2025, Vol. 45
2. 华中科技大学生命科学与技术学院, 武汉 430071;
3. 苏州大学放射医学及交叉学科研究院, 苏州 215009;
4. 放射医学协同创新中心, 苏州 215009
2. College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430071, China;
3. School for Radiological and Interdisciplinary Sciences(RAD-X), Soochow University, Suzhou 215009, China;
4. Collaborative Innovation Center of Radiological Medicine, Suzhou 215009, China
铀(uranium，U)是一种广泛存在于自然界中的天然放射性元素(主要包括99.274 5%的238U，0.72%的235U和0.005 5%的234U)，是核电站和核武器中不可或缺的原料[1]。铀的副产物贫铀(含有99.8%的238U和0.2%~0.3%的235U)也在民用领域得到了广泛应用。由于铀或贫铀最主要的成分238U，其半衰期长达4.49×109年[1]，因此，在铀开采、冶炼和加工以及贫铀的使用过程中，一旦出现环境污染，铀将长期存在于土壤和地下水中，严重危害人体健康[2-3]。大量研究表明，肾脏是铀损伤的靶器官之一，铀进入人体后，主要以六价铀酰离子的形式存在[2]。在摄入后24 h内，约65%的铀酰离子通过肾脏过滤并通过尿液排出，而其余部分则主要沉积在肾脏和骨骼，持续造成损伤[2, 4-6]。线粒体在细胞能量代谢、氧化还原平衡和钙离子调节中起着至关重要的作用[7]。研究表明，铀的积累会干扰线粒体的正常功能，导致线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMp)丧失，ATP合成受限以及活性氧生成增加，从而加剧肾脏损伤，因此，铀的肾毒性与线粒体的结构损伤和功能障碍密切相关[4, 8]。线粒体作为细胞内高度动态的细胞器，不仅参与能量的产生，还调控细胞周期、凋亡和自噬等生理过程[9-11]。线粒体通过裂变、融合、运输及嵴重塑等动态过程，维持其形态和功能的稳定[9-11]，这些动态过程被称为线粒体动力学[7]。线粒体的功能依赖于其结构基础，而线粒体动力学是调节结构的关键因素。然而，铀引起的氧化应激打破了线粒体动力学平衡，导致线粒体功能的失调。这些变化不仅影响线粒体的能量生成和代谢功能，还可能加重肾脏的细胞损伤。因此，本研究从线粒体动力学角度探讨铀诱导的肾损伤的潜在机制，为铀的防护与救治提供研究基础。
材料与方法1.主要试剂与仪器：硝酸铀酰六水化合物(上海阿拉丁生化科技公司)，DMEM-F12培养基、胎牛血清(美国GIBCO公司)，青链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司)，CCK-8试剂盒(美国Glpbio公司)，Mito-Tracker Red CMXRos试剂盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒、总谷胱甘肽(total glutathione，T-GSH)检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒、过氧化氢酶(catalase，CAT)检测试剂盒、总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性检测试剂盒、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMp)检测试剂盒(JC-1法)均购自上海碧云天生物技术有限公司，Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒(美国安捷伦科技有限公司)，三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)检测试剂盒、线粒体呼吸链复合体Ⅳ/细胞色素C氧化酶活性检测试剂盒、线粒体呼吸链复合体Ⅴ/ATP合酶活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，全蛋白提取试剂盒(北京赛文创新生物科技有限公司)，抗线粒体融合蛋白1(anti-mitofusin 1)抗体、anti-mitofusin 2抗体、anti-opa1抗体、anti-DRP1抗体均购自英国Abcam公司，Fis1(E3K9O)rabbit mAb(美国Cell Signaling公司)，山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)、山羊抗兔IgG H&L (HRP)(英国Abcam公司)，高敏电化学发光(ECL)检测试剂盒(北京赛文创新生物科技有限公司)。
酶联免疫检测仪(美国Thermo Fisher公司)，细胞能量代谢分析系统(美国安捷伦科技有限公司)，激光共聚焦显微镜(德国徕卡显微系统有限公司)，流式细胞仪(苏州贝克曼库尔特生物科技有限公司)，NanoDrop 2000紫外-可见分光光度计(美国Thermo Fisher公司)，生物倒置显微镜(日本Olympus株式会社)，电泳仪(美国Bio-Rad Laboratories公司)，蛋白凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad Laboratories公司)。
2.细胞培养：人肾近曲小管上皮细胞株HK-2来自美国模式培养物集存库(ATCC)，接种于含10%胎牛血清和0.1 U/ml青链霉素混合液的DMEM-F12培养基，于37℃、5% CO2恒温培养箱中进行培养。当细胞生长密度约为1×107/ml时传代。将对数生长期的细胞均匀接种到6孔板中，待细胞生长密度达到80%后，加入100 μmol/L的硝酸铀酰溶液，并分别在培养0、3、6、12、24 h后进行下一步实验。
3.硝酸铀酰溶液的配制：使用高温灭菌后的超纯水溶解硝酸铀酰六水化合物，制备成1 mmol/L的硝酸铀酰储备液。使用前用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。
4.蛋白浓度检测：配制0.5 mg/ml的蛋白标准溶液，按照试剂盒说明书建立标准曲线。将样品加入96孔板中，加入二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)工作液后，在37℃下孵育30 min。562 nm波长下测定吸光度(A)值，根据标准曲线计算蛋白浓度。
5.激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体结构：将对数生长期的细胞均匀接种于6孔板中，待细胞生长密度达到80%后，加入20 μl Hoechst 33342活细胞染色液(1∶100稀释)，在37℃下孵育10 min。移除含有染料的培养基后，加入Mito-Tracker Red CMXRos工作液(1∶3 000稀释)，37℃下孵育30 min。更换为新鲜细胞培养基，将细胞置于激光共聚焦显微镜下进行拍照和观察。
6.荧光显微镜观察ROS荧光强度：移除原有培养基，加入终浓度为30 μmol/L DCFH-DA活性氧检测探针的无血清培养基，37℃下孵育20 min。利用无血清培养基洗涤细胞3次，将细胞置于倒置荧光显微镜下进行拍照和观察。
7.MDA含量检测：收集细胞后，裂解取上清液。参照试剂盒说明书完成后续步骤。在532 nm波长下测定吸光度(A)，根据标准曲线计算样品中的MDA含量。通过单位重量的蛋白含量来标准化MDA含量。
8.CAT酶活力检测：收集细胞后，裂解取上清液。参照试剂盒说明书完成后续步骤。520 nm波长下测定A，根据标准曲线计算样品中CAT的酶活力。
9.SOD酶活力检测：收集细胞后，裂解取上清液。参照试剂盒说明书完成后续步骤。450 nm波长下测定A，计算SOD的酶活力。
10.线粒体能量代谢检测：将80 μl细胞悬液接种于XFp细胞培养板中，在37℃培养箱中过夜培养，直至细胞生长密度达到80%。将XF校准液在37℃下孵育过夜。向水化板各孔中加入200 μl无菌水，并将探针对准各孔后还原整个装置，37℃下孵育过夜。配制检测液时，取9.7 ml Seahorse XF DMEM培养基，分别加入100 μl葡萄糖、100 μl丙酮酸和100 μl谷氨酰胺，混匀后在37℃下温育备用。检测前，吸弃细胞培养板中的60 μl生长培养基，保留20 μl。加入200 μl检测液，再次弃去200 μl后，最终加入160 μl检测液，使总体积为180 μl。将培养板放入37℃培养箱中孵育1 h。加入配制好的硝酸铀酰工作液，上机检测。
11.ATP含量检测：收集细胞后，裂解并取上清液。参照试剂盒说明书完成后续步骤。340 nm波长下检测初始10 s的吸光度A1。将样本在37℃水浴中反应3 min，再测定3 min 10 s的吸光度A2。根据说明书中的公式计算ATP含量。
12.MMp检测：检测前，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞。加入JC-1染色液和培养基各1 ml，混匀后在37℃下孵育20 min。细胞经JC-1染色缓冲液洗涤后，用胰酶消化，再用培养基重悬。最后，使用流式细胞仪检测线粒体膜电位。
13.线粒体呼吸链复合体Ⅳ、Ⅴ活性检测：收集细胞后，加入提取液进行冰浴匀浆。通过两步离心(4℃，600×g离心10 min，11 000×g离心15 min)得到沉淀。参照试剂盒说明书完成后续步骤。在550 nm波长下检测初始吸光度A1和1 min后的吸光度A2。根据说明书中的公式计算线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性。在660 nm波长下测定A。最后，根据说明书中的公式计算线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性。
14.蛋白质印迹：收集细胞后，用预冷的PBS洗涤两次。之后，加入含1% 苯基甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)和1%磷酸酶抑制剂的裂解液，在冰上裂解5 min，然后收集至EP管中。冰上静置10 min后，在4℃下以12 000×g离心5 min，取上清液得到总蛋白。测定蛋白浓度后，将蛋白样品稀释至相同浓度，并加入5×蛋白质加样缓冲液混合。在100℃下加热变性15 min后，制备分离相对分子质量(50~150)× 103蛋白的凝胶进行电泳分离。随后，在100 V恒压下转膜60 min至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。进行封闭后，将膜与抗体放入孵育盒中，在4℃下孵育过夜。次日，用TBST洗涤膜3次，每次10 min。之后，用稀释好的二抗在室温下孵育1 h，再次用TBST洗涤3次。最后，将PVDF膜放入发光液中反应1 min，在暗室中曝光成像。使用Image J 1.53e软件分析目的条带的灰度值。
15.统计学处理：数据统计分析及可视化使用GraphPad Prism 8统计软件。实验数据符合正态分布，以 x±s表示。通过独立样本t检验对组内差异进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
结果1.铀致HK-2细胞线粒体断裂：在硝酸铀酰溶液处理0 h时，HK-2细胞的线粒体呈现为细长管状结构。3 h后，线粒体的管状网络开始呈现间断结构。随着时间的延长，线粒体原本连续的形态逐渐被分割成多个不连续的部分，这些部分之间有明显的间隔(图 1)。
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图 1 铀暴露不同时间后对HK-2细胞线粒体形态结构损伤的影响Mito-Tracker Red CMXRos染色 ×2 070 Figure 1 Effects of uranium exposure on mitochondrial morphology and structure in HK-2 cells at different time points MitoTracker Red CMXRos staining ×2 070 |
2.铀对HK-2细胞ROS、MDA含量及CAT、SOD酶活力的影响：随硝酸铀酰处理时间的延长，HK-2细胞中ROS绿色荧光逐渐增强(图 2)，与0 h相比，100 μmol/L硝酸铀酰染毒6 h后，荧光强度显著升高(t=18.90，P＜0.05)。处理12、24 h时，随着时间的延长，荧光强度逐渐增加(t=21.12、25.77，P＜0.05，表 1)。
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图 2 铀暴露不同时间后对HK-2细胞ROS的影响DCFH-DA染色 ×200 Figure 2 Effects of uranium exposure on ROS levels in HK-2 cells at different time points DCFH-DA staining ×200 |
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表 1 硝酸铀酰处理后不同时间对HK-2细胞的氧化损伤(x±s) Table 1 Oxidative damage in HK-2 cells at different times post-uranyl nitrate exposure(x±s) |
与0 h相比，处理后3 h，HK-2细胞中的MDA浓度升高，随着时间延长，脂质过氧化产物不断累积(t=2.45~58.53，P＜0.05)，CAT酶活力无明显变化。暴露后6 h，HK-2细胞中的CAT酶活力显著降低，并随着铀暴露时间的延长而逐渐降低，且差异具有统计学意义(t=1.19~25.45，P＜0.05，表 1)。铀暴露后3 h，HK-2细胞中的SOD酶活力无明显差异；暴露后6~24 h，SOD酶活力随时间延长显著降低(t=12.12、16.83、18.28，P＜0.05，表 1)。
3.铀对HK-2细胞线粒体呼吸链复合物Ⅳ、Ⅴ酶活力的影响：在100 μmol/L硝酸铀酰处理后3 h，线粒体呼吸链复合物Ⅳ、Ⅴ的酶活力与0 h相比无明显变化(P>0.05)。处理后6 h，线粒体呼吸链复合物Ⅳ、Ⅴ酶活力随时间延长均显著下降(tⅣ=5.37、5.48、5.82，P＜0.05；tⅤ=19.53、25.59、31.51，P＜0.05)，见表 2。
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表 2 硝酸铀酰处理后不同时间致HK-2细胞的线粒体功能障碍(x±s) Table 2 Mitochondrial dysfunction in HK-2 cells at different time points post-uranyl nitrate exposure(x±s) |
4.铀诱导HK-2细胞ATP含量降低：硝酸铀酰处理24 h内，HK-2细胞的ATP含量逐渐降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。处理后24 h，ATP含量差异有统计学意义(t=2.64，P＜0.05，表 2)。
5.铀诱导HK-2细胞MMp降低：硝酸铀酰处理后3 h，MMp无明显变化(P>0.05)。在处理后6 h，MMp出现显著降低(t=10.52，P＜0.05)。在处理后12、24 h，MMp继续下降，且呈时间依赖性降低(t=11.39、16.44，P＜0.05，表 2)。
6.铀诱导HK-2细胞线粒体能量代谢能力下降：结果如表 3所示，在硝酸铀酰处理后，HK-2细胞的基础呼吸0~3 h维持在较高水平，6 h骤降至7.8，此后12~24 h维持在6.9~8.5的低水平，提示6 h后细胞维持基本生命活动的线粒体耗氧能力显著受损。ATP生成的变化趋势与基础呼吸一致，说明线粒体通过氧化磷酸化生成ATP的核心功能，在6 h后明显下降，可能与铀致呼吸链复合酶活性降低、线粒体结构损伤有关。最大呼吸在6 h后显著下降，12~24 h维持，说明6 h后线粒体呼吸链的最大电子传递能力显著下降，可能与线粒体融合/分裂失衡、氧化应激损伤有关。
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表 3 硝酸铀酰处理后不同时间对HK-2细胞线粒体能量代谢能力的影响(pmol/min) Table 3 Effects of uranyl nitrate exposure on mitochondrial energy metabolism capacity in HK-2 cells at different time points (pmol/min) |
7.铀暴露增加HK-2细胞Drp1、Fis1的表达：为了探究铀诱导肾毒性过程中线粒体动力学受损的机制，研究硝酸铀酰暴露24 h对线粒体融合蛋白(Mfn1、Mfn2和Opa1)和裂变蛋白(Drp1和Fis1)表达的影响。结果显示，蛋白表达水平暴露0 h Drp1为0.74±0.09，暴露24 h时为1.81±0.13(t=11.35，P＜0.05)，暴露0 h Fis1为0.89±0.04，24 h时为1.44±0.09(t=9.16，P＜0.05)，差异均有统计学意义，Mfn1、Mfn2、Opa1则未发生明显改变(P>0.05，图 3A)，初步认为Drp1和Fis1可能是对铀毒性较为敏感的线粒体动力学蛋白。进一步研究显示，Drp1和Fis1蛋白的表达量以时间依赖性增加(tDrp1=14.02~185.70，P＜0.05；tFis1=19.72~165.10，P＜0.05，图 3B-D)。因此，推测线粒体动力学相关蛋白Drp1和Fis1的变化可能与线粒体断裂有关，它们可能是诱导HK-2细胞线粒体断裂的关键分子。
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注：a与0 h比较，tDrp1=14.02~185.70，P＜0.05；tFis1=19.72~165.10，P＜0.05 图 3 铀染毒后蛋白表达量A.铀染毒24 h对线粒体动力学相关蛋白表达Western blot条带图；B. Drp1、Fis1铀染毒不同时间蛋白表达Western blot条带图；C. Drp1铀染毒不同时间蛋白表达量图；D. Fis1铀染毒不同时间蛋白表达量图 Figure 3 Protein expression levels after uranium exposure A. Western blot showing the expression of mitochondrial dynamics-related proteins at 24 hours post-uranium exposure; B. Western blot showing the expression of proteins Drp1 and Fis1 at different times post-uranium exposure; C. Bar chart showing the expression level of protein Drp1 at different time post-uranium exposure; D. Bar chart showing the expression level of protein Fis1 at different times post-uranium exposure |
讨论
肾脏是铀损伤的主要靶器官之一[2]，铀的积累会干扰线粒体的正常功能。线粒体的功能依赖于其结构基础，因此，铀的肾毒性与线粒体的结构损伤和功能障碍密切相关，但其潜在的分子机制尚不清楚，有待进一步探索。本研究发现，HK-2细胞线粒体的断裂程度与硝酸铀酰染毒时间呈正相关。硝酸铀酰染毒3 h后，线粒体的管状网络便出现明显的间断结构，这说明硝酸铀酰在较短时间内便会造成细胞线粒体的结构损伤。随着硝酸铀酰的积累，线粒体结构逐渐解体，细胞氧化应激水平显著升高。Liu等[4]和Lu等[12]的研究也表明，铀可引起氧化应激，本研究结果与其一致。在本研究中，HK-2细胞的氧化应激水平随着硝酸铀酰暴露时间的增加而增加。暴露后3 h，细胞内产生ROS，于6 h检测到差异有统计学意义，这与线粒体结构损伤的时间存在先后顺序。由于细胞内约95%的ROS来源于线粒体，随着线粒体结构逐渐解体，产生大量的ROS[12-14]，ROS积累后攻击脂肪分子后，发生脂质过氧化反应，形成MDA[15-16]。细胞中的抗氧化系统(如SOD和CAT)，具有保护机体免受ROS导致的过氧化物损伤的作用[7]。然而，当ROS的累积量超过抗氧化系统的清除能力时，SOD和CAT的活力会明显下降，无法有效阻止MDA的产生[15-16]。本研究显示，CAT和SOD酶活性在6 h时显著下降，这也反映了ROS与抗氧化系统的平衡在100 μmol/L硝酸铀酰染毒后3~6 h被打破。
线粒体作为细胞的能量核心与生命调控中心，在细胞代谢的能量供给和稳态维持中占据关键地位[17-18]，一旦线粒体受损且无法及时修复或清除，其在体内的累积可能触发一系列与线粒体功能障碍紧密相关的健康问题[19]。本研究发现，HK-2细胞中随着硝酸铀酰染毒时间的增加，线粒体能量代谢功能出现不同程度的异常。硝酸铀酰染毒后对线粒体呼吸链复合物Ⅳ、Ⅴ的酶活力的抑制随时间的增加而逐渐加强，6 h时线粒体呼吸链复合物Ⅳ、Ⅴ的酶活力出现了显著抑制。这说明铀诱导线粒体产生大量的ROS，这些ROS攻击线粒体呼吸链酶，导致其出现氧化损伤甚至失活。此外，硝酸铀酰染毒后，HK-2细胞MMP、ATP浓度、ATP关联呼吸能力均随着硝酸铀酰染毒时间的增加而降低，Yu等[2]研究表明，铀破坏了线粒体复合体Ⅳ、Ⅴ的电子转移链，导致ROS形成增加并破坏MMp，本研究结果与其一致。总之，铀导致的线粒体结构损伤发生在0~3 h，线粒体的功能障碍发生于3~6 h，线粒体的结构损伤先于功能障碍，推测线粒体断裂可能是铀毒性的原因之一，线粒体动力学异常可能是导致线粒体功能障碍的机制之一。
线粒体在维持其正常生理功能时，经历着持续的动态变化，这一过程被称为线粒体动力学，它主要包括两个核心过程：线粒体的融合与分裂[7, 9-10]。线粒体功能失调是线粒体动力学失调的特征之一，是多种疾病发生的关键机制之一[20-21]。融合过程受到特定融合蛋白的调控，如Mfn1、Mfn2和Opa1，这些蛋白分别参与线粒体外膜和内膜的融合过程，确保多个线粒体能够合并成一个[22-24]。相对而言，分裂过程则是由Drp、Fis1等分裂蛋白调控[22-24]。在细胞中，线粒体融合与分裂之间的平衡至关重要，这种平衡有助于维持线粒体的形状和内容的交换[22-24]。本研究结果显示，分裂蛋白Drp、Fis1的表达在硝酸铀酰处理后显著升高，而融合蛋白Mfn1、Mfn2和Opa1则差异无统计学意义。进一步研究硝酸铀酰对分裂蛋白Drp、Fis1在时间进程上的影响，发现3 h两者均显著升高，且具有一定的时间依赖关系，这与铀导致的线粒体结构损伤发生时间一致，这说明Drp1和Fis1可能是铀损伤的关键靶点。
本研究的发现为阐明铀致肾毒性的机制提供了重要依据，但仍存在一些局限性。首先，研究主要在HK-2细胞系中进行，虽然能有效揭示细胞层面的直接效应，但无法完全模拟体内肾脏复杂的微环境及器官间的相互作用，未来需在动物模型中进行验证以确认其生理相关性。此外，本研究虽证实线粒体动力学失衡是铀毒性的关键环节，但未能通过使用特异性抑制剂或基因敲低等手段直接干预Drp1、Fis1的功能，以确立其在该过程中的充分必要性。总之，本研究发现线粒体的结构损伤先于功能障碍，线粒体动力学异常是导致线粒体的结构损伤的原因之一。在机制上，铀可能通过促进分裂蛋白Drp1、Fis1的异常表达，促进了线粒体的结构损伤，表现为线粒体结构逐渐解体，产生大量ROS。当ROS超过抗氧化系统的清除能力后，进一步造成了线粒体的功能障碍。因此，推测Drp1和Fis1是铀损伤的关键靶点。本研究为铀致肾毒性的机制研究提供了基础，为铀中毒的预防和治疗提供了潜在新靶点。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献声明 原雅艺负责实验设计、论文撰写与修改；白佳玫负责实验操作、数据整理与分析；田连琛参与实验操作与数据分析；左雅慧、党旭红负责对论文进行审查；王晓梅提供技术指导；董娟聪参与部分实验与数据处理；程娇负责流式细胞术检测
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