放射治疗作为癌症治疗的重要手段之一，已广泛应用于临床癌症治疗^[1]。然而，传统放疗仍面临健康组织损伤、肿瘤放射耐受及复发等亟需解决的问题。近年来，FLASH放疗被证实具有保护正常组织的优势，是一种可能减少不良反应和改善放射治疗效果的新方法^[2]。目前对FLASH效应的研究更多侧重于对正常组织的保护效应，而对其改善疗效的研究则相对偏少。癌细胞的能量代谢变化，对放射治疗后的癌症进展具有重要影响^[3]。能量代谢的重编程不仅反映了癌细胞对外界应激反应的适应性变化，也可能直接参与调控细胞的生存和增殖能力。为探究FLASH-IR在能量代谢调控方面与CONV-IR的差异，本研究应用热阴极电子加速器辐照平台和Seahorse XF Pro细胞代谢分析系统，监测三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231在两种不同放疗模式下的能量代谢参数的变化。通过对细胞耗氧率(oxygen consumption rate，OCR)和胞外酸化率(extra cellular acidification rate，ECAR)的测量，反映细胞受辐射后线粒体代谢和糖酵解代谢的变化，揭示FLASH-IR对癌细胞能量代谢的差异性影响，进而为FLASH放疗提供靶向能量代谢以增强疗效的潜在研究方向。

1.主要仪器与试剂：胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，DMEM高糖培养基购自苏州海星生物科技有限公司；MCF-10A专用培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司；Seahorse XF pro探针板、细胞培养微孔板、寡霉素、鱼藤酮、抗霉素A、葡萄糖、丙酮酸、谷氨酰胺、XF DMEM培养基购自美国安捷伦公司；Hoechst 33342购自北京索莱宝生物科技有限公司。Seahorse XF pro细胞代谢动态呼吸仪(美国安捷伦公司)。

2.细胞培养：人乳腺癌细胞系MDA-MB-231购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，使用添加10%FBS和1%青、链霉素(P/S)的DMEM高糖培养基培养。非致瘤性人乳腺上皮细胞MCF-10A由北京大学生命科学学院高铭洁博士赠送，原购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，使用由添加5%马血清(horse serum，HS)、20 ng/ml人表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)、100 ng/ml霍乱毒素、500 ng/ml氢化可的松、1%P/S的DMEM/F12组成的MCF-10A专用培养基培养。所有细胞均在37℃、5%CO₂和21%O₂条件下培养。

3.实验分组与照射条件：实验按辐射剂量和剂量率将癌细胞分为假照射组(CTRL)、低剂量低剂量率组(CONV_2 Gy)、低剂量高剂量率组(FLASH_2 Gy)、高剂量低剂量率组(CONV_14 Gy)和高剂量高剂量率组(FLASH_14 Gy)。照射装置使用小型s波段热阴极电子加速器^[4]，电子线能量均为6 MeV，源靶距10 cm，各实验组照射参数如表 1所示。其中辐射剂量通过辐射显色薄膜(radiochromic films，RCF)测量^[4]。辐照后细胞在37℃、5%CO₂和21%O₂条件下培养至指定时间点。

表 1(Table 1)

表 1 实验组照射参数 Table 1 Irradiation parameters of experimental groups 组别 样本数 剂量(Gy，x±s) 平均剂量率(Gy/s) 脉冲数 脉冲宽度(μs) 重复频率(Hz) CONV_2 Gy 3 2.01±0.03 0.33 7 2 1 FLASH_2 Gy 3 1.99±0.04 5.00×105 1 4 1 CONV_14 Gy 3 14.03±0.38 0.29 49 2 1 FLASH_14 Gy 3 13.97±0.40 3.00×106 1 4 1

表 1 实验组照射参数 Table 1 Irradiation parameters of experimental groups

4.细胞能量代谢检测：按照Seahorse XF Pro实时ATP速率测定试剂盒操作步骤进行。实验检测时间点前1 d需向工具板中每孔添加200 μ1 XF校准液，将探针板浸没后置于37℃无CO₂环境进行水化。实验检测时间点前需进行Seahorse检测液的配置，其中葡萄糖、谷氨酰胺和丙酮酸浓度分别为10、2、1 mmol/L，使用1N NaOH调节至pH=7.4±0.1。利用检测液对待测细胞进行换液后，置于37℃无CO₂环境培养1 h后，向加药孔中添加1.5 μmol/L的寡霉素、0.5 μmol/L的鱼藤酮和抗霉素A。加药后依据说明书要求进行上机检测。检测过程中通过探针板上传感器收集细胞微环境中的氧气消耗速率和pH值变化速率来反映细胞能量代谢情况。

5.细胞数目测定：加入Hoechst 33342染料(5 μg/ml)，室温避光孵育15 min，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤去除多余染料。成像采用配备自动聚焦系统与多通道荧光成像模块的高内涵细胞成像系统(Operetta CLS，美国PerkinElmer公司)完成。使用Hoechst染色通道用于识别细胞核，实现单细胞分割与计数。每个孔位拍摄多个视野以覆盖代表性区域，所有图像自动上传至内置分析软件进行处理分析。细胞计数基于细胞核信号自动阈值分割，通过定义核大小、荧光强度阈值以及形态学参数以排除碎片或重叠细胞的影响。最终统计结果以每孔细胞总数呈现，并用于后续数据归一化或比较分析。

6.统计学处理：采用SPSS 24.0软件进行统计学处理，作图工具选用Origin 2021。资料符合正态分布，以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

1.癌细胞与正常细胞能量代谢差异分析：结果如图 1显示，正常培养条件下，乳腺癌细胞MDA-MB-231的基础呼吸、ATP相关联呼吸、质子渗漏水平低于乳腺正常细胞MCF-10A，而糖酵解质子流出、补偿性糖酵解水平则较高，差异具有统计学意义(t=7.81、7.15、5.52、-19.24、-16.51，P＜0.05)。结果表明癌细胞则更倾向于糖酵解主导的能量代谢，而正常细胞更倾向于进行线粒体主导的能量代谢。同时乳腺癌细胞非线粒体氧消耗水平高于乳腺正常细胞(t=-14.25，P＜0.05)，表明癌细胞的基础酶促反应较正常细胞更活跃。

注：1. 基础呼吸；2. ATP相关联呼吸；3. 质子渗漏；4. 非线粒体氧消耗；5. 糖酵解质子流出；6. 补偿性糖酵解。a与MCF-10A细胞相比，t=7.81、7.15、5.52、-14.25、-19.24、-16.51，P＜0.05 图 1 正常培养环境下MCF-10A与MDA-MB-231细胞的能量代谢水平  A、B. 两种细胞耗氧速率曲线以及相关定量指标；C、D. 两种细胞胞外酸化率曲线以及相关定量指标 Figure 1 Energy metabolism levels of the MCF-10A and MDA-MB-231 cells under normal culture conditions   A, B. Oxygen consumption rate (OCR) curves and associated quantitative parameters of both cell lines; C, D. Extracellular acidification rate (ECAR) curves and associated quantitative parameters of both cell lines

2.低剂量FLASH-IR与CONV-IR后癌细胞能量代谢的时序变化：进行剂量为2 Gy的FLASH-IR与CONV-IR后，在4、24和48 h 3个时间点对细胞进行能量代谢分析，并于分析结束后统计细胞数，对结果进行单细胞的归一化处理，绘制细胞耗氧率曲线、胞外酸化率曲线和能量图。结果示于图 2，表明细胞受2 Gy照射后在短期会产生应激反应，这种反应从耗氧率来看会在48 h内保持，而从胞外酸化率看则会在48 h内降低，最后低于CTRL组水平。

图 2 不同时间不同剂量率2 Gy照射后MDA-MB-231细胞能量代谢分析  A~C. 辐照后4 h时耗氧率曲线、胞外酸化率曲线和能量图；D~F. 辐照后24 h时耗氧率曲线、胞外酸化率曲线和能量图；G~I. 辐照后48 h时耗氧率曲线、胞外酸化率曲线和能量图 Figure 2 Energy metabolism of MDA-MB-231 cell after 2 Gy irradiation under different time points and dose rates   A-C. Oxygen consumption rate (OCR) curves, extracellular acidification rate (ECAR) curves, and energy diagram at 4 h post-irradiation; D-F. Oxygen consumption rate (OCR) curves, extracellular acidification rate (ECAR) curves, and energy diagram at 24 h post-irradiation; G-I. Oxygen consumption rate (OCR) curves, extracellular acidification rate (ECAR) curves, and energy diagram at 48 h post-irradiation

3.高剂量FLASH-IR与CONV-IR后癌细胞能量代谢的时序变化：结果如图 3所示，辐照过程除剂量调整为14 Gy外其余与低剂量组相同。同样于照射后4、24、48 h进行细胞能量代谢检测，并对细胞数量进行归一化。结果表明，癌细胞在接受大剂量14 Gy照射后，仍然会在短时间内激活两种方式的能量代谢，但水平会随时间增加而进一步升高，在48 h后仍然保持高位；此外，FLASH-IR对癌细胞能量代谢的刺激强度要高于CONV组。

图 3 不同时间不同剂量率14 Gy照射后MDA-MB-231细胞能量代谢分析  A~C. 辐照后4 h时耗氧率曲线、胞外酸化率曲线和能量图；D~F. 辐照后24 h时耗氧率曲线、胞外酸化率曲线和能量图；G~I. 辐照后48 h时耗氧率曲线、胞外酸化率曲线和能量图 Figure 3 Energy metabolism of MDA-MB-231 cell after 14 Gy irradiation under different time points and dose rates   A-C. Oxygen consumption rate (OCR) curves, extracellular acidification rate (ECAR) curves, and energy diagram at 4 h post-irradiation; D-F. Oxygen consumption rate (OCR) curves, extracellular acidification rate (ECAR) curves, and energy diagram at 24 h post-irradiation; G-I. Oxygen consumption rate (OCR) curves, extracellular acidification rate (ECAR) curves, and energy diagram at 48 h post-irradiation

4.不同受照方式和剂量对癌细胞线粒体代谢时序的影响：所有结果均依据细胞数量进行了单细胞平均，并根据同样参数下的CTRL组进行了归一化处理，表征相对水平。结果如表 2所示，接受2 Gy照射后，乳腺癌细胞在4 h出现基础呼吸的上调(t=3.63，P＜0.05)，而在24 h和48 h后的差异没有统计学意义(P＞0.05)。而分析其ATP相关联呼吸时发现，在3个时间点均出现上调(t=2.69~3.70，P＜0.05)。相应地，14 Gy照射后，这种上调更为显著，差异具有统计学意义(t=2.48~11.25，P＜0.05)。其中，FLASH-IR对基础呼吸和ATP相关联呼吸的上调要更高(t=2.56~5.42，P＜0.05)。对于细胞质子渗漏水平而言，2 Gy辐照使其短时间内大幅上升，而在长期得到修复(t=3.03、-4.26、-4.49，P＜0.05)；14 Gy辐照也能使其在短时间内上升，并在24 h观测到一些修复效果，但是在48 h这种效果消失(t=3.08、2.86，P＜0.05)。同时，对于2 Gy辐照组来说，FLASH-IR虽然在短时间内的响应水平更低，但在后续抑制了修复过程(t=-2.45、3.19、6.51，P＜0.05)。2 Gy辐照条件下非线粒体氧消耗在各时间点差异无统计学意义(P＞0.05)，但14 Gy组则出现了消耗水平的显著上升(t=7.99、10.22，P＜0.05)，并且FLASH组在48 h要更高(t=3.29，P＜0.05)。

表 2(Table 2)

表 2 不同剂量不同照射模式下线粒体代谢参数时序变化(x±s) Table 2 Time variations of mitochondrial metabolic parameters under different doses and irradiation modes(x±s) 组别 样本数 相对基础呼吸 相对ATP相关联呼吸 4 h 24 h 48 h 4 h 24 h 48 h CTRL组 6 1.00±0.09 1.00±0.04 1.00±0.09 1.00±0.09 1.00±0.03 1.00±0.14 CONV_2 Gy组 6 1.15±0.04a 1.07±0.07 1.10±0.09 1.12±0.05a 1.12±0.06a 1.23±0.10a FLASH_2 Gy组 6 1.18±0.12 1.01±0.08 1.15±0.18 1.19±0.11 1.02±0.10 1.19±0.19 CONV_14 Gy组 6 1.14±0.07a 1.49±0.09a 1.83±0.12a 1.08±0.09 1.49±0.09a 1.94±0.11a FLASH_14 Gy组 6 1.21±0.06 1.67±0.12b 2.31±0.15b 1.20±0.10 1.71±0.20 2.53±0.19b 组别 样本数 相对质子渗漏 相对非线粒体氧消耗 4 h 24 h 48 h 4 h 24 h 48 h CTRL组 6 1.00±0.31 1.00±0.19 1.00±0.18 1.00±0.06 1.00±0.15 1.00±0.20 CONV_2 Gy组 6 2.22±0.06a 0.53±0.14a 0.54±0.13a 1.03±0.06 1.14±0.11 1.27±0.14 FLASH_2 Gy组 6 1.40±0.21c 0.84±0.14c 0.93±0.06c 1.03±0.08 1.16±0.08 1.27±0.23 CONV_14 Gy组 6 2.10±0.53a 0.95±0.21 1.34±0.16a 1.07±0.08 2.58±0.41a 3.11±0.36a FLASH_14 Gy组 6 1.73±0.40 0.75±0.16 1.51±0.19 1.10±0.11 2.48±0.13 3.78±0.26b 注：a与CTRL组相比，t=-4.49~11.25，P＜0.05；b与CONV_14 Gy组相比，t=2.56、5.08、5.42、3.29，P＜0.05；c与CONV_2 Gy组相比，t=-2.45、3.19、6.51，P＜0.05

表 2 不同剂量不同照射模式下线粒体代谢参数时序变化(x±s) Table 2 Time variations of mitochondrial metabolic parameters under different doses and irradiation modes(x±s)

5.各辐照方式和辐照剂量后癌细胞糖酵解代谢时序变化：结果如表 3所示，其中糖酵解质子流出(glycolytic proton efflux)代表扣除线粒体呼吸导致的胞外酸化速率后，细胞仅由糖酵解导致的质子流出水平。补偿性糖酵解(compensatory glycolysis)则代表加入鱼藤酮和抗霉素A关闭线粒体呼吸后，细胞为了维持生命活动进行的代谢补偿，代表细胞的糖酵解潜力。2 Gy辐照后，细胞在4 h上调糖酵解水平和糖酵解潜力(t=2.79、5.21，P＜0.05)而在48 h后下调(t=-4.44、-2.66，P＜0.05)。相对地，14 Gy辐照对二者的上调更强，并在48 h没有恢复(t=5.91~18.52，P＜0.05)。同时，FLASH组相对CONV组在各个时间点都有更高的调节趋势，但仅在24 h对补偿性糖酵解的上调具有统计学意义(t=2.86，P＜0.05)。

表 3(Table 3)

表 3 不同剂量不同照射模式下糖酵解代谢参数变化(a.u.，x±s) Table 3 Changes in glycolytic metabolic parameters under different doses and irradiation modes (a.u., x±s) 组别 样本数 相对糖酵解质子流出 相对补偿性糖酵解 4 h 24 h 48 h 4 h 24 h 48 h CTRL组 6 1.00±0.07 1.00±0.06 1.00±0.02 1.00±0.05 1.00±0.04 1.00±0.03 CONV_2 Gy组 6 1.13±0.08a 1.06±0.09 0.85±0.06a 1.15±0.04a 1.03±0.08 0.92±0.05a FLASH_2 Gy组 6 1.17±0.05 1.12±0.05 0.86±0.12 1.18±0.05 1.08±0.05 0.93±0.12 CONV_14 Gy组 6 1.25±0.06a 1.68±0.11a 1.60±0.18a 1.21±0.05a 1.51±0.04a 1.70±0.18a FLASH_14 Gy组 6 1.24±0.10 1.86±0.23 1.72±0.14 1.21±0.08 1.74±0.17b 1.82±0.10 注：a与CTRL组相比，t=-4.44~18.52，P＜0.05；b与CONV_14 Gy组相比，t=2.86，P＜0.05

表 3 不同剂量不同照射模式下糖酵解代谢参数变化(a.u.，x±s) Table 3 Changes in glycolytic metabolic parameters under different doses and irradiation modes (a.u., x±s)

放射治疗作为恶性肿瘤的重要治疗手段，其主要原理是通过诱导DNA损伤引发癌细胞周期阻滞或凋亡^[5]。然而，即使放疗已经对癌症治疗做出了巨大贡献，仍有相当部分患者出现肿瘤复发以及放射耐受^[6]。近年来研究发现，放疗诱导的癌细胞代谢转变很大程度上影响了患者预后。尤其是在接受电离辐射后，癌细胞能量代谢的重编程被认为是癌细胞抵御辐射影响的重要手段之一，具体表现为对糖酵解和线粒体有氧呼吸的双重促进^[7]。糖酵解带来的乳酸堆积可能会改变肿瘤微环境，抑制免疫细胞代谢导致免疫逃逸^[8]，以及促进肿瘤相关成纤维细胞分泌透明质酸诱导转移^[9]。线粒体氧化应激带来的膜电位改变，以及相关蛋白通路的激活，也被证实构成了影响肿瘤放射耐受的重要影响因素^[10]。

不同于正常细胞，即使在氧气充足的情况下，癌细胞仍更倾向于进行糖酵解代谢，而非线粒体代谢，称为Warburg效应^[11]。癌细胞在能量代谢倾向上的差异，可能在一定程度上会影响其在接受辐照后的代谢重编程。本研究对比了MCF-10A和MDA-MB-231的能量代谢方式差异，可以观察到不论是基础呼吸率、ATP相关联呼吸速率还是质子渗漏速率，乳腺正常细胞均会高于乳腺癌细胞，而非线粒体氧消耗则相反。其中基础呼吸(basal respiration)代表仅由线粒体产生的耗氧率，表征细胞基线状态下能量需求；ATP相关联呼吸(ATP-linked respiration)代表寡霉素抑制ATP合成酶后细胞减少的耗氧率，代表基础呼吸中驱动产生ATP的水平；质子渗漏(proton leak)代表基础氧消耗中未参与合成ATP的部分，可能与线粒体损伤相关^[12]；非线粒体氧消耗(non-mitochondrial oxygen consumption)是在加入鱼藤酮和抗霉素A关闭线粒体呼吸后，细胞中仍存留的酶对氧气的消耗水平，可能与细胞其他代谢合成相关^[13]。相应地，乳腺癌细胞基础糖酵解速率和糖酵解潜力均大于正常细胞。这些结果验证了前人的结论，也进一步说明了实验的可靠性。

FLASH-IR的作用机制一直以来是人们重要的研究方向^[14]。本研究通过照后4、24和48 h 3个时间点一定程度上刻画癌细胞代谢重编程的时序变化。尽管这仅是单一乳腺癌亚型的反馈结果，不能完整反映乳腺癌细胞系的全体情况，但MDA-MB-231在正常培养环境下的线粒体氧化磷酸化水平与糖酵解水平均与许多乳腺癌亚型相当^[15]，故其能量代谢的变化可能具有一定代表性。其中，2 Gy是常用的临床分次剂量，在这种剂量条件下，癌细胞的线粒体代谢在短期与长期均得到了一定的提高，这可能是细胞氧化应激的一种体现。而糖酵解代谢水平则在短期出现了上调，在长期出现了下调，这可能反映短期内细胞能量代谢需求的增加，而在长期逐渐降低。14 Gy则是放射消融常用剂量，在如此高剂量作用下，癌细胞会产生强烈的应激反应，具体表现在线粒体代谢和糖酵解代谢的双重增强。然而，FLASH-IR对线粒体代谢的上调是更剧烈的，反映细胞更强的能量需求，可能暗示着更强的损伤作用，但仍需相关实验验证。此外，目前本研究主要基于常氧(21%O₂)条件对细胞进行培养，虽然能保证细胞的代谢活性，但其与实体瘤可能的乏氧(＜5%O₂)环境存在区别。氧气浓度差异及细胞系差异带来的影响将在进一步实验中验证。

由于癌细胞能量代谢变化的重要性，FLASH-IR在癌细胞中可能的独特性反应有望成为新的治疗靶点。在对荷瘤小鼠的FLASH-IR研究中，通过转录组测序发现，相对于同剂量的CONV组，肿瘤细胞的糖酵解基因簇出现上调^[16]。进一步使用糖酵解抑制剂曲美替尼后，发现FLASH组的抗肿瘤效果得到了增强。本研究中，FLASH-IR后24 h对癌细胞糖酵解潜力提升一定程度上印证了这个结论，同时，进一步发现线粒体代谢在长期会有更大程度的差异。目前本研究中仅对两种辐照方式后癌细胞的能量代谢变化进行了初步的探索，并没有直接得到代谢改变的后果。在以往的研究中，辐照后细胞短期的能量代谢上调往往意味着细胞周期阻滞^[17]和长期的功能性障碍^[18]，同时，靶向抑制糖酵解和线粒体氧化磷酸化也是增加肿瘤辐射敏感性的有效手段^[19]。且由于FLASH-IR对正常组织有保护作用，可能使得临床大分割剂量得到进一步的应用，故本研究结果暗示大剂量FLASH-IR存在刺激癌细胞能量代谢需求的可能，此时结合能量代谢抑制剂有可能会进一步降低癌细胞的辐射抵抗。

综上，本研究对FLASH-IR诱导的癌细胞能量代谢变化进行了初步的研究。结果表明，癌细胞可能对电子线FLASH-IR在能量代谢层面更为敏感。目前相关结果主要通过体外实验得到，并不能完全反映体内复杂的肿瘤微环境情况，但若进一步结合动物模型的相关验证，或许能为FLASH放疗提供靶向能量代谢的潜在研究方向。

利益冲突  无

作者贡献声明  罗筠彬负责实验设计、实验操作、数据整理、撰写论文；张嘉瑛负责实验操作；吕建锋指导论文修改；王鹤茗参与实验操作；薛丽香、王皓负责论文修改；杨根、颜学庆指导实验设计、论文修改