2025, Vol. 45
蛋白质稳态是维持细胞功能的基础，其失衡与代谢紊乱、肿瘤及神经退行性病变等密切相关[1]。内质网(endoplasmic reticulum, ER)作为真核细胞核心细胞器，负责蛋白质折叠、组装及信号转导等，在维持细胞稳态中发挥重要作用[2]。在稳态下处理正确折叠蛋白；应激状态下则触发内质网应激(ER stress)——通过清除异常蛋白重构稳态平衡，该机制深度参与疾病进程[3-5]。研究表明，电离辐射可诱导内质网超微结构改变，其应激状态受细胞癌变和微环境等多重调控[6-8]。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)作为未折叠蛋白反应(UPR)的核心调控因子，其表达量与定位变化关联抑癌/促癌转化过程[9-11]。
超高剂量率(> 40 Gy/s，FLASH)放疗在有效杀伤肿瘤的同时，对正常组织具有保护效应[12-14]。动物实验证实，FLASH可显著减轻放射性肺炎与纤维化[12, 15-16]。然而，剂量率差异与内质网应激的调控关联尚待解析。本研究采用CONV与FLASH照射模型，在KT和A549细胞中探究不同剂量率对细胞的影响，揭示内质网应激的核心调控作用，为优化肺部肿瘤FLASH放射治疗策略提供新视角。
材料与方法1.主要试剂与仪器：GRP78抗体、GAPDH抗体、CHOP抗体、PERK抗体、β-肌动蛋白抗体购自苏州博特龙公司。BAX抗体购自武汉三鹰生物公司。BCL-2抗体购自美国Abcam公司。DMEM(上海VivaCell公司)、胎牛血清(乌拉圭ExCell公司)、双抗(苏州博特龙公司)、白介素6(IL-6)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(苏州格瑞特医药技术公司)。
2. 细胞培养与照射：人肺永生化小气道上皮细胞HSAEC1-KT、肺癌细胞A549均购自美国模式培养物收藏中心(ATCC)细胞库，采用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养，并将细胞置于37℃含5% CO2培养箱培养。将细胞种于T25培养瓶中，待细胞长至70%融合度后，将两种细胞分别随机分为对照(Ctrl)组、常规剂量率(CONV)组和FLASH组。除Ctrl组外，应用中国原子能科学研究所质子回旋加速器对细胞分别进行4、8、10 Gy的常规剂量率(1 Gy/min)和超高剂量率(40 Gy/s)质子照射。
3. 蛋白免疫印迹实验：收集CONV和FLASH质子照射8 Gy后24 h的细胞样品，进行蛋白免疫印迹实验检测GRP78以及凋亡相关蛋白表达情况。其中一抗分别为GRP78(1∶1 500)、GAPDH(1∶10 000)、BAX(1∶2 000)、BCL-2(1∶2000)，CHOP、PERK、β-肌动蛋白(1∶1 000)。
4. 实时定量PCR检测：照射处理24 h后对细胞进行RNA提取。使用TRIzol提取法提取细胞RNA(南京Vazyme公司)提取细胞总RNA，测量浓度后使用反转录试剂盒(泰州康为世纪公司)进行反转录，并使用高灵敏性染料法定量PCR检测试剂盒(上海生工生物工程公司)进行qRT-PCR。检测采用qRT-PCR仪，数据分析使用2-ΔΔCt方法。所有的PCR产物通过GPADH作为内参进行定量和归一化。
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表 1 RT-PCR引物序列 Table 1 RT-PCR primer sequence |
5. ELISA检测：照射后24 h收集经不同剂量率质子照射所得的细胞培养基，离心半径6.5 cm，1 000 r/min，离心20 min，取上清作为条件培养基，检测不同处理后IL-6浓度。根据说明书制备标准曲线所需的标准品，向微孔板中加入标准品和待测样品，孵育后进行洗涤和显色，最终加入终止液后在15 min内检测450 nm的吸光度(A)值，计算并分析IL-6的浓度。
6. 细胞克隆存活实验：对细胞进行4、8、10 Gy的常规和FLASH照射后进行细胞铺板，将细胞悬液作梯度稀释，置于37℃、5% CO2培养箱中培养14 d；然后对形成的克隆进行固定、染色、计数及拍照。
7. 统计学处理：所有实验重复3次。采用image J软件进行统计，用Graphpad Prism 10.0软件作图。对数据进行描述性分析，符合正态分布，方差齐，采用x±s表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。
结果1. 不同照射模式对KT和A549细胞存活的影响：结果见图 1。与CONV组相比，FLASH组的存活率更高(t=4.05、3.66、5.58，P＜0.05)；而A549细胞则没有此效应，CONV组与FLASH组差异无统计学意义(P>0.05)，提示FLASH与CONV对于肿瘤细胞有同等杀伤效果。
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注：a与0 Gy相比，t=54.52、382.40、623.00、26.60、365.40、379.40、33.81、390.60、799.90、32.42、408.80、816.80，P＜0.05；b与CONV组相比，t=4.05、3.66、5.58，P＜0.05 图 1 不同剂量、不同照射模式对KT(A)、A549(B)细胞存活的影响 Figure 1 Cell survival of KT (A) and A549 (B) cells at different doses with different irradiation modalities |
2. 质子FLASH照射对内质网应激标志物GRP78的影响：如图 2所示，肺上皮细胞在受到CONV和FLASH照射后GRP78蛋白均显著升高(t=5.05、7.52，P＜0.05)，仅FLASH组的mRNA水平显著升高(t=2.87，P＜0.05)，提示FLASH照射后内质网应激激活；而相同照射条件下肺癌细胞A549的GRP78蛋白和mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)，说明内质网应激并未被激活。
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注：a与Ctrl组相比，t=5.05、7.52、2.87，P＜0.05 图 2 不同剂量率质子辐照后肺上皮细胞和肺癌细胞内质网应激标志物GRP78的表达变化 A-B. GRP78蛋白电泳及蛋白相对表达；C. GRP78 mRNA相对水平变化情况 Figure 2 Expression changes of endoplasmic reticulum stress marker GRP78 in lung epithelial cells and lung cancer cells following different proton irradiation regimens A-B. Alterations in GRP78 protein expression; C. Changes in GRP78 mRNA relative levels |
3. FLASH诱导内质网应激激活肺上皮细胞未折叠蛋白反应信号通路：如图 3所示，检测KT细胞mRNA水平发现，与Ctrl组相比，FLASH照射组PERK、ATF4、CHOP的mRNA水平显著上调(t=4.29、3.33、8.27，P＜0.05)，而CONV组并没有显著变化(P>0.05)；PERK、CHOP蛋白表达情况与定量PCR结果一致(FLASH vs. Ctrl, t=4.90、10.51，P＜0.05；CONV vs. FLASH，t=4.96、4.59，P＜0.05)，而肺癌细胞(A549)差异无统计学意义(P>0.05)。结合实时定量PCR实验以及蛋白免疫印迹实验结果表明，FLASH照射后能够激活正常肺上皮细胞PERK-elF2α-ATF4信号通路，进而诱导CHOP上调。
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注：a与Ctrl组相比，t=4.29、3.33、8.27、5.26、10.51、4.90，P＜0.05；b与CONV组相比，t=4.96、4.59，P＜0.05 图 3 未折叠蛋白反应(UPR)通路相关基因的mRNA水平变化情况以及内质网应激蛋白PERK、CHOP蛋白含量变化 A. KT细胞UPR通路相关基因mRNA水平变化；B. A549细胞UPR通路相关基因mRNA水平变化；C-D. KT细胞UPR通路蛋白CHOP和PERK变化情况 Figure 3 Quantitative assessment of mRNA expression changes in genes regulating the unfolded protein response (UPR) signaling pathways and alterations in UPR pathway proteins PERK and CHOP A. mRNA expression changes of UPR-related genes in KT cells following irradiation; B. mRNA expression changes of UPR-related genes in A549 cells following irradiation; C-D. CHOP and PERK protein expression in KT cells following irradiation |
4. FLASH诱导的内质网应激可抑制炎症因子IL-6分泌：如图 4所示，照射KT后与Ctrl组相比，CONV和FLASH两组IL-6分泌都显著增多(t=7.43、3.07, P＜0.05)，而FLASH组IL-6分泌水平显著低于CONV组(t=7.63，P＜0.05)；照射A549后，两组细胞IL-6分泌均增多(t=4.31、4.47，P＜0.05)，且两组间差异无统计学意义(P>0.05)，qRT-PCR检测得到的IL-6 mRNA水平变化与ELISA一致。
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注：a与Ctrl组相比，t=7.43、3.07、4.31、4.47、3.05、4.01，P＜0.05；b与CONV组相比，t=3.83、7.63，P＜0.05 图 4 不同剂量率辐照后KT和A549细胞炎症因子IL-6的表达(A)和IL-6相对mRNA水平变化(B) Figure 4 Expression of inflammatory cytokine IL-6 (A) and relative mRNA level changes of IL-6 (B) in KT and A549 cells after irradiation at different dose rates |
5. 质子FLASH照射后凋亡蛋白BAX、BCL-2蛋白含量变化：如图 5所示，与CONV组相比，FLASH照射后BAX/BCL-2在正常细胞和肺癌细胞中存在较大差异，KT细胞FLASH组比值大于CONV组(FLASH vs. Ctrl, t=5.00, P＜0.05; CONV vs. FLASH，t=3.79，P＜0.05)，提示FLASH照射趋向于促凋亡，而A549细胞CONV和FLASH照射均诱发凋亡(CONV vs. Ctrl，t=11.79，P＜0.05；FLASH vs. Ctrl，t=3.80，P＜0.05)。推测正常细胞在受到FLASH照射后可能是通过内质网应激激活相应通路，促进损伤细胞凋亡发生，来抑制炎症因子IL-6的分泌，进而缓解炎性反应造成的损伤。
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注：a与Ctrl相比，t=5.00、11.79、3.80，P＜0.05；b与CONV相比，t=3.79，P＜0.05 图 5 不同剂量率照射KT和A549细胞凋亡蛋白BAX、BCL-2蛋白水平变化 A.蛋白电泳；B.BAX/BCL-2蛋白表达比值 Figure 5 Alterations in protein expression levels of apoptosis regulators BAX and BCL-2 A. Protein electrophoresis; B. BAX/BCL-2 protein expression ratio |
讨论
FLASH疗法是一种基于超高剂量率辐射的新型放射治疗技术。较常规放疗，其在维持同等肿瘤控制效果的同时[12, 17]，可显著降低正常组织不良反应[14, 18-21]。早在2014年电子FLASH放疗被证实能减轻肺纤维化后[12]，质子FLASH放疗的理论构想随之提出。Patriarca等[22]通过改良存在技术局限的质子束线，成功利用回旋加速器产生剂量率＞40 Gy/s的高能射线，实现了针对小鼠肺部照射的FLASH质子治疗实验。尽管FLASH的辐射保护效应已在多种组织中得到验证，但其生物学机制尚未完全阐明。目前学界提出的核心假说包括：氧耗竭假说、自由基重组假说、免疫调节机制[23-24]以及DNA损伤响应差异化等[25-26]。值得注意的是，质子FLASH的机制既包含与电子FLASH共通的生物学基础，又兼具质子特有的物理与生物学特性[27-28]，主要体现在布拉格峰区的线性能量传递(LET)显著升高。
本研究主要探究质子FLASH照射对肺正常细胞与肺癌细胞存在显著差异效应的影响机制。在肺正常上皮细胞中，质子FLASH照射后细胞存活率高于CONV照射，且激活未折叠蛋白反应(UPR)介导的内质网应激，特异性触发PERK-eIF2α-ATF4信号通路，促使CHOP表达上调并驱动损伤细胞凋亡。该过程抑制炎症因子IL-6分泌，减轻辐射炎性损伤，证实FLASH对正常组织的保护机制。而在肺癌细胞中，FLASH照射与CONV照射细胞存活率差异无统计学意义，提示不同照射对肿瘤杀伤有同等效应；另外，FLASH和CONV照射均未诱发内质网应激，细胞直接呈现凋亡倾向且IL-6分泌显著增加，导致辐射损伤持续累积。
本研究阐明了质子FLASH照射后肺正常细胞与癌细胞中UPR介导的内质网应激差异化激活机制，但有关PERK通路下游效应分子(如eIF2α磷酸化水平)及凋亡-炎症串扰机制尚不清晰。并且研究局限于单层细胞培养模型，还需在动物实验上做更进一步的验证。尽管存在局限性，本研究作为质子FLASH放疗领域内质网应激机制的创新性探索，揭示了正常肺组织辐射保护的核心通路。这不仅深化了对FLASH生物效应机制的理解，更为其临床转化奠定关键理论基础，尤其为中央型肺癌的FLASH治疗(同步实现肿瘤控制与正常肺保护)提供新的分子干预策略。
利益冲突 无
作者贡献声明 王笑菲负责实验设计、实验操作、数据整理、撰写论文；周光明、胡文涛指导实验设计和论文修改
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