2025, Vol. 45
2. 中国原子能科学研究院, 北京 102413
2. China Institute of Atomic Energy, Beijing 102413, China
肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)起源于肾小管上皮，是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，约占所有肾脏恶性肿瘤的90%。晚期RCC患者5年生存率仅为12%~15%，1/3的RCC患者在诊断时存在广泛的转移[1]。晚期肾癌对放疗和化疗的敏感性差，且肾脏附近器官众多，对放射的耐受力较弱，预后常常不理想。超高剂量率放射治疗，立体放射定向治疗等技术的出现和发展，给RCC患者提供了新的治疗机会和选择[2]。
超高剂量率照射(≥40 Gy/s)采用的照射剂量率为常规照射(conventional dose rate irradiation，CONV)的100~1 000倍，FLASH照射即为一种基于超高剂量率照射的特定照射模式，与常规照射相比，能明显减轻正常组织损伤，同时保留对肿瘤的杀伤能力，称之为“FLASH效应”[3]。2023年的一项临床试验中，质子FLASH照射治疗四肢骨转移癌患者的效果符合预期，且无明显的不良反应[4]。质子FLASH应用于临床具有巨大的潜力。然而，质子FLASH效应的生物学机制尚不十分明确，对于肾癌细胞的作用也不清楚。因此，本研究首次采用人肾癌细胞为研究对象，探索质子FLASH照射和常规照射在肾癌中的作用机制，为质子FLASH照射治疗肾癌患者提供新思路。
材料与方法1. 主要试剂和仪器：人肾癌细胞769-P(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。DMEM、胎牛血清和RNase A(上海迈基生物公司)；总RNA提取试剂TRIzol、RNA反转录试剂盒和高灵敏性染料法定量PCR检测试剂盒(南京诺唯赞生物公司)；碘化丙啶(propidium iodide，PI)、RIPA裂解液、电化学发光(ECL)试剂盒、山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG(H+L)(上海碧云天生物公司)；CyclinB1、P53、P21抗体(美国Cell Signaling公司)；CyclinD1、BCL2、BAX抗体(美国Proteintech公司)；GSDMD-F(美国Affinity公司)；GSDME-F/N和GSDMD-N(英国Abcam公司)；β-肌动蛋白(上海迈基生物公司)。流式细胞仪(德国Beckman CytoFLEX)；Western blot显影系统(美国BioRad公司，Mini-PROTEAN)；荧光定量PCR仪(美国BioRad公司，CFX96 Touch)。
2. 细胞培养与照射：使用含10%胎牛血清的DMEM培养基, 在37℃、5% CO2培养箱常氧条件培养。提前1 d将细胞种植到T25培养瓶中(1×106个/瓶)，待细胞密度至60%~70%时，将细胞随机分为3组：质子FLASH照射(FLASH-IR)组以40 Gy/s的剂量率对细胞进行单次8 Gy质子线照射；常规照射(CONV-IR)组以0.4 Gy/s的剂量率对细胞进行单次8 Gy质子线照射，其他条件相同；对照(Ctrl)组不照射。利用中国原子能科学研究院北京串列加速器核物理国家实验室CYCIAE-100平台进行照射[5]。
3. 细胞周期实验：细胞沉淀用预冷的70%乙醇固定4℃过夜，预冷的PBS洗涤两次，加入1 μg/ml的RNaseA溶液37℃孵育30 min，之后加入50 μg/ml的PI染色液室温避光孵育30 min，使用流式细胞仪分析样品。
4. 实时荧光定量聚合酶链式反应检测(RT-qPCR)：提取总RNA并利用反转录试剂盒反转录成cDNA，然后进行实时荧光定量PCR检测，条件为95℃ 10 min；95℃ 10s，60℃ 20s，40个循环。q-PCR引物序列见表 1，β-肌动蛋白作为内参照基因，采用2-ΔΔCt方法计算相对基因表达。
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表 1 qPCR引物序列 Table 1 Sequences of qPCR primers |
5.蛋白免疫印迹(Western blot)实验检测：使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液对样品进行裂解，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离等量的总蛋白，然后将其转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用含5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐溶液(TBST)封闭1 h，TBST洗膜3次，一抗(BCL2、P53、P21、β-肌动蛋白抗体为1∶1 000，而BAX抗体为1∶10 000)4℃孵育过夜。回收一抗，TBST洗膜3次，二抗(1∶3 000)室温孵育1h，TBST洗膜3次，进行发光反应显影。
6. 统计学处理：采用SPSS 27.0软件进行数据分析，用GraphPad Prism8.0进行作图，数据符合正态分布、方差齐，以x±s表示。组间比较采用单因素方差分析，LSD法进行两两比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。
结果1.质子FLASH-IR和CONV-IR对肾癌细胞周期的影响：结果如图 1，与对照组相比，FLASH-IR组G0/G1期的细胞比例升高(t = -63.99，P＜0.05)，CONV-IR组的细胞比例降低(t =27.85，P＜0.05)；FLASH-IR组和CONV-IR组S期的细胞比例均降低(t =10.50、17.24，P＜0.05)；FLASH-IR组G2/M期的细胞比例降低而CONV-IR组的细胞比例升高(t =11.26、-29.17，P＜0.05)。进一步通过Western blot实验验证发现，与对照组相比，FLASH-IR组的cyclinD1蛋白表达量降低(t =24.92，P＜0.05)，而CONV-IR组的cyclinD1蛋白表达量无明显差异(P＞0.05)；FLASH-IR组和CONV-IR组的cyclinB1蛋白表达量均降低(t =52.96、70.56，P＜0.05)。以上结果表明，质子FLASH-IR使G0/G1期肾癌细胞比例增加，而常规照射使G2/M期肾癌细胞比例增加。
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注：a与Ctrl组比较，t =-63.99、27.85、10.50、17.24、11.26、-29.17、24.92、52.96、70.56，P＜0.05 图 1 质子FLASH照射和常规照射肾癌细胞24 h后对细胞周期的影响A-B. 流式分析图及数据统计图；C. cyclinD1和cyclinB1的蛋白表达；D. 蛋白表达量统计图 Figure 1 Effects on cell cycle after 24 h of proton FLASH-IR and CONV-IR of renal cancer cells A-B. Flow cytometry and data statistics charts; C. Protein expression of cyclinD1 and cyclinB1; D. Protein expression statistics chart |
2.质子FLASH-IR和CONV-IR对肾癌细胞凋亡的影响：细胞周期实验中观察到常规照射之后部分细胞发生凋亡，因此进一步进行了凋亡相关实验的检测。如图 2A，与对照组相比，FLASH-IR组BCL2的mRNA表达量差异无统计学意义(P＞0.05)，CONV-IR组BCL2的mRNA表达量降低(t =6.11，P＜0.05)，FLASH-IR组与CONV-IR组相比，BCL2的表达量有所上升(t = -5.04，P＜0.05)；与对照组相比，FLASH-IR组和CONV-IR组的BAX的mRNA表达量均上升(t = -4.60、-5.01，P＜0.05)，但两组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。如图 2B，BCL2的蛋白表达变化与其在mRNA水平的表达一致，CONV-IR组BCL2的蛋白表达较对照组降低(t =3.18，P＜0.05)，而FLASH-IR组较对照组差异无统计学意义(P＞0.05)，但FLASH-IR组较CONV-IR组BCL2的蛋白表达有所上升(t = -3.80，P＜0.05)；BAX的蛋白表达变化与其在mRNA水平的表达基本一致，FLASH-IR组和CONV-IR组的BAX蛋白表达量较对照组均升高(t = -20.08、-16.24，P＜0.05)，并且FLASH-IR组的表达量高于CONV-IR组(t = -11.75，P＜0.05)。上述结果表明，质子FLASH-IR和CONV-IR均会导致肾癌细胞发生凋亡，但对比CONV-IR，质子FLASH-IR引起的细胞凋亡较少。
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注：a与Ctrl组比较，t =6.11、-4.60、-5.01、3.18、-20.08、-16.24，P＜0.05；b与CONV-IR组比较，t=-5.04、-3.80、-11.75，P＜0.05 图 2 质子FLASH照射和常规照射肾癌细胞24 h后对细胞凋亡的影响A. BCL2和BAX mRNA表达量；B. BCL2和BAX的蛋白表达；C. BCL2和BAX蛋白表达量统计图 Figure 2 Effects on apoptosis after 24 h of proton FLASH-IR and CONV-IR of renal cancer cells A. mRNA expression of BCL2 and BAX; B. Protein expression of BCL2 and BAX; C. Statistics chart of BCL2 and BAX protein expression |
3.质子FLASH-IR和CONV-IR后P53、P21变化：在mRNA水平，与对照组相比，FLASH-IR组和CONV-IR组的P53和P21的mRNA表达量均升高(P53: t = -5.18、-8.43，P＜0.05；P21:t = -8.63、-14.18，P＜0.05)，且FLASH-IR组与CONV-IR组相比，P53和P21的mRNA的表达量减低(t = 6.10、14.03，P＜0.05)。在蛋白水平，如图 3A、B所示，与对照组相比，CONV-IR组的P53和P21的蛋白表达量均上调(t = -9.74、-16.86，P＜0.05)，FLASH-IR组略有增加，但差异无统计学意义(P＞0.05)。但FLASH-IR组与CONV-IR组相比，P53和P21的蛋白表达量下调(t = 7.93、9.20，P＜0.05)。上述结果表明，常规照射激活了P53/P21通路。
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注：a与Ctrl组比较，t =-9.74、-16.86，P＜0.05；b与CONV-IR组比较，t =7.93、9.20，P＜0.05 图 3 质子FLASH照射和常规照射后P53、P21变化A. P53和P21的蛋白表达；B. 蛋白表达量统计图 Figure 3 Changes in P53 and P21 after proton FLASH-IR and CONV-IR A. Protein expression of P53 and P21;B. Statistics chart of protein expression |
4.质子FLASH-IR和CONV-IR对肾癌细胞焦亡的影响：GSDMD和GSDME是细胞发生焦亡的两种关键执行蛋白，如图 4，质子FLASH-IR和CONV-IR后，GSDMD全长(GSDMD-F)的蛋白表达量均降低(t =13.95、20.18，P＜0.05)，GSDME全长(GSDMD-F)的表达量无明显变化(P＞0.05)，而GSDMD和GSDME的氨基端(GSDMD-N、GSDME-N)的表达量均升高(GSDMD-N: t = -21.50、-3.26，P＜0.05；GSDME-N: t = -41.62、-23.36，P＜0.05)。结果表明，质子FLASH-IR和CONV-IR均诱导肾癌细胞发生了焦亡。与CONV-IR组相比，FLASH-IR组的GSDMD-N的蛋白表达量进一步升高(t = -10.46，P＜0.05)，表明与CONV-IR相比，质子FLASH-IR进一步促进了细胞焦亡。
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注：a与Ctrl组比较，t =13.95、20.18、-21.50、-3.26、-41.62、-23.36，P＜0.05；b与CONV-IR组比较，t =-10.46，P＜0.05 图 4 质子FLASH-IR和CONV-IR对肾癌细胞焦亡的影响A. GSDMD-F/N、GSDME-F/N的蛋白表达；B. 蛋白表达量统计图 Figure 4 Effects on pyroptosis after 24 h of proton FLASH-IR and CONV-IR of renal cancer cells A. Protein expression of GSDMD-F/N and GSDME-F/N; B. Statistics chart of protein expression |
讨论
肾癌细胞是对常规放射治疗最耐受的细胞之一，从而限制了常规放射治疗在肾癌中的应用。随着技术的进步，发现立体定向体部放疗等高剂量放疗可显著提高肾癌的放疗敏感性[2]。FLASH照射作为一项新兴的放疗技术，在控制肿瘤的同时，能够保护机体正常的组织[6]。课题组前期研究显示，FLASH照射能够减轻肠癌小鼠模型的肠道损伤[7]。Iturri等[8]也证实质子FLASH-IR能够治疗大鼠脑胶质瘤，并且具有神经保护作用。然而尚未有研究探索质子FLASH照射对肾癌的影响。
本项研究发现，质子FLASH-IR和CONV-IR均会影响肾癌细胞的细胞周期变化。与对照组相比，质子FLASH-IR使G0/G1期的肾癌细胞比例增加，而CONV-IR主要使G2/M期的肾癌细胞比例增加。细胞周期由细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)和CDK抑制剂(CKIs)调控。在G0/G1期，细胞周期蛋白D1(cyclin D1)结合并激活周期蛋白依赖性激酶CDK4，促进细胞周期有G1期进入S期，开始DNA合成；而在G2/M期，细胞周期蛋白B1(cyclin B1)与周期蛋白依赖性激酶CDK1形成复合物，促进细胞有丝分裂[9]。质子FLASH-IR后cyclin D1蛋白表达降低, CONV-IR后cyclin B1蛋白表达减少，也进一步说明质子FLASH-IR使G0/G1期的肾癌细胞比例增加，而CONV-IR主要使G2/M期的肾癌比例增加。细胞周期检查点的激活和恢复是一个高度动态的过程，照射后的时相分布差异可能反映了不同时间点的阻滞或恢复状态。照射后24 h取样仅能捕捉到这一瞬时的周期分布。已有研究证明常规辐射24 h后使肿瘤细胞阻滞在G2/M[10]，本研究与其一致。但本研究观察到FLASH照射24 h肾癌细胞G0/G1期比例显著增加，这一现象可能源于两种机制：FLASH-IR直接激活G0/G1期检查点或细胞早期停滞于G2/M期后部分恢复并进入G0/G1期。
细胞周期调控与细胞凋亡密切相关，细胞周期调控的异常可能导致细胞周期进程受阻，从而引发细胞凋亡[11]。在使用流式细胞术测细胞周期的实验中，观察到CONV-IR会引起部分细胞的死亡，因此进一步研究了两种照射方式对细胞凋亡的影响。与对照组相比，CONV-IR后肾癌细胞BCL2的表达量降低，质子FLASH-IR后无明显变化，而BAX的表达量均升高，说明CONV-IR和质子FLASH-IR均促进肾癌细胞凋亡。Han等[12]也发现FLASH-IR会导致正常成纤维细胞凋亡。但本研究观察到，与CONV-IR相比，质子FLASH引起的凋亡比例较低。
P53是一种肿瘤抑制因子，调节多种细胞功能，包括促进细胞凋亡和衰老，抑制细胞生长、迁移和侵袭。P21是P53下游的一个靶点，在细胞生长停滞和细胞衰老中发挥重要作用。很多研究表明，P53/P21复合物通过靶向BCL2家族蛋白调控癌细胞侵袭和凋亡[13]。Wang等[14]发现过表达lncRNA LOC101927668会募集hnRNPD进而破坏RBM47/P53/P21信号通路促进结直肠癌的进展。本研究发现，CONV-IR和质子FLASH-IR均会引起P53和P21在mRNA水平上的表达增加；而在蛋白水平，CONV-IR与对照组相比有差异，CONV-IR组与质子FLASH-IR组存在差异，而质子FLASH-IR组与对照组之间没有差异。这可能也是两者引起细胞凋亡程度不同的原因，但其中的机制还有待进一步挖掘。
细胞焦亡是一种由gasdermin家族介导的炎症性的细胞程序性死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，细胞内容物释放进而引起强烈的炎症反应。gasdermin D(GSDMD)和gasdermin E(GSDME)是其家族的两个主要成员，焦亡发生时，GSDMD和GSDME发生剪切，氨基端聚集到细胞膜上打孔，使细胞破裂[15]。Zhang等[16]发现CONV-IR可以诱导焦亡发生，进而引起放射性肺损伤。Yang等[17]发现FLASH-IR可以同时诱导肿瘤干细胞发生凋亡、焦亡和坏死。Shi等[18]发现使用X射线FLASH-IR小鼠，可以减少肠隐窝焦亡的发生。本研究发现质子FLASH-IR和CONV-IR能同时激活GSDMD和GSDME两个效应蛋白, 诱导肾癌细胞发生焦亡。并且与CONV-IR相比，质子FLASH-IR引起的焦亡程度更强。质子FLASH-IR和CONV-IR调控肾癌细胞焦亡的分子机制以及焦亡程度的差异是否会放大质子FLASH-IR在肾癌中的作用仍需要更多的实验证明。
本研究主要在细胞层面探讨了质子FLASH-IR和CONV-IR对肾癌细胞周期和死亡的影响，但体外细胞模型缺乏体内真正的三维组织结构，缺乏肿瘤细胞与其他细胞(尤其是免疫细胞)的相互作用以及动态的细胞外基质，无法模拟人体内复杂的微观和宏观环境，因此在指导质子FLASH-IR应用于临床肾癌治疗方面具有一定的局限性。因此，在后续的研究中，将增加类器官模型和小鼠模型，模拟体内的环境，进一步探索质子FLASH-IR和CONV-IR对肾癌的影响。
综上所述，质子FLASH-IR和CONV-IR均能影响肾癌细胞周期变化，导致肾癌细胞凋亡和焦亡。FLASH-IR使G0/G1期的肾癌细胞比例增加，而CONV-IR主要使G2/M期的肾癌细胞比例增加。CONV-IR激活P53/P21通路，可能参与调控细胞凋亡。与CONV-IR相比，质子FLASH-IR后肾癌细胞凋亡比例降低，而细胞焦亡比例升高。质子FLASH-IR和CONV-IR调控肾癌细胞焦亡的分子机制有待进一步探索。质子FLASH-IR在肾癌治疗中具有潜在的应用价值。
利益冲突 无
作者贡献声明 张俊负责实验操作、论文撰写；张俊、张思倩负责数据处理与分析；王巧娟、隋丽负责仪器操作和样本制备；张永胜、曹志飞负责实验设计、论文审阅和修订
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