后的再生反应，小分子联合处理能够提升YAP下游靶基因的表达水平，增强小肠隐窝组织的再生能力，为肠道损伤修复提供新策略。scRNA-seq能够避免细胞群体平均值的局限，减少现有标记偏差的影响，完善对细胞异质性的解释。Yuan等^[29]对小肠隐窝上皮细胞进行scRNA-seq分析不同辐射剂量后的DEGs，发现抗菌反应是13 Gy辐射损伤反应中的重要表现，辐射诱导的瞬时扩增细胞簇具有高度异质性；15 Gy辐射后抑制Wnt3/β-catenin通路或阻断CD44可显著预防辐射诱导的死亡。近期研究显示肿瘤抑制因子p53在辐射诱导的胃肠道损伤中表现出潜在的保护作用^[30]。Morral等^[31]使用scRNA-seq研究p53靶基因在RIII和细胞再生中的作用，研究发现p53在胃肠道再生上皮细胞中特别富集，通过使用p53-MDM2抑制剂Nutlin-3来延长辐照后肠器官组织中p53的活化时间，会导致器官组织克隆性受损、Clu⁺revSCs和Lgr5⁺CBCs细胞丢失。p53通过抑制炎症细胞因子IL12-p40的表达，进而抑制肠上皮细胞上MHC Ⅱ类的表达，最后抑制T细胞活化和辐照后引起肠道干细胞损伤的炎症反应。IL12-p40/MHC Ⅱ类信号通路介导p53在确保肠道干细胞功能和适当的免疫反应以应对辐射保护黏膜上皮方面发挥重要作用^[30]。scRNA-seq作为桥梁联系宏观与微观世界，很大程度上提高了表征细胞状态的能力，增加了对肠道组织器官发育和疾病发病机制的理解，但scRNA-seq只是在转录水平上进行分析研究，深入的生物学理解需要的不仅仅是一个方面，通常需要多维度的数据和分析，从多个层面来综合研究细胞的生物学特性。

5. 皮肤损伤：皮肤是在机体受到电离辐射时最先接触的器官，不同剂量的α、β、γ射线及放射性核素对皮肤的损伤不同。约95%的放射治疗患者会发生中度或重度的放射性皮肤损伤(radiation-induced skin injury, RISI)^[32]。scRNA-seq可对细胞的基因表达进行全面分析，从而确定细胞的状态。Tewary等^[33]利用scRNA-seq分析发现受辐射小鼠皮肤中的衰老相关特征表达增强，SASP因子释放增加。Chen等^[34]通过使用scRNA-seq分析衰老成纤维细胞中的差异表达基因，发现衰老成纤维细胞中多种促进修复因子的表达升高，包括IL-33和TGF-β。进一步对GEO数据库中与RISI相关的皮肤组织和成纤维细胞数据集进行大量scRNA-seq联合分析。结果显示，有12个基因的表达持续升高，其中IL-33的增加最为显著，提示IL-33可能是辐射诱导衰老成纤维细胞中一种表达稳定且显著的SASP因子。Paldor等^[35]通过将scRNA-seq分析与基因消融和分子抑制研究相结合，发现辐射导致皮肤细胞群中多种细胞类型的显著变化，此外，细胞衰老相关标志物的表达增加，以及与炎症反应相关的多种细胞因子和趋化因子也发生上调，这些变化涉及IL-6、IL-1、IL-17、CCL20和CCR6等关键分子，研究还发现细胞间的相互作用和信号传递，特别是IL-6和IL-17之间的正反馈循环，以及CCR6⁺免疫细胞在炎症反应中的作用，尽管scRNA-seq可以揭示皮肤细胞内的基因表达变化，但它并不能直接观察IL-6和IL-17间的物理相互作用和信号传递的过程，这些信息通常需要结合其他技术(如流式细胞术、免疫组化等)来补充和完善。Xiao等^[36]采用scRNA-seq来分析皮肤组织在电离辐射后转录组的变化，共鉴定出639个差异表达基因(其中287个上调，352个下调)。研究结果显示，辐射显著调节了多个与脂质代谢相关的基因和通路，如脂肪酸代谢、类固醇生物合成、脂肪酸生物合成、PPAR信号通路和脂肪酸链延长等。此外，研究还发现辐射降低了皮肤脂肪质量，并改变了皮肤脂质代谢物的组成。这些测序结果发现表明了辐射对皮肤及其细胞的复杂影响，包括加速衰老、改变基因表达、影响修复机制以及干扰脂质代谢等，为深入理解辐射对皮肤的作用机制提供了新的视角。

6. 造血系统损伤：造血系统是对辐射引起的损伤最敏感的系统之一，这种损伤通常会对骨髓、脾和淋巴等生成血细胞的造血器官造成影响。Ghosh等^[37]对外周血单核细胞样本进行scRNA-seq，发现放疗后淋巴细胞减少症患者中T细胞(CD4和CD8)减少，而B细胞、单核细胞、网织红细胞和血小板增加，特别是M-MDSCs(一种单核细胞亚群)的差异更加显著，提示淋巴细胞减少与髓源性抑制细胞(MDSC)数量增加有关。因此，scRNA-seq提供了关于免疫动态变化的深入见解，揭示放化疗后MDSC的扩增及其对T细胞数量的影响，进而说明抑制辐射诱导的MDSC可能有助于改善淋巴细胞减少和患者生存率。scRNAseq可用于识别罕见的细胞亚群，以及差异表达基因分析，Li等^[38]使用囊胚注射法制造小鼠-大鼠嵌合体，其骨髓中富含小鼠来源的祖细胞，并通过scRNAseq鉴定在小鼠-大鼠嵌合体骨髓中独特的细胞群体，与正常小鼠的骨髓相比，在小鼠-大鼠嵌合体的骨髓中发现更多表达Hes1、Dntt和Ebf1的造血祖细胞、表达Cpox、Blvrb和Ermap的间充质基质细胞和血管母细胞样细胞，这些细胞在正常小鼠骨髓中不存在或极为罕见。Vercellino等^[39]利用scRNAseq研究辐射后血小板生成素模拟肽(TPOm)对间充质基质细胞(MSCs)的影响，研究显示与对照组相比，TPOm处理增加了MSCs在细胞周期(G₂M)中的百分比，配体-受体相互作用分析发现TPOm显著增加MSCs中特定胶原蛋白的表达，这增强了它们与其他造血干细胞在骨髓中的相互作用，揭示TPOm在骨髓血管和基质微环境的调节中发挥着新颖作用，特别是促进造血干/祖细胞再生、维持血管完整性以及促进MSCs与其他祖细胞之间的相互作用。目前的研究表明scRNA-seq能够在单细胞水平上对MSCs进行分析，揭示细胞间的复杂相互作用关系，以及发现新的生物学作用。

利用scRNA-seq在不同组织器官的放射性损伤中进行深入研究，揭示了辐射对不同组织和细胞类型的影响，发现辐射诱导的细胞异质性变化，以及与辐射损伤相关的潜在分子标志物和治疗靶点。随着scRNA-seq在放射性损伤研究领域的不断深入，scRNA-seq还将与其他技术相结合，例如结合基因组学、蛋白质组学和代谢组学等技术，形成更为全面的研究体系。总之，scRNA-seq在放射性损伤研究中的应用前景广阔，期待未来能够带来更多突破性的科学发现。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明  杨思瑜负责查阅文献及论文撰写；牛晓凤、邓丽娟、任钲协助论文撰写；杨军指导论文修改