2025, Vol. 45
2. 长江大学生命科学学院, 荆州 434025
2. College of Life Sciences, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025, China
放射治疗是肿瘤治疗的主流方法之一[1]。然而，放射治疗引发的不良反应限制了最大处方剂量，在一定程度上降低了潜在的肿瘤治愈率。近年来，与常规剂量率(conventional dose rate, CONV, 0.01~0.4 Gy/s)辐射相比，超高剂量率辐射(FLASH, 通常定义为平均剂量率≥40 Gy/s)已展现出在保持抗肿瘤效率的同时，减少正常组织并发症的能力，这一现象被称为“FLASH效应”[2]。迄今为止，FLASH效应已在多种射线类型(电子、X射线、质子)[3-9]、多个物种(小鼠、大鼠、猫、小型猪、斑马鱼)[10-13]，以及多种器官(脑、肠道、肺、皮肤)[13-15]中得到验证。目前解释FLASH效应最流行的假说是氧耗竭假说[13]和免疫调节假说[16]。然而，这些假说未能全面解释超高剂量率辐射的保护作用[17]。
本研究旨在探究不同剂量率常规与超高剂量率X射线照射对小鼠小肠氧化应激的影响。采用9 MV超高剂量率辐射、常规剂量率辐射及6 MV常规剂量率辐射对小鼠腹部实施12 Gy照射。通过苏木精-伊红(HE)染色、氧化应激标志物分析和信号通路蛋白检测，系统评估了小肠组织的氧化损伤状况。
材料与方法1.实验动物与分组：雄性C53BL/6J小鼠32只，8周龄，体质量(22±1.0)g，购自北京SPF生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2023-0010。饲养环境保持22~24℃恒温，12 h明暗交替循环，自由摄取饲料饮水。辐照前将32只小鼠按随机数表法分为4组：SHAM组(假照射)、CONV0.067组(平均剂量率0.067 Gy/s)、CONV0.1组(平均剂量率0.09 Gy/s)和F215组(平均剂量率215 Gy/s)，每组8只。辐照后第3天解剖小鼠进行指标检测。
2.照射条件：采用高频瞬时高剂量率加速器(绵阳中玖光谷科技有限公司)9 MV X射线单次照射，设置215和0.09 Gy/s两种剂量率。辐照前使用EBT4辐射变色薄膜(美国阿什兰特种原料公司)进行剂量校准。小鼠经1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，接受12 Gy总剂量的全腹照射，射野3 cm × 4 cm。常规剂量率辐照采用Venus X Raytek临床多模态智能直线加速器(苏州雷泰医疗科技有限公司)6 MV X射线单次照射，射野3 cm × 25 cm(5只小鼠并排)，剂量率4 Gy/min(0.067 Gy/s)。SHAM组小鼠仅麻醉后假照射。
3.组织学分析：每组小鼠按随机数表法取3只，采集约0.5 cm小肠组织，置于4%多聚甲醛中固定至少1 d。随后组织经低浓度到高浓度梯度乙醇脱水、二甲苯透明处理后进行石蜡包埋。将包埋组织切片为4 μm厚度，经脱蜡处理后进行苏木精-伊红(HE)染色，中性树脂封片。扫描小肠组织切片，并通过Slide Viewer软件(武汉赛维尔生物科技有限公司)测量小肠绒毛长度与隐窝深度。采用绒毛高度与隐窝深度的比值评估小肠黏膜受损程度。每张切片观察10个完整绒毛与隐窝结构，每组共分析3个切片视野。
4.氧化应激指标检测：采用8只不同小鼠的小肠组织，测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，具体操作遵循试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书。
5.免疫组织化学染色：采用兔二步法检测试剂盒(北京中山金桥生物技术有限公司)进行免疫组织化学实验。切片置于65℃恒温箱中烘烤，随后进行脱蜡、脱水处理。加入内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育，冲洗晾干后滴加一抗试剂：Keap1、HO-1抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)及Nrf2抗体(北京安诺伦生物科技有限公司)，稀释比例分别为1∶500、1∶100和1∶100。4℃孵育过夜，次日室温复温，滴加反应增强液33℃孵育，然后滴加增强酶标羊抗兔IgG聚合物33℃孵育。之后，用二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色(北京中山金桥生物技术有限公司)，苏木素复染(苏州泽科生物技术有限公司)。自然晾干后中性树脂封片，显微镜下拍照观察，每组取3只不同小鼠，每只小鼠选取3个视野，采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件进行统计分析。
6.Nrf2、Keap1及HO-1蛋白表达的Western blot检测：取小肠组织冰上研磨，在4℃、12 000 r/min，离心半径14.75 cm，离心15 min获得样本，采用二喹啉甲酸(BCA)法测定样本蛋白浓度后进行变性处理。经上样、电泳分离及聚偏二氟乙烯(PVDF)膜转印后，用5%脱脂奶粉封闭2 h，随后分别加入Nrf2(1∶1 000)、HO-1(1∶1 000)和Keap1(1∶2 000)一抗4℃孵育过夜。次日用加入Tween-20的Tris盐缓冲液(TBS)洗涤后，室温下与二抗(辣根酶标记山羊抗小鼠lgG，1∶1 500稀释；辣根酶标记山羊抗兔lgG，1∶1 500稀释)孵育1 h，洗涤后进行显影。每组选取4只不同小鼠，以β-肌动蛋白作为内参，采用Image J软件分析电泳条带。
7.统计学处理：采用GraphPad Prism9.0软件对小肠组织中氧化应激水平、小肠绒毛长度与隐窝深度以及蛋白表达水平进行统计学分析。符合正态分布的数据以x±s表示，符合方差齐性数据采用单因素方差分析进行多组间比较。两组间比较采用独立样本t检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。
结果1.不同剂量率X射线对小鼠小肠长度的影响：照后第3天，SHAM组、CONV0.067组、CONV0.1组和F215组小肠长度分别为(31.55±0.76)、(31.22±3.01)、(27.07±3.56)、(29.82±2.25)cm。CONV0.1组小肠长度明显短于SHAM组(t=4.20，P < 0.05)，其余组间差异无统计学意义(P＞0.05)。表明CONV0.1组受照后小肠组织损伤更严重。
2.不同剂量率X射线照射后小肠的组织学分析：如图 1所示，照后第3天，SHAM组小鼠的组织切片结构完整且排列有序，而照射组的肠上皮细胞在辐照后出现绒毛缩短、隐窝变浅和严重脱落等损伤迹象。照后第3天，SHAM组、CONV0.067组、CONV0.1组和F215组的绒毛长度分别为(257.51±69.54)、(202.48±53.19)、(204.79±97.01)、(254.67±67.28)μm，CONV0.067组和CONV0.1组较SHAM组差异有统计学意义(t=4.10、3.93，P < 0.05)。此外，这两个组的绒毛长度也明显短于F215组(t=3.89、3.72，P < 0.05)，表明CONV组在第3天损伤更为明显。4组隐窝深度分别为(98.72±18.51)、(71.56±20.09)、(62.51±13.91)、(74.49±10.22)μm，所有照射组较SHAM组均出现显著降低(t=5.72、8.79、5.71，P < 0.01)，其中CONV0.1组与F215组差异有统计学意义(t=3.99，P < 0.05)。
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图 1 照射后第3天4组小鼠小肠组织病理观察HE染色×15 A.SHAM组；B.CONV0.067组；C.CONV0.1组；D.F215组 Figure 1 Histopathological observations of small intestinal tissues in mice from four groups at 3 d post-irradiation HE staining ×15 A. SHAM group; B. CONV0.067 group; C. CONV0.1 group; D. F215 group |
3.不同剂量率X射线照射后的氧化应激水平：在照射后第3天，CONV0.067组和CONV0.1组SOD、CAT、GSH-Px水平较SHAM组显著降低(t=10.28~13.56，P < 0.01)，F215组显著高于CONV0.067和CONV0.1两组(t=7.36~10.34，P < 0.01)。CONV0.067组和CONV0.1组的GSH和T-AOC水平显著低于SHAM组(t=10.50~13.98，P < 0.01)，而F215组则显著高于这两个组(t=7.06~10.64，P < 0.01)。CONV0.067组和CONV0.1组的MDA水平显著高于SHAM组(t=13.99、11.34，P < 0.01)，而F215组显著低于这两个组(t=11.06、8.31，P < 0.01)。这些结果表明，在第3天时，CONV0.067组和CONV0.1组表现出抗氧化能力不足，导致修复能力欠缺，损伤可能仍在持续(表 1)。
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表 1 不同剂量率12 Gy腹部照射后第3天小鼠小肠组织中的氧化应激水平(x±s) Table 1 Oxidative stress levels in small intestinal tissues of mice at 3 d after 12 Gy abdominal irradiation at different dose rates (x±s) |
4.不同剂量率X射线照射后小肠组织的免疫组织化学分析：图 2展示了小肠组织中Nrf2、Keap1和HO-1蛋白的免疫组织化学染色图像。照射后第3天，所有照射组的Nrf2和HO-1阳性细胞数量较SHAM组显著增加(t=4.91~14.69，P < 0.01)，而Keap1阳性细胞数量显著减少(t=13.74、11.74、32.69，P < 0.01，表 2)。值得注意的是，F215组的累积光密度值与CONV0.067和CONV0.1组存在显著差异(t=7.03~20.95，P < 0.01)，见表 2。这些结果表明，照射后第3天，抗氧化系统的响应增强，表现为Keap1-Nrf2-HO-1信号通路相关蛋白的表达变化，这可能与机体应对氧化应激的适应性机制相关。
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图 2 不同剂量率12 Gy腹部照射后第3天小鼠小肠组织中Nrf2、Keap1及HO-1蛋白免疫组织化学染色×20 Figure 2 Immunohistochemical staining of Nrf2, Keap1, and HO-1 proteins in mouse small intestinal tissue at 3 d after 12 Gy of abdominal irradiation at different dose rates ×20 |
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表 2 不同剂量率12 Gy腹部照射后第3天小肠组织Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表达(x±s) Table 2 Expressions of the Nrf2, Keap1, and HO-1 proteins in small intestinal tissues at 3 d after 12 Gy of abdominal irradiation at different dose rates (x±s) |
5.蛋白质印迹法检测Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表达水平：为进一步验证各组中Nrf2、Keap1和HO-1蛋白的表达水平，进行了蛋白质印迹分析(图 3)。与免疫组织化学结果相同，在辐照后第3天，所有辐照组的Nrf2和HO-1蛋白水平较SHAM组均升高，而Keap1蛋白水平则降低。其中F215组与CONV0.067、CONV0.1组相比，其蛋白水平差异有统计学意义(t=4.89~6.97，P < 0.05，表 3)。
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图 3 不同剂量率12 Gy腹部照射后第3天小鼠小肠组织中Nrf2、Keap1和HO-1的蛋白表达 Figure 3 Expression of the Nrf2, Keap1, and HO-1 proteins in small intestinal tissues of mice at 3 d after 12 Gy of abdominal irradiation at different dose rates |
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表 3 不同剂量率12 Gy腹部照射后第3天小肠组织Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表达(x±s) Table 3 Expression of the Nrf2, Keap1, and HO-1 proteins in small intestinal tissues at 3 days after 12 Gy of abdominal irradiation at different dose rates (x±s) |
讨论
本研究采用平均剂量率达215 Gy/s的超高剂量率辐照，同时以0.1 Gy/s(与F215组同源设备)和0.067 Gy/s的常规剂量率作为对照。研究结果显示，超高剂量率辐照在照射后第3天会引发更高水平的抗氧化。氧化应激是由活性氧(ROS)生成与抗氧化能力失衡所导致，其主要诱因包括辐射等外部因素[18]。抗氧化酶在机体防御氧化应激过程中起着关键作用，主要可分为三大类：SOD、CAT和GSH-PX。其中SOD与GSH-PX是抗氧化防御系统的重要组成部分，能有效清除生物体内过量的过氧化物，从而保护细胞和组织免受损伤[19]。Keap1/Nrf2与Nrf2/HO-1信号通路是抵抗氧化应激损伤的重要防御机制，能够激活细胞对多种氧化应激损伤的适应性反应[20-22]。Nrf2作为调控细胞氧化应激反应的重要转录因子，是维持细胞内氧化还原稳态的关键调节因子[23]。Keap1是Nrf2的负向调控蛋白——在正常生理状态下，Nrf2因与Keap1结合而锚定在细胞质中；但当受到特定刺激时，Keap1-Nrf2结合变得不稳定，导致Nrf2释放并转位至细胞核内，与抗氧化反应元件(ARE)结合进而启动下游基因转录。HO-1是一种受上游Nrf2调控的内源性细胞保护酶。Nrf2最终通过结合ARE来调控SOD和HO-1的活性，从而减轻氧化应激造成的损伤[24]。12 Gy全腹部X射线照射导致小鼠小肠组织中Keap1与Nrf2水平呈现相反变化趋势，该现象与既往研究结果一致[25]。研究表明超高剂量率放疗(FLASH-RT)可减轻氧化应激损伤。Zhu等[8]在小鼠肠炎急性期观察到，与传统放疗(CONV)组相比，FLASH组ROS和SOD水平显著升高，从而减轻组织损伤。但FLASH-RT在肠道疾病中的氧化应激机制尚未明确，需进一步探究其对炎症性肠病(IBD)进展的作用[26-27]。
本实验研究了小鼠小肠组织对FLASH和常规剂量率辐射在不同剂量率下的差异生物学反应，并通过测量抗氧化酶和过氧化物水平评估了不同类型X射线照射后总氧化应激水平的差异。虽然先前研究表明FLASH照射能有效抑制肿瘤生长并与常规剂量率照射类似地保护正常组织，但健康小鼠腹部照射后不同类型X射线诱导的氧化损伤差异尚未得到明确研究[3]。
总体而言，本研究结果表明，在照射后第3天，FLASH组小肠绒毛长度及隐窝深度优于CONV组，提示FLASH或在该时间点减轻晚期结构损伤，可能表现出更强的辐射修复能力。在0.1和215 Gy/s的FLASH组之间观察到显著的FLASH效应，提示正常组织不良反应与剂量率可能存在相关性。然而，FLASH效应的基本生物学机制尚未完全阐明。本研究仅聚焦照射后第3天的组织学及氧化应激指标，未涵盖早期(6~24 h)ROS爆发及细胞凋亡峰，因此不能排除FLASH与常规剂量率在早期损伤强度或动力学上的差异。后续工作将补充6、24 h时间点采样，以明确时间-效应关系。因此，需要进一步的实验研究和临床试验来确认FLASH-RT保护正常组织的条件，为未来临床研究提供基础数据[28]。
利益冲突 无
志谢 感谢绵阳中久光谷科技有限公司王建新副高级工程师和中国工程物理研究院羊奕伟副高级工程师在剂量设定与统计分析方面给予的帮助
作者贡献声明 刘小曼负责实验操作、数据整理分析及论文撰写；刘雅妮、李志慧负责部分数据分析及文献整理；闫栋斐、张利辉、李梦华负责设计实验及起草论文；李少斌、董国福、王长振指导论文修改
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