FLASH照射作为一种新兴的放疗技术，通过至少数百倍于常规放疗的照射剂量率(即超高剂量率，平均剂量率≥40 Gy/s，瞬时剂量率≥100 Gy/s)在极短的时间内(通常不足200 ms)将照射剂量全部注入肿瘤区域^[1]。FLASH放疗在有效杀伤肿瘤细胞的同时，可减轻正常组织放射损伤。部分研究认为，氧消耗为FLASH效应的关键机制之一^[2-3]。然而，也有一些学者认为FLASH放疗的正常组织保护作用是多种因素共同作用的结果，氧消耗对FLASH效应的影响有限^[4-5]。值得注意的是，电离辐射相关氧消耗在瞬间发生，且消耗量较低，缺乏成熟、有效、直接的评价手段，这是造成氧消耗在FLASH效应中发挥的作用结论不一致的原因之一^[6-7]。最近，基于磷光淬灭的光学氧传感技术作为一种无创性体内氧测量手段，实现了对氧含量动态变化的实时监测^[8]。本研究采用Oxyphor PtG4荧光探针，探讨不同剂量率照射对组织和细胞氧消耗的影响，并分析FLASH照射的氧效应。

1. 仪器与试剂：超净台HERAGUARD ECO、恒温CO₂细胞培养箱、RPMI 1640和DMEM培养基、青链霉素、结晶紫(美国赛默飞世尔公司)。Oxyphor PtG4荧光探针、Oxy LED磷光光纤仪(美国Oxygen公司)，eRT6加速器(法国PMB-Alcen公司)，Varian TrueBeam SN1403、Varian 23CX医用直线加速器(美国瓦里安公司)，Bugbox M低氧培养箱(英国Ruskinn公司)，IC profiler测量仪(美国Sun Nuclear公司)、Gafchromic EBT3胶片和Gafchromic HD-V2胶片、FilmQA^TM Pro胶片分析系统(美国Ashland公司)，Milli-Q Integral 3超纯水仪(德国Merk公司)。

2. 实验动物及分组：nu/nu小鼠，体重18~22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(豫)2023。SPF级动物房饲养，室温维持在18~26℃，湿度控制在50%~60%，明暗交替为12 h/12 h。每种氧含量(4%、10%)实验均分为3组：对照组、常规照射组和FLASH照射组。

3. 小鼠器官和组织氧含量测量实验：采用异氟烷吸入麻醉小鼠，然后经尾静脉注射100 μl (4 mol/L)的Oxyphor PtG4荧光探针。24 h后，将Oxy LED磷光光纤仪置于不同组织与器官处，测量氧分压。

4. 小鼠移植瘤实验：以随机平行对照方法将小鼠分为两组，取人食管癌细胞KYSE510及人胶质瘤细胞U251(郑州中美荷美尔肿瘤研究院)，种植对数生长期的肿瘤细胞10⁷/100 μl于小鼠背部皮下。待肿瘤直径约为8 mm时，在皮下移植瘤、肌肉和皮肤中直接注射25 μl Oxyphor PtG4探针。采用异氟烷±氧气吸入麻醉小鼠，由eRT6加速器对小鼠实施不同剂量率(0.01~200 Gy/s)单次照射20 Gy。24 h后，测量相关部位的氧分压。观察小鼠肿瘤的生长情况。

5. 体外氧消耗测量实验：将超纯水(溶解氧＜10^-9，电导率为18.2 μS/cm)置于西林瓶，根据实验需要分别在乏氧(1%)、生理氧含量(4%)和空气氧含量(21%)的条件下放置24 h。取25 μl Oxyphor PtG4探针，移至西林瓶。分别采用0.01、20、40 Gy/s剂量率实施照射。通过Oxy LED磷光光纤仪测量氧分压的变化。

6. 克隆形成实验：取指数生长期正常细胞样品(食管上皮细胞SHEE和角质形成细胞HaCat，购自郑州中美荷美尔肿瘤研究院)，制备为单细胞悬液，接种于培养皿中(500个细胞)，分别于生理氧含量(4%)和空气氧含量(21%)及其他氧含量下培养，待细胞贴壁后更换培养液。采用美国Varian TrueBeam SN1403加速器实施常规照射(0.01 Gy/s)，改造后的Varian 23CX加速器实施FLASH照射(120 Gy/s)。照射前和照射中实施质量控制，剂量0~35 Gy。培养至可观察到肉眼可见克隆后，依次给予4%多聚甲醛固定、结晶紫染色，在显微镜下观察克隆形成情况。统计克隆形成率(%)=(克隆数/细胞接种数)×100%；细胞存活分数(surviving fraction, SF)=实验组克隆形成率/对照组克隆形成率。采用L-Q模型拟合细胞存活曲线，氧增强比(oxygen enhancement ratio, OER)为达到相同生物学效应时，缺氧条件下照射剂量/常规氧条件下照射剂量。

7. 统计学处理：采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布，以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

1. 小鼠器官和组织氧含量：监测生理状态下小鼠部分器官和组织的氧含量，如表 1所示，不同器官和组织氧含量差异较大，以移植瘤氧含量最低，肝脏氧含量最高。即实体瘤表现为乏氧状态，正常组织和器官则处于生理氧含量状态。

表 1(Table 1)

表 1 10只小鼠不同组织和器官氧含量测定(x±s) Table 1 Measurement of oxygen content in different tissues and organs of 10 mice (x±s) 参数 皮肤(真皮层) 肌肉 肺 大脑 肝脏 皮下移植瘤 氧含量(%) 3.51±0.45 3.95±0.28 5.64±0.42 4.56±0.31 6.53±0.67 1.28±0.56 氧分压(mm Hg) 25.77±3.31 28.71±2.06 41.23±3.09 33.13±2.28 55.21±4.93 8.83±4.12

表 1 10只小鼠不同组织和器官氧含量测定(x±s) Table 1 Measurement of oxygen content in different tissues and organs of 10 mice (x±s)

2. 小鼠移植瘤及正常组织氧消耗：常规照射模式下未能检测到肿瘤组织和正常器官氧消耗。在FLASH照射(平均剂量率≥40 Gy/s)模式下，观察到组织和器官存在放射性氧消耗，氧消耗量与照射剂量呈线性关系；相同照射剂量时，肿瘤组织氧消耗量最少，皮肤组织次之，肌肉组织氧消耗量最大(图 1A)。进一步拟合不同剂量率照射模式下放射性氧消耗曲线，结果表明当照射剂量率在0.3~20 Gy/s之间时，组织氧消耗急剧增加。当照射剂量率≥40 Gy/s时，组织氧消耗趋于稳定(图 1B)。

图 1 FLASH照射不同剂量(A)和剂量率(B)小鼠组织氧消耗，以及不同氧含量下肿瘤组织(C)与皮肤(D)的氧消耗 Figure 1 Tissue oxygen consumption of mice irradiated with FLASH at different doses (A) and dose rates (B), as well as the oxygen consumption of tumor tissue (C) and skin (D) under different oxygen contents

此外，当小鼠氧供应浓度增加时，皮下移植瘤及皮肤组织氧含量随之增加；而肿瘤组织氧消耗平均速率由0.1 mm Hg/Gy增加至0.2 mm Hg/Gy(P>0.05)，随着氧供应的增加，肿瘤组织氧消耗平均速率并未进一步增加。同样，皮肤组织氧消耗平均速率由0.19 mm Hg/Gy增加至0.21 mm Hg/Gy(P>0.05)，氧消耗率并未进一步随氧含量的增加而增加。

3. 小鼠移植瘤生长分析：生理氧含量(4%)及富氧(10%)条件下，常规和FLASH照射后小鼠皮下移植瘤生长情况如图 2所示。生理氧含量时，未照射小鼠皮下移植瘤正常生长，而氧供应的增加对未经照射小鼠皮下移植瘤的生长无影响(P>0.05)。生理氧含量时，与对照组相比，FLASH和常规照射后小鼠皮下移植瘤生长受到抑制(t=0.91~3.79，P＜0.01)；当氧供应浓度增加至10%时，与生理氧含量相比，小鼠皮下移植瘤生长进一步受到抑制(t=0.71~5.65，P＜0.01)。

注：a4%常规照射和FLASH照射组分别与4%对照组相比较，t=1.29~2.17，P < 0.01；b10%常规照射和FLASH照射组分别与4%常规照射和FLASH照射组相比较，t=0.96~3.58，P < 0.01；c4%常规照射和FLASH照射组分别与4%对照组相比较，t=0.91~3.79，P < 0.01；d10%常规照射和FLASH照射组分别与4%常规照射和FLASH照射组相比较，t=0.71~5.65，P < 0.01 图 2 不同氧分压时常规照射和FLASH照射后的肿瘤控制情况A.人食管癌细胞小鼠皮下移植瘤；B.人胶质瘤细胞小鼠皮下移植瘤 Figure 2 Tumor control after conventional irradiation and FLASH irradiation at different partial pressures of oxygen A. Subcutaneous xenograft model of human esophageal cancer cells in mice; B. Subcutaneous xenograft model of human glioblastoma cells in mice

4. 氧消耗体外实验：基于水辐射模型分析照射后氧消耗情况。如图 3A-C所示，常规和FLASH照射均伴随氧消耗，且随照射剂量的增加呈现线性增加；FLASH较常规照射消耗了更多的氧气，但差异无统计学意义(P>0.05)。进一步分析表明，不同氧含量条件下，常规照射氧消耗平均速率为0.16 mm Hg/Gy，而高剂量率(20 Gy/s)和FLASH照射，随氧含量的增加，氧消耗平均速率由0.16 mm Hg/Gy增加至0.18 mm Hg/Gy，之后并未随氧供应的增加而继续增加，FLASH和常规照射的氧消耗率差异无统计学意义(P>0.05，图 3D)。

图 3 不同剂量和剂量率常规及FLASH照射后的氧消耗分析体外实验 A.1%氧含量；B.4%氧含量；C.21%氧含量；D.氧含量和照射剂量率对氧消耗率的影响 Figure 3 Oxygen depletion after conventional irradiation and FLASH irradiation at different doses and dose rates in in vitro experiments A. 1% oxygen content; B. 4% oxygen content; C. 21% oxygen content; D. Effects of oxygen content and irradiation dose rate on oxygen depletion rate

5. FLASH照射后正常细胞SF和OER：如图 4所示，FLASH照射后的正常细胞SF随着细胞内氧含量降低而显著升高。氧含量相同时，FLASH照射后上皮细胞SF与常规照射差异无统计学意义(P>0.05)。当给予初始pO₂ = 29.45 mm Hg的细胞5、10、15 Gy照射剂量时，食管上皮和角质形成细胞内氧含量均降低，食管上皮细胞OER值从1.07增加到1.33、1.41；角质形成细胞OER值从1.11增加到1.26、1.29。FLASH照射后正常细胞OER值随着氧含量的下降而升高。即在较低的氧含量下，FLASH照射后正常细胞表现为放射抵抗。

图 4 不同氧含量时常规和FLASH照射后的正常细胞存活分数曲线 A. 人食管上皮细胞系SHEE；B. 人角质细胞系HaCat Figure 4 Survival fraction curves of normal cells after conventional irradiation and FLASH irradiation at different oxygen contents A. Human esophageal epithelial cell line SHEE; B. Human keratinocyte line HaCat

进一步拟合SHEE细胞FLASH照射的OER曲线，如图 5所示，在生理氧含量至乏氧状态时，FLASH照射的OER值较常规照射快速降低。这提示FLASH照射消耗更多的氧。

注：OER.氧增强比 图 5 常规和FLASH照射的氧增强比与氧分压的关系曲线 Figure 5 Curves of relationship between oxygen enhancement ratio and partial pressure of oxygen after conventional irradiation and FLASH irradiation

本研究基于小鼠和水辐射模型，采用新型磷光探针对比分析FLASH与常规照射后氧消耗情况。动物结果表明，生物体正常组织平均氧含量为3.51%~6.53%，皮下移植瘤平均氧含量为1.28%，显著低于空气氧含量；FLASH照射消耗了部分氧气，氧消耗速率在生理氧含量状态下达到最大值；相同剂量照射时，FLASH和常规照射具有相仿的肿瘤控制率，肿瘤控制率随组织氧含量升高而增加。水辐射模型表明，常规和FLASH照射均可消耗氧，常规照射氧消耗速率为0.16 mm Hg/Gy，FLASH照射氧消耗速率为0.16~0.18 mm Hg/Gy；当组织处于乏氧状态，FLASH照射的氧消耗速率降低。与常规照射相比，FLASH照射后正常上皮细胞OER降低。

大多数肿瘤模型相关的基础研究，尤其是细胞水平实验，都是在约21%的空气氧含量条件下进行的^[9]。然而，生物体内不同器官和组织的氧含量通常为3%~10%，明显低于空气氧含量，机体这种特殊的含氧状态被称为生理氧含量^[10]。而肿瘤组织由于高代谢率和快速增殖率，缺氧微环境是实体瘤的主要特征之一^[11]。Kumar等^[9]认为在临床前研究中使用的空气条件可能并不完全反映实际肿瘤环境中的氧气条件。RNA-seq分析显示不同氧含量会对肿瘤细胞的基因表达模式产生影响，处于生理氧含量下的肿瘤细胞，即使短期暴露于空气中也足以引发信号通路的变化，从而改变其生物特征性和侵袭性。进一步采用蛋白质组学分析在生理氧含量和空气氧含量条件下培养的细胞，结果显示部分细胞会根据氧气张力的变化迅速凋亡或分化。Leavitt等^[12]采用“钳夹法”和“carbogen气体法”观察小鼠器官和组织氧含量的改变，磷光探针法证实“钳夹法”降低了小鼠肿瘤组织的氧含量，而“carbogen气体法”则有效提升了小鼠正常组织和器官的氧含量。本研究采用新型磷光探针法，也证实了小鼠的正常组织和器官处于生理氧含量状态，皮下移植瘤则处于乏氧状态。在经典放射生物学中，观察到氧在低传能线密度射线和生物体相互作用中所起的作用，称为氧效应。Kacem等^[13]强调FLASH效应研究应考虑采用动物模型，以避免氧含量等因素的干扰。因此，对于电离辐射效应相关的研究，需要考虑到不同组织和器官的生理氧含量条件的影响，通过模拟这些条件，以便更好地了解射线的特性和开发更有效的放射治疗模式。

氧供应和氧消耗平衡能够影响组织细胞的生理功能^[14]。放射线在与氧分子相互作用过程中，虽然不会直接消耗氧气，但可通过一些列复杂的物理、化学反应，间接利用氧气，产生活性氧自由基，进而诱发生物学效应^[15]。临床实践中，常规照射时间多为数分钟至数十分钟不等，受到脉管系统持续不断的氧气供应的影响，常规照射过程中生物体内的氧消耗不易被检测到^[16]。Cao等^[17]基于水辐射模型，对比分析了传统电极法与新型磷光探针法，证实磷光探针法可以有效检测氧消耗。由于设备局限性，电极法仅可用于体外实验；而磷光探针法不仅能够用于体外实验，也可用于表浅部位(最大深度10~20 mm)氧含量的检测。通过构建水辐射模型，采用磷光探针检测到常规照射过程中氧消耗的发生。然而，相对于生物组织内持续的氧气供应，这种低水平的氧消耗不足以彻底耗竭细胞内氧分子。

同样，FLASH照射也伴随与氧分子相互作用，射线诱导的氧化应激作用与FLASH照射诱导正常组织放射损伤密切相关^[18]。尽管FLASH照射时间不足200 ms，Grilj等^[19]通过磷光探针快速连续监测，捕捉到FLASH照射瞬间的氧消耗，进一步分析显示，这种组织氧消耗水平不足以诱发FLASH效应。Cao等^[17]通过尾静脉注射磷光探针法分析小鼠氧消耗，常规照射过程中未观察到氧消耗，FLASH照射时正常组织氧消耗率为(0.12±0.02)mm Hg/Gy。采用直接注射磷光探针法监测到FLASH照射过程中，皮肤、肌肉和皮下移植瘤均伴随氧消耗，且氧消耗率与组织氧含量有关。

对于低传能线密度的射线来说，氧效应是放射治疗中需要考虑的一个重要因素，其相关的研究如肿瘤细胞再氧合是常规分割照射的理论基础^[16]。不同于常规照射，FLASH照射不仅采用超高剂量率，而且其治疗为单次高剂量或低分次大分割模式^[20]。采用常规放疗或立体定向放疗理论来阐述FLASH放疗的生物学效应时需谨慎。Leavitt等^[12]对小鼠皮下移植瘤实施单次20 Gy常规和FLASH放疗，并通过改变肿瘤组织氧含量的方式探讨FLASH照射的生物学效应。当氧合良好时，肿瘤对常规和FLASH放疗的敏感性均增加；当采用“钳夹法”制造急性缺氧状态时，皮下移植瘤对常规照射表现出一定的拮抗作用，然而，FLASH照射的放疗敏感性并未下调，即在急性缺氧条件下FLASH照射保留了抗肿瘤功效。本研究通过增加小鼠肿瘤组织氧含量证实FLASH放疗也存在氧效应。因此，FLASH照射所伴随的急性氧消耗并不会降低肿瘤杀伤效果，FLASH照射在肿瘤和正常组织中的氧效应目前仍处于探索阶段，有待进一步研究。

综上所述，新型磷光探针可用于检测电离辐射过程中的氧含量的动态变化，FLASH照射能够消耗氧，但氧消耗不足以完全解释FLASH效应。进行FLASH照射相关的临床前研究，尤其是细胞水平研究，需模拟生物体内正常组织和肿瘤生长微环境，以精准的解释FLASH照射的生物学机制。

利益冲突  无

志谢 感谢瑞士洛桑大学附属医院放疗科全体成员对本文的指导与帮助，感谢瑞士洛桑大学生物医学系提供的支持

作者贡献声明  罗辉、杨成梁、Paola Ballesteros-Zebadua、Javier Franco-Perez、袁期刚负责实验、数据整理分析、与论文撰写；毛荣虎、雷宏昌、孙亚楠、宋帅、马蕾杰负责部分数据及文献整理，协助论文撰写；葛红指导论文修改