2025, Vol. 45
2. 中山大学-国科离子放射治疗前沿技术联合实验室, 广州 510060;
3. 福建医科大学附属协和医院放射治疗科, 福州 350001;
4. 兰州泰基离子技术有限公司, 兰州 730000;
5. 中国科学院近代物理研究所, 兰州 730000
2. United Laboratory of Frontier Radiotherapy Technology of Sun Yat-sen University & Chinese Academy of Sciences Ion Medical Technology Co., Ltd., Guangzhou 510060, China;
3. Department of Radiotherapy, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China;
4. Lanzhou Ion Therapy Co., Ltd., Lanzhou 730000, China;
5. Institute of Modern Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China
超高剂量率辐照(FLASH-RT)是一种近年来快速发展的肿瘤放射治疗技术。FLASH-RT以平均剂量率≥40 Gy/s进行治疗照射[1]，相较于常规剂量率辐照(conventional dose rate radiation，CONV-RT)，其在保证肿瘤控制率的基础上显著减少了正常组织的损伤[2-3]。重离子放疗(heavy ion radiotherapy，HIRT)以其独特的布拉格峰特性与高线性能量传递(linear energy transfer，LET)优势在实体肿瘤治疗中展现出显著的局部控制优势[4-5]，但高LET效应可能加剧肠道上皮细胞损伤[4, 6]，导致急性放射性肠炎等不良反应和潜在致癌效应[7]。目前，FLASH-RT的临床前研究和临床试验主要基于电子和质子射线开展[8-11]，重离子FLASH-RT的生物效应研究较少，且其机制尚未明确[12-13]。本研究基于健康C57BL/6J小鼠模型，设置FLASH-RT组(100 Gy/s)与CONV-RT组(0.1 Gy/s)，探究碳离子FLASH-RT后小鼠急性肠道损伤及其保护机制，以期为腹部与盆腔肿瘤的重离子治疗提供新的策略。
材料与方法1.实验动物及分组：采用27只C57BL/6J健康小鼠，雌性，6~8周龄，体质量18~20 g，购自广东维通利华公司，生产许可证号：SCXK(粤)2022-0063。饲养在(23±1)℃、湿度为50%~70%、12 h光照/12 h黑暗周期的环境下，5只/笼饲养。本研究通过中山大学肿瘤防治中心动物实验中心实验动物伦理会的审核(审批号：L102042024070H)。对小鼠腹部注射1.25%三溴乙醇(0.02 ml/g，南京爱贝生物科技有限公司)麻醉。按随机数表法将小鼠分为3组：对照组、CONV-RT组和FLASH-RT组，每组9只。
2.辐照实施：采用重离子同步加速器(兰州科近泰基碳离子治疗系统，型号CY-SY4400)产生的碳离子束流(能量190 MeV/u，水中射程7.1 cm)进行穿透式照射，通过笔形束点扫描技术形成2 cm×2 cm均匀照射野，射野内剂量5 Gy，源皮距100 cm。FLASH-RT组扫描点间距4 mm，单脉冲出束，单个脉冲引出时间为50 ms，剂量率100 Gy/s；CONV-RT组扫描点间距4 mm，多脉冲出束，单个脉冲引出时间为2 s，脉冲间隔7~8 s，剂量率 < 0.1 Gy/s。实验期间使用UNIDOSE Webline剂量仪(德国PTW公司)和Advanced Markus 34045电离室(德国PTW公司，离子对收集效率≥99.5%的最高测量剂量率为187 Gy/s)[14]，并经温度气压修正后测量小鼠腹部穿透剂量，同时在小鼠腹部和背部贴EBT3胶片(美国亚什兰集团公司)监测剂量分布。
3.组织标本取材与处理：照射后3、6、12 h处死小鼠，取幽门下5 cm至回肠末端上5 cm的新鲜小肠组织(约10 cm)，用磷酸缓冲盐溶液冲洗肠道内外壁，分离肠道内容物以及肠外脂肪组织，取0.5 cm空肠组织立即置于冻存管中，-80℃保存，用于RNA转录组测序分析；其余部分肠段在取样后立即置于4%多聚甲醛中充分固定，24 h后取出，常规石蜡包埋，切成厚度为4 μm的连续切片，置于载玻片上，供后续免疫组织化学等分析。
4.免疫组织化学分析：对石蜡切片进行免疫组织化学分析，通过磷酸化组蛋白H2AX(phosphorylated H2AX，γ-H2AX)抗体[美国CST公司，1∶500稀释于5%牛血清白蛋白(BSA)溶液中]染色分析小鼠肠道DNA损伤情况，细胞核相关抗原67(Ki67)抗体(英国Abcam公司，1∶500稀释于5% BSA溶液中)染色分析肠道组织照射后的增殖效应。
5.原位凋亡检测实验：采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)对石蜡切片进行染色分析，使用TUNEL试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)。
6.切片扫描与图像处理：免疫组织化学及TUNEL染色切片经KF-PRO-020全切片扫描仪(宁波KFBIOS公司)扫描，后续使用HALO图像分析软件(美国Indica Labs公司，软件版本为v3.6.4134.193)读取、评估图像以获取组织化学评分(histochemistry score，H-Score)，具体方法为：以细胞核与目标检测信号(特定抗原或TUNEL信号)共定位作为参考，识别并分割单个细胞，针对每个检测通道，分别调整信号阈值，将细胞分类为阴性、中度阳性和强阳性；分别统计每张切片中度阳性细胞数(Nmp)和强阳性细胞数(Nsp)，计算H-Score=Nmp+2 × Nsp。
7.组织RNA提取与转录组测序：取-80℃保存的肠道组织样品，使用TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)，经超微量分光光度计(NanoDrop 2000，美国Thermo Fisher Scientific公司)和生物分析仪(Agilent 2100，美国安捷伦公司)检测RNA纯度(A260/A280=1.8~2.1)及完整性(RIN≥8.0)。随后，利用oligo(dT)磁珠富集mRNA，于94℃片段化缓冲液中将其随机打断。以片段化的mRNA为模板，采用NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒(美国NEB公司)反转录合成cDNA。纯化后的双链cDNA片段依次进行末端修复、3’端加A尾及Illumina测序接头连接。连接产物经AMPure XP磁珠纯化后，进行PCR扩增。最终构建的cDNA文库由广州基迪奥生物科技有限公司在Illumina NovaSeq X Plus平台上完成双端测序。
8.数据分析及统计学处理：使用Graphpad Prism 8.4.0软件进行分析，对于符合正态分布的数据用x±s表示，两组间对比采用独立样本t检验，多组间对比采用ANOVA检验和多重比较，P < 0.05为差异有统计学意义；对转录组测序数据使用RStudio软件分析，差异表达分析使用DESeq2(组间)和EdgeR(样本间)，筛选标准为错误发现率(false discovery rate，FDR) < 0.05，且绝对差异倍数≥2，对差异基因进行Metascape富集分析[15]。
结果1.碳离子加速器实现FLASH照射：图 1A曲线为本研究所使用190 MeV/u 12C射线的百分深度剂量(percentage depth dose，PDD)曲线，其在水中射程为7.1 cm；胶片监测的射野剂量分布示意图如图 1B、图 1C所示，相对剂量分布曲线如图 1D、图 1E所示。CONV-RT与FLASH-RT的射野均匀；电离室测量得到FLASH-RT与CONV-RT模式下的物理剂量分别为(5.296±0.067)和(5.511±0.096)Gy，相对差异 < 5%，鉴于小鼠平均腹部厚度为20 mm，目标照射肠道组织处于穿透照射的坪区(0~15 mm区域)，按PDD曲线计算肠道组织平均深度处(10 mm)与电离室所在深度(20 mm)处剂量差异 < 3.2%，因此电离室测得的穿透剂量可有效代表目标组织的受照剂量。基于此物理剂量准确监测的前提，后续进一步探究了生物效应的差异。
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图 1 两种剂量率照射基本参数A.190 MeV/u 12C射线百分深度剂量；B.CONV-RT EBT3胶片扫描图像；C.FLASH-RT EBT3胶片扫描图像；D.射野横向剂量分布曲线；E.垂直方向剂量分布曲线 Figure 1 Basic parameters of radiotherapy with two dose rates A. Percentage depth dose (PDD) of 190 MeV/u 12C ions; B. Scanned image of EBT3 film for CONV-RT; C. Scanned image of EBT3 film for FLASH-RT; D. Lateral dose distribution curve of the radiation field; E. Vertical dose distribution curve |
2.照射后肠道组织损伤程度：碳离子束的高LET特性可以诱导高比例DSB导致细胞死亡，而γ-H2AX检测(图 2A)证实FLASH-RT组照射后3 h的DSB形成量显著低于CONV-RT组(t=3.80，P < 0.01)，提示其减轻DNA损伤与细胞死亡的作用；Ki67染色(图 2B)发现FLASH-RT组在照射后6 h保留增殖活性, 差异具有统计学意义(t=4.30，P < 0.005)，且强阳性细胞主要分布于隐窝基底部，说明FLASH-RT照射后肠道隐窝干细胞存活率与增殖活性高于CONV-RT组；TUNEL实验中，照射后12 h的肠道中FLASH-RT组相比CONV-RT组观察到更少的阳性细胞(图 2C)，差异具有统计学意义(t=3.08，P < 0.01)，说明FLASH-RT导致较少细胞发生凋亡。
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注：a与对照组比较，t=5.72、2.78，P < 0.05；b与CONV-RT组比较，t=3.80、4.30、3.08，P < 0.05 图 2 不同剂量率照射后不同时间小鼠肠道组织病理及H评分×20 A.照后3 h γ-H2AX免疫组织化学染色；B.照后6 h Ki67免疫组织化学染色；C.照后12 h TUNEL染色 Figure 2 Pathology and H-score of mouse intestinal tissue at different time points after radiotherapy with different dose rates ×20 A. γ-H2AX immunohistochemical staining at 3 h after radiotherapy; B. Ki67 immunohistochemical staining at 6 h after radiotherapy; C. TUNEL staining at 12 h after radiotherapy |
3.差异基因：提取照射后组织以mRNA测序，与对照组对比得到CONV-RT与FLASH-RT照射后的差异表达基因，如图 3所示。相比于对照组，CONV-RT后3 h上调691个、下调963个差异基因；FLASH-RT组上调35个、下调27个差异基因；与CONV-RT组相比，FLASH-RT组下调85个、上调993个差异基因。
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图 3 不同剂量率照射后3 h各组小鼠肠道组织差异基因火山图A.对照组与CONV-RT组；B.对照组与FLASH-RT组；C.CONV-RT组与FLASH-RT组 Figure 3 Volcano plots of differentially expressed genes in intestinal tissue in each group of mice at 3 h after radiotherapy with different dose rates A. Control group vs. CONV-RT group; B. Control group vs. FLASH-RT group; C. CONV-RT group vs. FLASH-RT group |
Metascape富集分析结果如图 4A所示，CONV-RT组与FLASH-RT组均显著上调的通路包括：内在凋亡信号通路、DNA损伤诱导的凋亡负调控、TP53转录调控、细胞辐射应答以及冷诱导产热调控。其中，DNA损伤相关的P53通路激活调控了正常肠道细胞的凋亡、DNA修复与增殖过程以维持急性期黏膜屏障功能。同时，如图 4B所示两组均下调了牛磺酸代谢、药物代谢-其他酶及类固醇生物合成通路。上述通路改变均属机体对放射损伤的应激反应，以暂时维持肠道稳态，但此类调控往往具有代偿局限性与时效性，在炎症反应作用下可能继发纤维化等不可逆损伤。
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图 4 不同剂量率照射后小鼠肠道差异基因富集通路A.同时在FLASH-RT组和CONV-RT组上调；B. 同时在FLASH-RT组和CONV-RT组下调；C.仅在CONV-RT组上调；D. 仅在CONV-RT组下调；E. 仅在FLASH-RT组上调 Figure 4 Enriched pathways of differentially expressed genes in mouse intestinal tissue after radiotherapy with different dose ratesA. Upregulated in both the FLASH-RT group and the CONV-RT group; B. Downregulated in both the FLASH-RT group and the CONV-RT group; C. Upregulated only in the CONV-RT group; D. Downregulated only in the CONV-RT group; E. Upregulated only in the FLASH-RT group |
如图 4C所示，仅CONV-RT组上调基因主要富集于活化免疫通路，上调白细胞活化、适应性免疫反应、炎症应答，涉及核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信号、B细胞受体信号，表明常规照射激活肠道免疫微环境，增强免疫细胞募集与炎症反应；单独下调基因(图 4D)则关联代谢过程，减少单羧酸代谢、小分子生物合成、核苷酸代谢，提示CONV-RT照射抑制肠道能量代谢与物质合成，可能导致黏膜细胞能量供应不足，免疫活化、炎症上调、代谢抑制可能是加剧放疗后肠道黏膜上皮炎症损伤、纤维化的原因。
如图 4E所示，FLASH-RT组仅3条通路显著上调，且无显著下调通路。其中胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)转运和摄取相关的通路上调，其通过激活PI3K/Akt通路，在促进细胞生长、分化、代谢等方面具有重要作用，该通路激活后通过调控Bcl/BAX通路抑制凋亡，可能是FLASH-RT减少肠道细胞凋亡的原因；且FLASH-RT组相比于CONV-RT组未出现NF-κB、白细胞活化、炎症应答等免疫相关通路上调，可能是其保护性效应的另一方面，尽管当前FLASH-RT组数据有限，但该通路的富集已初步显示其在高剂量率照射下的潜在生物学意义。
讨论本研究基于健康小鼠模型和医用碳离子加速器开展重离子FLASH-RT和CONV-RT诱发的急性肠道损伤生物效应研究。结果表明，相较于CONV-RT，正常肠道组织中FLASH-RT导致的DSB呈现减少的趋势，提示FLASH-RT可能直接影响DNA损伤水平，然而两种照射模式对于后续DSB的修复是否存在差异，仍需深入探讨。Fouillade等[16]发现FLASH-RT照射后正常肺组织细胞中P53结合蛋白1(P53 binding protein 1，53BP1)强度显著低于CONV-RT组，而肿瘤细胞中差异无统计学意义。提示FLASH-RT对DNA损伤的感知与早期修复通路的调控，在正常组织与肿瘤组织之间可能存在根本差异，这可能是FLASH-RT实现有效杀伤肿瘤的同时，可以更大程度保护正常组织的原因。因此，深入探究并对比重离子FLASH-RT下肿瘤细胞与正常组织的DNA损伤反应特征、修复通路趋向性，对于阐明FLASH-RT效应的选择性机制和推动其临床应用至关重要。
细胞凋亡检测结果表明，FLASH-RT组肠道上皮细胞凋亡率较CONV-RT组降低，推测直接源于DSB减少，为维持肠道黏膜完整性提供了双重保护。增殖标记物提示FLASH-RT组增殖活性高于CONV-RT，尤其在隐窝基底区域差异显著。表明FLASH-RT照射后肠道干细胞及祖细胞的增殖能力得到更好的保留。保留的增殖能力可能是FLASH-RT促进肠道黏膜修复的关键机制。尽管重离子射线因高传能线密度(LET)特性在肿瘤杀伤中具有优势，但其对正常肠道组织的致癌等远期效应相较于X射线更为显著[17]，而FLASH-RT所展现的减少肠道组织损伤效应，为临床上减少放疗相关肠损伤及并发症提供了初步实验依据和方向。
基于肠道组织mRNA转录组测序及Metascape富集分析，本研究揭示了FLASH-RT与CONV-RT照射后差异基因调控的差异：在DNA损伤响应方面，CONV-RT组与FLASH-RT组共同上调相关通路，即二者均触发经典辐射应答机制。其中，P53通路通过协调细胞凋亡、DNA修复与周期阻滞，在急性期维持黏膜屏障功能。但在免疫与代谢调控方面存在显著差异：与CONV-RT组呈现免疫通路激活、促炎反应亢进以及代谢通路受抑制不同，FLASH-RT组未观察到明显上述免疫激活和代谢抑制的现象，从而有效减轻了炎症级联反应造成的损伤。值得注意的是，FLASH-RT组显著上调的通路主要涉及IGF转运与摄取。IGF是细胞生长和分化、转化和凋亡的重要调节因子[18]。Peretz等[19]发现IGF通路激活可增加ATM相关的放射抗性。IGF-1通过激活下游PI3K/Akt信号[20]，调控Bcl-2/BAX平衡抑制凋亡促进细胞存活、生长[21-22]，这与本研究中的TUNEL结果(凋亡减少)一致。因此，IGF-PI3K/Akt信号通路的激活可作为后续深入探究FLASH-RT效应内在机制的方向。
本研究也存在一些局限性。仅探究照射后12 h内的急性反应差异，对于亚急性阶段(7~14 d)的病理变化尚未明确。尽管急性损伤指标显示FLASH-RT具有正常组织保护效应，但重离子FLASH-RT的迟发效应(如隐窝结构破坏、黏膜纤维化)、远期效应(如致癌)是否与CONV-RT存在差异仍需在动物体内探究。
综上所述，本研究通过正常小鼠模型证实，重离子FLASH-RT相比于CONV-RT展现出显著减轻急性肠道损伤的效应，其通过减少DSB形成、降低肠道上皮细胞凋亡率、保留肠道干细胞增殖活性、调控免疫代谢反应及激活IGF信号通路，减轻了急性期黏膜损伤。这一结果为阐明重离子FLASH-RT减少正常组织损伤的机制提供了分子与细胞层面的实验依据，为探索腹腔和盆腔肿瘤重离子放疗潜在新策略提供了初步实验依据和方向。鉴于本研究仅聚焦于照射后12 h内的急性反应，未来需进一步探究亚急性阶段的病理演变，以及重离子FLASH-RT对迟发效应和远期风险的影响，为其临床转化提供更全面的理论依据。
利益冲突 无
作者贡献声明 杨雨晨、朱红玉参与实验设计、数据处理及论文撰写；韩佳颖参与实验；李小波、张俊昱、周利荣、石健提供技术支持；邓小武参与数据分析
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