全世界范围内，每年大约有30万颅内恶性肿瘤患者及93万头颈部恶性肿瘤患者^[1]，其中70%~90%需要接受放射治疗。接受头颈部放射治疗的肿瘤患者中约有30%会发生放射性脑损伤(radiation-induced brain injury, RIBI)^[2]。RIBI包括急性反应、早期迟发反应和晚期迟发反应3个阶段^[3]，其中晚期迟发损伤对患者生活质量影响最为严重。放射肿瘤学的核心目标是提高肿瘤控制率，并减小对正常组织损伤，扩大治疗窗^[4]。近年来，FLASH照射(FLASH radiotherapy, FLASH-RT)因在同等照射剂量下较常规照射(conventional radiation therapy，CONV-RT)对正常组织造成的辐射损伤更轻而备受关注。

FLASH照射是指以超高剂量率(ultra-high dose rate, ＞40 Gy/s)在极短时间内完成照射的治疗方式。最先由Favaudon等^[5]发现其造成的辐射相关肺纤维化的发生率更低。随后FLASH效应在皮肤、肠道、骨骼及血液系统等模型中均有报道。尽管其优势已在部分组织得到验证，但在神经系统中的作用及病理学改变尚缺乏系统研究与平台验证。

本研究基于我国自主研发的X-FLASH平台，建立了超高剂量率X射线小鼠全脑照射模型，比较CONV-RT与FLASH-RT对脑组织的影响。为理解FLASH照射相对较低的组织损伤效应提供理论基础，同时促进其临床转化。

1. 实验动物：本实验由绵阳市中心医院实验动物伦理委员会批准(审批号：S20250301-01)。7周龄的雄性C57BL/6J小鼠(约24g)90只从国家遗传工程小鼠资源库购买(许可证号：SCXK苏2023-0009)，小鼠维持在SPF条件下进行饲养，12 h明暗交替，适应性饲养1周后进行小鼠全脑放疗。

2. 辐照装置与剂量测定：本研究中CONV-RT采用6 MV的Elekta Precise(瑞典医科达公司)直线加速器，FLASH-RT使用中国工程物理研究院应用电子学研究所和绵阳中玖闪光医疗科技有限公司联合研发的10 MV FLASH照射临床前实验平台。总剂量均为20 Gy。本研究的两平台照射的物理参数详见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 两种照射方式的物理参数 Table 1 Physical parameters of radiotherapy from two platforms 照射方式 加速器型号 平均剂量率(Gy/s) 照射时间(ms) 射野 源皮距(cm) 靶器官深度(mm) CONV-RT Elekta LINAC 0.067 298 500 12 mm × 300 mm 100 5 FLASH-RT X-ray LINAC 339 59 12 mm × 20 mm 38 5 注：CONV-RT.常规剂量率照射；FLASH-RT. FLASH照射

表 1 两种照射方式的物理参数 Table 1 Physical parameters of radiotherapy from two platforms

使用Gafchromic^TM EBT3胶片(美国亚什兰公司)和FLASHDiamond探头(德国弗莱堡PTW有限公司，Tx60025)作为剂量计，配合固体水模，在动物辐照前对实验射野下的参考点位置水吸收剂量进行标定。此外，使用EBT3胶片对剂量分布进行了测量，包括百分剂量深度分布曲线(PDD)及离轴剂量分布(profile)。小鼠实际照射过程中的剂量监视采用了放疗设备自带的基于电离室的剂量监视系统(剂量监视引入的不确定度＜1%)。此外，为增加剂量监视结果的可靠性，通过在小鼠头颅背侧放置Gafchromic^TM EBT3胶片对背侧剂量分布及受照剂量进行辅助监测。

本研究中，脑组织体积约9 mm×12 mm×6 mm，因此将参考剂量点设定为水深5 mm处。以此参考点为中心，对周围的剂量分布进行了测量(图 1A、B)。CONV照射与FLASH照射相比，射野高度均为12 mm，长度设置为大于小鼠头部宽度以覆盖全脑，以保证小鼠靶区体积一致。PDD测量结果显示(图 1C)，FLASH照射的剂量随深度变化与CONV基本一致，在参考点剂量相同时，不同深度位置的剂量最大差异约3%。

图 1 EBT3胶片两种照射方式的剂量测定A. CONV照射的剂量分布；B. FLASH照射的剂量分布；C. 两种照射方式的剂量深度曲线 Figure 1 Dosimetric characterization of two irradiation modes for EBT3 film A. Dose distribution of CONV irradiation; B. Dose distribution of FLASH irradiation; C. Depth-dose curves for both irradiation modalities

3. 全脑照射：按随机数表法将90只8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为假照射组(Sham)、CONV照射组(CONV-RT)及FLASH照射组(FLASH-RT)，每组30只。所有小鼠均通过腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)进行麻醉，CONV-RT组小鼠以俯卧位平放在辐射板上，使用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)板进行剂量积累并固定小鼠，在PMMA板与受照小鼠背部表面之间放置EBT3胶片进行辅助剂量监测。而FLASH照射组小鼠则以仰卧位固定在辐射板上并竖立起来，脑区位于辐射板中心，并与射野重叠。确保前后12 mm避开重要脏器如眼球、嘴巴及其他可能影响小鼠后期行为学评价表现的脏器。Sham组小鼠麻醉后与CONV-RT组固定方式一致，未进行照射。

4. 认知测试：在小鼠全脑照射后1、3及4个月进行水迷宫测试(morris water maze, MWM)以评估与海马相关的记忆功能。为避免小鼠记忆残留，每次测试均使用未进行测试过的小鼠，每组10只。水池温度设定在20~22℃，进行5 d的定位航行训练。第7天进行空间探索测试^[6]。使用VisuTrack软件系统(上海欣软信息科技有限公司)记录小鼠60 s内穿越原先平台位置的次数、潜伏期、以及整体平均速度等。

5. 情绪测试：在全脑放疗后1、3和4个月分别进行旷场实验(open field test, OFT)。在40 cm×40 cm的正方形实验场中，小鼠从同一位置被放下并在场地内自由探索7 min。每只小鼠仅测试1次，每次测试后使用75%乙醇擦拭以去除气味干扰^[7]。实验过程中利用VisuTrack系统记录其运动轨迹、总活动距离及贴壁距离占比、跨越中央区域次数等指标。在每次测试中，动物适应阶段设定为前1 min，主要分析阶段为2~7 min。

6. 脑组织尼氏染色：每组按随机数表法选择3只小鼠进行尼氏染色(尼氏染色试剂盒，武汉赛维尔生物科技有限公司)。所有小鼠在深度麻醉状态下进行灌注固定。灌注完成后取出全脑，置于多聚甲醛中固定，经脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、水化，甲苯胺蓝染色，脱水封片。显微镜下20倍镜拍摄CA1、CA3区(切片面积CA1区约为0.085 mm²，CA3区约为0.105 mm²)，40倍镜拍摄DG区(切片面积约为0.070 mm²)。Image J计数符合标准的神经元(完整细胞核、清晰大胞体)，每组3只取均值统计分析。

7. 小胶质细胞及星形胶质细胞免疫组织化学分析：小鼠冠状位海马切片分别用兔抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP，1∶200)和离子钙结合衔接分子1(Iba-1，1∶200，均购自武汉赛维尔生物科技有限公司)抗体4℃孵育24 h，再与山羊抗兔IgG(1∶250，武汉赛维尔生物科技有限公司)孵育，二氨基联苯胺(DAB)显色后进行显微镜拍摄。Image J分析计数海马Iba-1⁺细胞数及GFAP⁺区域面积占比(Area%)，每组3只取均值统计分析。

8. 统计学处理：使用SPSS 26.0软件进行统计分析。Prism 9.4.1软件用于创建图表。在评估正态性和方差齐性检验后，所有数据符合正态分布，均以x±s表示。通过单因素方差分析(ANOVA)进行组间差异比较，随后通过Tukey′s HSD检验进行两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.全脑照射对小鼠体质量变化的影响：重复测量方差分析结果显示，3组小鼠照射后1月内体质量随时间变化差异具有统计学意义(F=26.93，P < 0.05)。CONV-RT组小鼠体质量与FLASH-RT组小鼠在第8、9、10、11、12、24天之间差异具有统计学意义(q=5.18、5.31、4.46、3.41、3.09、2.82，P < 0.05)，见图 2。

注：Sham.假照射组；FLASH-RT.FLASH照射组；CONV-RT.常规照射组。a与FLASH组比较，q=5.18、5.31、4.46、3.41、3.09、2.82，P＜0.05 图 2 全脑照射后1个月内各组小鼠体质量变化曲线 Figure 2 Weight change curves of mice in each group within one month after whole-brain radiotherapy

2. 全脑照射对小鼠空间记忆的影响：训练阶段结果显示，照射后第1、3、4个月3组小鼠逃避潜伏期差异均无统计学意义(P>0.05)。探索阶段结果表明，照后第1、3个月3组小鼠在游泳速度、逃避潜伏期以及平台穿越次数之间差异均无统计学意义(P>0.05)。照后4个月时3组小鼠在游泳速度、逃避潜伏期、平台穿越次数之间整体差异具有统计学意义(F=7.31、9.52、7.32，P＜0.05)；进一步比较发现，FLASH-RT组在逃避潜伏期、平台穿越次数与CONV-RT组之间差异具有统计学意义(q=3.72、2.92，P＜0.05)，与Sham组之间差异无统计学意义(P>0.05)。速度方面，FLASH-RT组与CONV-RT组之间差异无统计学意义(P>0.05)，两组与Sham组之间差异均具有统计学意义(q=3.22、3.50，P＜0.05)，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 各组小鼠空间记忆训练的行为学指标(x±s) Table 2 Behavioral parameters of spatial memory training in each group of mice (x±s) 组别 只数 照射第4个月水迷宫实验 照射第3个月旷场实验 照射第4个月旷场实验 游泳速度(mm/s) 潜伏期(s) 平台穿越次数 中央区跨越次数 移动路程(m) 中央区跨越次数 贴壁距离占比(%) Sham组 10 233.0±23.4 10.4±5.7 3.8±1.1 8.6±2.2 33.5±6.0 21.8±8.3 1.3±0.3 FLASH-RT组 10 200.9±15.1a 12.7±6.7 3.3±1.3 5.0±1.7 23.8±8.3a 13.5±5.8a 1.4±0.2 CONV-RT组 10 197.1±17.3a 34.5±17.4ab 1.4±0.9ab 2.1±1.1a 22.1±4.5a 6.6±4.6ab 1.8±0.6ab F值 7.31 9.52 7.32 3.52 10.29 15.85 6.73 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 注：Sham.假照射组；FLASH-RT.FLASH照射组；CONV-RT.常规照射组。a与Sham组比较，q=2.65~5.45，P＜0.05；b与FLASH-RT组比较，q=2.96~3.72，P＜0.05

表 2 各组小鼠空间记忆训练的行为学指标(x±s) Table 2 Behavioral parameters of spatial memory training in each group of mice (x±s)

3.全脑照射对小鼠情绪状态的影响：照后第1、3个月的移动路程、贴壁距离占比以及第1个月的中央区跨越次数在3组间差异均无统计学意义(P＞0.05)。3组小鼠在第3个月中央区跨越次数以及第4个月移动路程、中央区跨越次数、贴壁距离占比之间整体差异有统计学意义(F=3.52、10.29、15.85、6.73，P＜0.05)。其中，CONV-RT组第3个月中央区跨越次数明显少于Sham组(q=2.65，P＜0.05)，但与FLASH-RT组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。第4个月时，FLASH-RT组中央区跨越次数、贴壁距离占比与CONV组之间差异具有统计学意义(q=3.28、2.97，P＜0.05)；同时，FLASH-RT组中央区跨越次数与Sham组之间差异有统计学意义(q=2.96，P＜0.05)，但贴壁距离占比与Sham组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。移动路程方面，FLASH-RT组与CONV-RT组之间差异无统计学意义(P＞0.05)，但均小于Sham组(q=3.61、4.26，P＜0.05)。具体结果见表 2。

4. 全脑照射对脑组织神经元结构的影响：尼氏染色结果显示Sham组神经元结构完好，相比之下，CONV-RT组神经元减少，排列紊乱，细胞变形、细胞核消失等典型损伤明显，而FLASH-RT组海马结构与Sham组接近，见图 3。定量分析结果显示，3组阳性细胞数在海马CA1、CA3及DG区之间整体差异均有统计学意义(F=5.43、13.01、8.53，P＜0.05)。其中FLASH-RT组与Sham组在各分区之间差异均无统计学意义(P＞0.05)；CONV-RT组海马各分区阳性细胞数均明显少于Sham组(q=3.21、4.93、3.85，P＜0.05)；进一步比较显示，CONV-RT组与FLASH-RT组在CA3和DG区差异具有统计学意义(q=3.61、3.21，P＜0.05)，在CA1区差异无统计学意义(P＞0.05)。结果见表 3。

注：CA1区切片面积约为0.085 mm2，CA3区约为0.105 mm2；DG区约为0.070 mm2；红色箭头指示皱缩的锥体细胞或者颗粒细胞；Sham.假照射组；FLASH-RT.FLASH照射组；CONV-RT.常规照射组 图 3 全脑照射后海马形态组织学变化 尼氏染色 Figure 3 Hippocampal morphological and histological changes after whole-brain radiotherapy (Nissl staining)

表 3(Table 3)

表 3 各组小鼠不同海马分区尼氏染色细胞数比较(x±s) Table 3 Comparison of Nissl-positive cell numbers in hippocampal subregions across the groups of mice (x±s) 组别 只数 CA1 CA3 DG Sham组 3 198.7±15.5 175.0±17.6 340.0±45.2 FLASH-RT组 3 184.3±31.6 159.3±9.9 319.0±50.3 CONV-RT组 3 150.0±10.6a 116.7±20.7ab 217.3±38.2ab F值 5.43 13.01 8.53 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 注：Sham.假照射组；FLASH-RT.FLASH照射组；CONV-RT.常规照射组。a与Sham组比较，q=3.21、4.93、3.85，P＜0.05，b与FLASH-RT组比较，q=3.61、3.21，P＜0.05

表 3 各组小鼠不同海马分区尼氏染色细胞数比较(x±s) Table 3 Comparison of Nissl-positive cell numbers in hippocampal subregions across the groups of mice (x±s)

5.全脑照射对脑组织慢性炎症的影响：照射后4个月海马组织Iba-1⁺细胞数、GFAP⁺区域占比在3组间整体差异具有统计学意义(F=8.37、6.32，P＜0.05)。进一步比较发现，CONV-RT组Iba-1⁺细胞数、GFAP⁺区域占比均高于Sham组(q=3.99、3.50，P＜0.05)；CONV-RT组GFAP⁺阳性区域占比与FLASH-RT组之间差异亦有统计学意义(q=2.28，P＜0.05)，但Iba-1⁺细胞数与FLASH-RT组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。

表 4(Table 4)

表 4 全脑照射后小鼠海马组织免疫组织化学分析(x±s) Table 4 Immunohistochemical analysis of the mouse hippocampus post whole-brain radiotherapy (x±s) 组别 只数 Iba-1+细胞数 GFAP+区域占比(%) Sham组 3 72.00±5.97 1.48±0.10 FLASH-RT组 3 81.34±9.88 1.62±0.18 CONV-RT组 3 100.34±12.79a 1.87±0.31ab F值 8.37 6.32 P值 ＜0.05 ＜0.05 注：Sham.假照射组；FLASH-RT.FLASH照射组；CONV-RT.常规照射组。a与Sham组比较，q=3.99、3.50，P＜0.05；b与FLASH组比较，q=2.28，P＜0.05

表 4 全脑照射后小鼠海马组织免疫组织化学分析(x±s) Table 4 Immunohistochemical analysis of the mouse hippocampus post whole-brain radiotherapy (x±s)

降低辐射损伤是放射治疗研究者的目标之一，尽管近年来通过海马回避照射治疗、影像引导放疗、立体定向放射外科治疗(SRT)、调强或调制放疗(VMAT)等技术的进步改善了治疗效果^[8]，但放疗对正常组织的损伤仍难以避免。相比之下，FLASH照射因其对正常组织相对较低的辐射损伤，展现出在放射领域的应用前景。FLASH照射的“保护效应”在肺^[5]、皮肤^[9]、肠道^[10]、骨骼^[10]、血液系统^[11]等器官中相继被证实，且其潜在机制涉及氧耗竭、DNA损伤修复、免疫反应及自由基效应等方面^[12]。然而，其在神经系统中的研究尚处于起步阶段。本研究系统性地证实了FLASH照射在健康小鼠全脑照射模型中的低损伤效果，为其潜在的机制探索提供初步证据。

本研究以健康无肿瘤C57BL/6J小鼠作为研究对象，旨在模拟FLASH照射与常规照射对健康个体全脑放疗后的综合神经效应。首先，技术方面，通过Gafchromic^TM EBT3胶片、PTW 60025 FLASHDiamond探头以及电离室的剂量监视系统等对剂量进行监测，结果显示本实验设备始终维持超高剂量率在339 Gy/s这一指定水平，同时确保射野范围内剂量分布均匀一致，并且两照射方式在靶深度的剂量基本相同，成功完成了健康小鼠全脑照射实验。既往研究表明，与常规照射相比，当剂量率超过100 Gy/s时，小鼠存在明确记忆保留现象，提示100 Gy/s是小鼠认知保留的剂量率阈值，且在其他诸多研究中，也可观察到类似的FLASH效应^[13-14]。结合本实验FLASH-RT组小鼠认知功能和神经结构的变化验证了此平台具备产生FLASH效应的能力，证明我国自主研发的X-FLASH设施的稳定。

无论何种照射方式，小鼠体质量均在第5天左右开始下降，这与其他研究一致^[15]，但FLASH-RT组小鼠仅有一过性体质量下降，随后逐渐恢复。而CONV-RT组小鼠体质量下降明显，且始终低于FLASH-RT组，提示FLASH照射全脑照射后的综合不良效应较轻。这可能与FLASH照射因缩短照射时间使得下丘脑垂体轴损害^[16]及代谢紊乱^[15]等较常规照射更轻相关。

本研究进行了比较全面的认知及焦虑测试。结果显示，两照射组小鼠在前3个月均表现出较好的学习记忆功能及较低的焦虑水平，与Sham组无明显差异。造成这种现象可能的原因是由于较高剂量下，短期内认知功能及焦虑行为被短暂保留，但随着时间的延长，认知及焦虑障碍则逐渐显现，这与已有的研究一致^[17]。但随后的第4个月，在两照射组小鼠运动能力相近的情况下，CONV-RT组小鼠表现出明显的空间记忆能力下降及较高的焦虑水平，而FLASH-RT组则与Sham组接近，这一结果提示FLASH照射较常规照射对小鼠行为学的不良影响更轻，且与其他相关研究相符^{[13-14, 18-24]}。此外，不同时间点组内小鼠的行为学表现差异，即第4个月小鼠认知及焦虑表现优于第1和3个月，可能归因于环境因素^[25]等。

为了进一步探究小鼠记忆功能损害与海马结构改变之间的关联，本研究进行了尼氏染色分析。结果显示，FLASH照射较常规照射引起的海马各分区神经元的结构损伤更轻，这些分区的神经元正常结构与记忆功能的保持密切相关^[26]。此外，本研究进一步对活化的胶质细胞进行定量分析，以探究放疗后神经炎症的动态变化。GFAP⁺星形胶质细胞的增多通常被视为病理性反应的标志，而Iba-1⁺小胶质细胞的增加意味着炎症的激活。本研究发现慢性期FLASH组炎症激活水平相对较低，表明该疗法可在一定程度上减弱慢性神经炎症的激活趋势，这一发现与已有研究结果相吻合^{[19, 21, 23, 27-29]}。综合以上结果表明，FLASH照射与低神经毒性和炎症反应之间存在一定关联，这可能为认知功能的相对保留提供了潜在机制。

本研究在探索FLASH照射相关神经效应方面取得了一定发现，但仍存在局限性。首先，未在急性期系统进行组织学和分子水平取材，使得对不同放疗模式急性期免疫调控、细胞凋亡等理解不够全面。其次，FLASH-RT组与CONV-RT组使用不同物理设备，未能保证除剂量率以外的其余物理参数一致，存在一定的系统性偏差可能。但通过对胶片剂量的定量分析以及对靶深度剂量的监测，3%的最大剂量差异被认为是可以接受的。值得肯定的是，通过多时点、重复的行为学测试，记录了认知功能的动态变化过程，有效定位了认知障碍的主要发生时段，为机制研究提供了可靠的行为学基础。未来研究应聚焦以下方面：第一，在统一设备平台下设计不同剂量率、分次照射等实验，提供完备的FLASH效应剂量学参考；第二，在多时间点采样，结合转录组学、蛋白组学等实验手段，系统揭示FLASH照射影响下神经功能变化特点及机制，以促进FLASH照射的临床转化。

综上，剂量学方面展现了X-FLASH平台的稳定性和可行性。生物学方面论证了X-FLASH在认知功能保留、焦虑行为减少、神经结构损伤及炎症激活等方面较常规照射的优势。这不仅证明我国具备开展FLASH照射相关实验研究的能力，也为FLASH照射在临床神经肿瘤放疗的应用提供理论支撑与实验依据。未来，X-FLASH有望为肿瘤患者带来更安全有效的治疗选择。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  王远旭负责实验操作、采集分析数据、论文撰写；李金华负责实验操作、采集分析数据；唐宇凤负责实验方案设计及指导论文修改