放射治疗利用辐射向靶区沉积能量，实现对组织的有效杀伤，是目前肿瘤治疗的重要手段。质子等带电粒子放疗相较于传统的X、γ射线放疗，具有相对生物学效应(relative biological effectiveness, RBE)高、布拉格峰剂量集中的优势，是极具潜力的新型放疗技术^[1]，但目前仍不能完全消除对正常组织的损伤。当前，国际研究已转向更为新型的FLASH疗法，其可在非常短的时间内(< 1 s)实现辐射超高剂量率(≥40 Gy/s)的剂量递送。大量研究表明，FLASH照射可在维持常规剂量率照射等效肿瘤杀伤效果的同时，显著减轻正常组织的辐射损伤(称为FLASH效应)^[2-3]。在临床试验上，电子、光子FLASH均已有较多的应用实例，而质子FLASH的技术要求更高，目前仅有美国辛辛那提儿童医院质子治疗中心针对骨转移患者开展了FAST-01/02系列临床试验，治疗效果展现出了该技术的优越性^[4]，这使其成为极具革新意义的新一代放疗技术。

然而在更基本的机制层次上，FLASH效应的生物机制尚未厘清，氧效应、免疫效应、DNA完整性假说层出不穷^{[2, 5-6]}。深入开展质子FLASH生物机制研究至关重要。本研究旨在以人肝细胞WRL68与人肝癌细胞HepG2为研究对象，观察常规(CONV)与FLASH照射下人正常肝细胞与肝癌细胞的辐射损伤差异，并进一步分析转录组学表达谱差异，为FLASH-RT应用于肝肿瘤的临床治疗方案提供理论基础和实验依据。

1. 细胞株和细胞培养：人肝细胞WRL68、人肝癌细胞HepG2均购于大连美仑生物技术有限公司，在含10%胎牛血清(美国赛默飞世尔科技公司)、100 kU/L青霉素(大连美仑生物技术有限公司)和100 mg/L链霉素(大连美仑生物技术有限公司)的MEM培养基(美国赛默飞世尔科技公司)中，于37℃、5% CO₂条件下培养至对数生长期。

2. 细胞照射与分组：细胞生长至合适密度后，灌满培养基并接受由100 MeV强流质子回旋加速器(中国原子能科学研究院)引出的100 MeV中能质子照射，照射后倒去受照液体并重新添加培养基，放回培养箱中培养。单次照射剂量为4 Gy，射野为10 cm × 10 cm，射野内剂量均匀性优于95%。细胞随机分为对照组(不照射)、常规剂量率(CONV)组(0.8 Gy/min)、FLASH组(40 Gy/s)。

3. 细胞增殖检测：细胞以4 000/孔的密度接种于96孔板中，设置6个平行样本，在37℃、5% CO₂培养箱环境下培养；在照射后24、48、72 h，向96孔板对应细胞孔中加入10 μl的CCK-8试剂，在培养箱中静置2 h后用酶标仪在450 nm处测量吸光度(A)值，具体操作参照北京北仁化学公司CCK-8试剂盒说明书。

4. 细胞凋亡检测：设置3个平行样本，在照射后24、48、72 h，收集细胞并使用稀释的binding buffer配置细胞浓度约5×10⁵/ml的细胞悬液，用荧光素异硫氰酸酯(Annexin Ⅴ-FITC)和碘化丙啶(PI)溶液染色后避光孵育15 min, 即刻使用流式细胞仪检测细胞凋亡，具体操作参照北京北仁化学凋亡试剂盒说明书。

5. 细胞周期检测：设置3个平行样本，在照射后24、48、72 h，收集细胞并加入4℃的75%乙醇溶液固定过夜。检测前用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，视细胞量加入约50~200 μl的PI染色液，避光孵育15 min后即刻使用流式细胞仪检测细胞周期。

6. 转录组测序与信号通路分析：在照后24 h后除去培养基并加入1 ml TRIzol，反复吹打以裂解细胞后收集RNA。提取的RNA于-80℃保存并送样待检。RNA文库制备与测序由上海欧易生物医学科技有限公司完成：使用VAHTS Universal V5 RNA-seq Library Prep试剂盒依照说明书构建转录组文库，采用llumina Novaseq 6000测序平台对文库进行测序，并生成150 bp双端reads。使用约翰霍普金斯大学研发的开源HISAT2软件进行参考基因组比对，进行基因表达量(FPKM)计算，并通过HTSeq-count获得每个基因的reads计数。利用DESeq2软件进行差异表达基因分析，其中符合Q < 0.05且foldchange>2或foldchange < 0.5阈值的基因被定义为差异表达基因(DEGs)。随后，基于超几何分布算法对差异表达基因进行基因本体(Gene Ontology, GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析，用于筛选显著性富集功能条目。

7. 统计学处理：采用Matlab软件进行统计分析，符合正态分布的数据以x±s形式表示，数据符合方差齐性者，多组间差异比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

1. FLASH及CONV照射对细胞增殖活力的影响：结果如表 1所示，两种细胞的增殖活力随辐照模式的变化呈现相反的趋势。由表 1可知，常规剂量率照射对人肝细胞WRL68增殖改变不明显，在短期内存在增殖活力小幅度增加，但72 h后与对照组处于同一水平；而FLASH照射在24、48、72 h均显著增加了细胞增殖活力(t=13.99、10.18、16.67，P < 0.01)。而对于肝癌细胞，在24 h后两类辐射都未显著影响肝癌细胞增殖活力，在照射后48、72 h，常规剂量率照射显著抑制肝癌细胞增殖活力，而FLASH照射相较于常规照射更进一步提高了肝癌细胞增殖抑制水平(t=2.57、9.39，P < 0.05)。

表 1(Table 1)

表 1 不同照射情况下细胞增殖活力情况(x±s) Table 1 Proliferative activities of cells under different irradiation conditions (x±s) 组别 样本数 WRL68细胞 HepG2细胞 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 对照组 6 0.012±0.002 0.016±0.003 0.030±0.007 0.079±0.011 0.159±0.031 0.177±0.027 CONV组 6 0.019±0.005a 0.024±0.003a 0.028±0.001a 0.073±0.018a 0.113±0.019a 0.147±0.019a FLASH组 6 0.045±0.005a 0.054±0.007a 0.152±0.017a 0.078±0.006a 0.073±0.012a 0.07±0.008a 注：a与对照组相比，t=2.86、13.99、4.37、10.18、0.75、15.67、0.48、0.11、1.35、2.57、1.58、9.39，P < 0.05

表 1 不同照射情况下细胞增殖活力情况(x±s) Table 1 Proliferative activities of cells under different irradiation conditions (x±s)

2. FLASH及CONV照射对细胞凋亡率的影响：结果如图 1所示，对于人肝细胞WRL68，常规剂量率照射在照后24、48、72 h均显著提高了细胞凋亡率(t=3.59、10.53、13.79，P < 0.05)，而FLASH照射组在照后24、48 h虽相较于对照组凋亡率显著提升(t=3.21、8.30，P < 0.05)，但低于常规剂量率照射水平。而对于肝癌细胞HepG2，FLASH照射组在24、48、72 h均相较于CONV组更进一步促进了凋亡率的升高(t=3.25、66.70、6.09，P < 0.05)。

注：与对照组比较，at=3.59、10.53、13.79、3.21、8.30，P < 0.05；at=5.47、8.19、3.25、66.70、6.09，P < 0.05 图 1 不同照射情况下WLR68(A)和HepG2(B)细胞凋亡率变化 Figure 1 Apoptosis rates of WLR68 (A) and HepG2 (B) cells under different irradiation conditions

注：a与对照组相比，t=3.12~65.10，P < 0.05；b与CONV组相比，t=3.51~13.36，P < 0.05 图 2 不同处理组照后不同时间WRL68与HepG2细胞周期阻滞情况A-C分别为WRL68照后24、48、72 h；D-E分别为HepG2照后24、48、72 h Figure 2 Cell cycle arrest of WRL68 and HepG2 cells at different times after proton irradiation in the three treatment groupsA-C. WRL68 at 24, 48, 72 h after irradiation; D-E. HepG2 at 24, 48, 72 h after irradiation

3. FLASH及CONV照射对细胞周期的影响：结果如图 3所示。对于人肝细胞WRL68，常规剂量率辐照在24 h时即引起严重的G₂期阻滞，与对照组相比由15.89%提升至64.67%(t=60.6，P < 0.01)，48 h后有所缓解但仍未解除(占比51.22%)，72 h后几乎无变化(占比50.43%)。而FLASH照射组损伤规律基本一致，但阻滞占比与CONV组相比较低：在24 h时G₂期阻滞细胞占比为57.63%(x_CTRL=15.89%，t=65.1，P < 0.01；x_CONV=64.67%，t=7.08，P < 0.01)，至72 h后回落到48.39%(x_CTRL=12.68%，t=60.39，P < 0.01)，但阻滞仍未解除。

注：CONV.常规剂量率；FLASH.超高剂量率；CTRL.对照 图 3 不同照射情况下WRL68(A)和HepG2(B)细胞差异表达基因分布图 Figure 3 Distribution of differentially expressed genes in WRL68 (A) and HepG2 (B) cells under different irradiation conditions

对于肝癌细胞HepG2，常规剂量率照射在24 h时出现小幅度的周期由G₁期向G₂期移动，至48 h时出现较为显著的G₂期阻滞，与对照组相比由13.89%提升至56.31%(t=15.00，P < 0.01)，72 h时几乎无缓解。FLASH照射对肝癌细胞周期影响趋势与CONV组基本一致，48h时G₂期阻滞细胞占比为45.17%，低于CONV组(x_CTRL=13.89%，t=12.52，P < 0.01；x_CONV=56.31%，t=5.00，P < 0.05)。

4. FLASH及CONV照射人肝细胞及肝癌细胞基因表达谱的影响：通过转录组测序对FLASH组、CONV组及对照组进行RNA Seq分析，差异表达基因韦恩见图 3。

结果显示对于正常人肝细胞WRL68，在FLASH组与对照组间共发现2 662个差异表达基因，其中上调1 788个，下调874个；在CONV组与对照组间共发现1 930个差异表达基因，其中上调981个，下调949个；在FLASH组与CONV组间共发现906个差异表达基因，其中上调640个，下调266个。3组间交集差异表达基因54个，其中KCNN3上调幅度最大，ALB下调幅度最大。KCNN3即钙激活钾通道亚家族S成员3基因，主要与神经元调控与神经系统疾病相关；ALB即白蛋白基因，主要与肝脏区域的白蛋白合成相关，指示着肝功能受损情况。而FLASH组与CONV组之间的差异表达基因在GO功能上包括发生上调的生物进程中细胞对氧化低密度脂蛋白反应、细胞黏附等，细胞组分中的细胞质膜、树突及突触等，分子功能中的钙离子结合与DNA结合转录因子活性等；以及发生下调的生物进程中的急性期反应与内肽酶负调控等，细胞组分中的血液微粒、内质网腔和细胞外基质等，分子功能中的细胞外基质/染色质结构成分、碱性磷酸酶活性等。在KEGG水平上主要与上调的钙离子信号通路、细胞黏附因子、Rap1/MAPK信号通路及下调的铁死亡、缺氧诱导因子1、肾素分泌等信号通路相关，见图 4A。

图 4 WRL68(A)与HepG2(B)细胞在FLASH与CONV组之间的差异基因mRNA的KEGG通路分析 Figure 4 KEGG pathway analysis of differential gene mRNA in WRL68 (A) and HepG2 (B) cells between FLASH and conventional dose rate groups

对于人肝癌细胞HepG2，在FLASH组与对照组间共发现3 190个差异表达基因，其中上调2 261个，下调929个；在CONV组与对照组间共发现921个差异表达基因，其中上调710个，下调211个；在FLASH组与CONV组间共发现1 243个差异表达基因，其中上调711个，下调532个。3组间交集差异基因103个，其中COL10A1上调幅度最大，RTL8A下调幅度最大。COL10A1是编码X型胶原蛋白α1链的基因，主要与多种骨骼疾病的发生相关；RTL8A即反转录转座子Gag样蛋白8A基因，其具体的生物学功能尚未完全明确，但研究提示其可能通过影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为，参与肿瘤的病理过程。FLASH组与CONV组之间的差异表达基因在GO功能上包括发生上调的B细胞活化负调控、同嗜性细胞黏附等，细胞组分中的细胞质膜、树突及细胞外空间等，分子功能中的钙离子结合、碳-氮相关的水解酶活性及蛋白质隔离活性等；以及发生下调的生物进程中的胆固醇生物合成及稳态、有丝分裂胞质分裂与纺锤体中间区组装等，细胞组分中的纺锤体、纺锤体微管与CMG复合物等，分子功能中的脂肪酸连接酶活性与细胞骨架结构成分等。在KEGG水平上主要与上调p53、Rap1、钙离子信号通路、蛋白质消化与吸收信号通路及下调的细胞周期、AMPK、胆固醇代谢与类固醇物质生成通路相关，见图 4B。

2014年Favaudon等^[7]在体内系统模型的临床前研究中观察到与传统的分钟剂量率辐射相比，FLASH疗法可以有效降低放射肺纤维化损伤指数。自此之后FLASH放疗成为了国际放疗领域的前沿热点，多次动物实验及临床试验证实了FLASH效应对正常组织损伤较小^[8]。作为我国发病率第4位、死亡率第2位的恶性肿瘤，肝癌在放射治疗后还可能引发放射性肝炎等并发症^[9]。因此，本研究拟分析新型FLASH-IR对人肝细胞及肝癌细胞的损伤差异，为FLASH-RT应用于肝癌临床治疗提供关键数据。

本研究结果显示，相较于传统放疗常使用的0.8 Gy/min的剂量率辐照，超高剂量率质子辐射对人肝细胞及肝癌细胞产生了显著的差异效应。对于人肝细胞，在4 Gy辐照剂量下，常规剂量率辐照极小幅度地促进了肝细胞增殖，而FLASH辐照表现出显著的正常组织保护作用，极大程度地促进了肝细胞增殖。低剂量下的辐射促进细胞增殖活力小幅度增加在碳离子等实验中已得到证实^[10]，这可能是由于小剂量辐射激发了人肝细胞中本不表现的端粒酶活性^[11]，而FLASH剂量率辐射可能通过适度的活性氧刺激，进一步激活线粒体功能变化，促使端粒酶由细胞核转位到线粒体^[12]，进一步调控细胞活力变化，这也一定程度上解释了FLASH照射相较于CONV照射出现凋亡拮抗的作用^[13]。同时，辐射必然会导致DNA损伤，部分难以修复的损伤将通过凋亡等形式诱导损伤细胞死亡，从而使得两种照射情况下细胞凋亡率均有所提升。而研究表明FLASH照射引发的DNA损伤可能数量更少或更易被修复，仅有小部分损伤难以修复需要通过凋亡诱导死亡，因此凋亡水平低于CONV照射。

肝癌细胞在常规剂量率照射下呈现增殖抑制、凋亡率提高及周期表现上显著的G₂/M期阻滞，这与已有研究证实的辐射损伤相一致^[14-15]。通常认为FLASH剂量率与常规剂量率辐照在癌细胞的杀伤效率方面基本等效，而本研究结果表明在FLASH剂量率下，肝癌细胞HepG2可能受到更严重的损伤。在细胞功能表现上，相较于常规剂量率照射，质子FLASH照射后肝癌细胞HepG2增殖活力受到显著抑制且几乎不随时间变化，始终低于对照组初始水平；同时凋亡率显著增高，代表着FLASH-IR导致的肝癌细胞DNA损伤模式更为复杂或引发的错误修复更多，从而诱导较多细胞程序性死亡。质子FLASH对肝癌细胞的额外杀伤效果一方面可能是由于其辐射敏感性导致的，另一方面可能是由于特定因子在此条件下的过量表达。转录组测序结果表明，肝癌细胞与正常肝细胞在质子FLASH照射下的差异表达基因主要与细胞黏附、免疫响应、p53通路或其他受氧化应激调控的信号通路相关，这与目前主流理论相契合，一定程度上指示了癌细胞额外杀伤效能的可能机制。如研究表明，质子辐射可能改变HepG2细胞的质膜超微结构，并导致线粒体中的ROS过量产生^[15]。FLASH-IR可能进一步致使肝癌细胞中过量产生难以代谢的有机氢过氧化物，从而对细胞线粒体产生较大损伤^[16-18]，进一步导致细胞失去部分周期点检查与DNA损伤修复能力，使得细胞处于大量死亡状态。

在差异表达基因水平上，FLASH组与CONV组相对比，人正常肝细胞在细胞外基质与受体相互作用(ECM-receptor interaction)信号通路上呈现下调趋势，而肝癌细胞则呈现上调趋势。而在细胞黏附分子(cell adhesion molecule)与Rap1信号通路上，两细胞均呈现上调趋势。Rap1信号通路与cAMP信号通路直接相关，不仅可以通过调节整合素的活性，影响细胞与细胞外基质之间的黏附作用，进一步影响细胞存活、增殖和分化；还可以增强整合素与配体的亲和力，促进细胞黏附^[19]。同时，相关信号通路与免疫系统激活和神经系统功能密切相关，相关通路的激活可以使淋巴细胞能够准确地迁移到炎症部位，与抗原呈递细胞相互作用，启动免疫应答^[20]；并参与调节神经元的发育和功能，对学习、记忆等认知过程具有重要意义，这与FLASH-IR对小鼠认知保护的研究结果相一致^[21]。上述结果提示，细胞黏附可能是FLASH-RT的重要微观作用渠道。

另一方面，氧耗竭理论目前仍是FLASH效应机理探索中的重要假说。假说认为FLASH剂量率辐照能快速消耗正常组织内的氧分子，并限制活性氧自由基的产生，使得正常组织处于缺氧的辐射抵抗状态中^[19]。斑马鱼实验表明，FLASH照射下生物体内的活性氧与超氧化物歧化酶等确实有所降低^[22]。基于小鼠的分子学研究也表明，小鼠肝脏在接受FLASH照射后，信号转导与转录激活因子Stat1等表达显著提高^[23]。Stat1作为氧化还原敏感蛋白，与免疫功能、细胞生长、分化及凋亡息息相关，该因子的差异表达可能是调控人肝细胞与肝癌细胞差异表现的重要因素之一。而本研究所挖掘的正常肝细胞在FLASH照射下，HIF-1即缺氧诱导因子1信号通路出现显著下调，该通路的适度下调可避免因HIF-1过度激活引发的代谢紊乱，在代谢方面会减少糖酵解相关基因表达，使细胞代谢模式调整；而对于癌细胞，KEGG水平分析表明相较于CONV照射，FLASH照射在p53通路上有所上调。p53相关通路作为典型癌症抑制通路呈现上调现象，从而显著抑制癌细胞活性，并可能造成额外损伤。研究表明，p53在FLASH-IR中可能呈现与时间振荡相关的表达量，并受氧含量相关参数影响^[24-26]，其信号通路中互相调控的MDM2/MDMX等基因表达也存在显著变化，并在后续通过相关的Caspase3、TGF-β、Cyclin D1等调节细胞周期、凋亡及增殖水平^[27-28]。

综上所述，本研究对超高剂量率质子辐射下的人肝细胞与肝癌细胞的辐射效应进行了比较研究，结果表明相较于传统的分钟级剂量率辐射，40 Gy/s的超高剂量率质子辐射对人肝细胞的损伤相对较轻，同时对肝癌细胞的多指标辐射损伤更为显著，多种差异表达基因相关功能分析表明，其表现可能与细胞黏附、p53或其他受氧化应激调控的信号通路相关，证实了质子FLASH开展临床肝癌治疗的应用潜力。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  汪越负责实验设计、数据处理和论文撰写；王巧娟、刘建成、苏鹏、黄志豪协助实验；隋丽指导论文修改