近年来，FLASH照射作为一种前沿技术受到放疗学界的关注。FLASH照射的平均剂量率≥40 Gy/s，瞬时剂量率≥100 Gy/s，照射时间≤200 ms^[1]。与相同剂量的常规剂量率照射(常规照射，平均剂量率≤1 Gy/s)相比，FLASH放疗在保证相同肿瘤控制率的前提下，可明显减轻正常组织放射损伤，这种独特的生物学效应又称为FLASH效应^[2]。FLASH照射不仅能够突破目前临床上肿瘤放疗中正常组织最大耐受剂量的限制，大幅拓宽治疗窗；而且可以将照射时间缩短到毫秒内，极大提升了治疗效率，减少了由于器官运动位置变化带来的治疗误差^[1]。迄今为止，FLASH效应的生物学机制仍在探索中。组学大数据在揭示生物体内的分子机制和生物过程中具有独特的优势，是实现精准医学的基础^[3]。基于质谱技术的蛋白组学方法已成为当前大规模蛋白质鉴定的重要手段^[4]。同位素相对标记与绝对定量(iTRAQ)技术作为一种理想的标记方法，在血浆蛋白质组学中得到了广泛的应用^[5]。本研究以C57BL/6J小鼠为研究对象，对比分析FLASH和常规照射后肺转移癌控制情况及肺组织放射损伤程度，采用iTRAQ蛋白质组学技术收集、整理、并筛选调控FLASH效应的关键信号通路与蛋白，为理解FLASH照射减轻肺组织放射损伤的分子机制提供新的见解。

1.实验动物：选取10周龄的C57/BL6J小鼠48只，体质量19~23 g，购自美国Clarles River公司(合格证号：18_0005c)和北京维通利华实验动物技术有限公司[合格证号：SCXK(豫)2023]，饲养于无特定病原体级别动物房，温度18℃~25℃，湿度40%~70%。

2.小鼠肺转移癌FLASH照射：配置SV2小鼠肺腺癌细胞(5×10⁶个/ml)悬浮液，取200 μl经尾静脉注射，以构建小鼠肺转移癌模型。以随机数表法将小鼠随机分为3组：转移癌组、常规照射组、FLASH照射组，每组6只。2周后，实施单次10 Gy全肺FLASH或常规照射。照射前采用异氟烷吸入麻醉。常规照射采用能量5.5 MeV，剂量率0.072 Gy/s的电子线；FLASH照射采用能量5.5 MeV，剂量率200 Gy/s电子线(法国PMB-Alcen公司，eRT6)，射野面积1.42 cm×1.42 cm。采用小动物CT(荷兰米尔勒国际实验室设备公司)监测小鼠正常肺容量变化，2次/周。残余肺容量(%)=(实际肺容量/首次肺容量)×100%。

3.小鼠全肺FLASH照射：取30只健康小鼠，以随机平行对照方法将小鼠随机分为3组：健康对照组、常规照射组、FLASH照射组；单次照射10 Gy。

(1) 照射方法：制作合适的铅模，照射前采用腹腔注射戊巴比妥麻醉。常规照射采用能量9 MeV，剂量率0.01 Gy/s的电子线(美国Varian公司，Vital Beam)。FLASH照射采用改造后的Varian 23CX加速器，能量9 MeV，剂量率120 Gy/s电子线。为保证照射的准确性和安全性，在照射前、照射过程中和照射后进行剂量学质量控制检验。实际剂量率测量采用Gafchromic HD-V2型免冲洗胶片(美国亚什兰公司)，采用FilmQATM Pro软件(美国亚什兰公司)分析胶片，建立剂量-灰度曲线，并计算剂量率、剂量深度曲线及离轴剂量分布。

(2) 肺组织标本采集及苏木精-伊红(HE)染色：每组各取5只小鼠，照射后12周摘取小鼠肺组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制备3 μm切片，脱蜡复水后，行HE染色，观察肺组织放射损伤情况。

(3) 血浆标本采集与分离：每组各取5只小鼠，照射后3 d摘取小鼠眼球取血，于4℃下放置1 h，3 000 × g离心10 min，收集血浆标本，冻存于-80℃冰箱备用。

(4) 血浆蛋白提取及消化：取适量样本采用美国安捷伦公司M3去血清高丰度亲和色谱柱去除小鼠血清中的高丰度蛋白，获得低丰度组分标本。加入蛋白提取液(SDT裂解法)提取蛋白质，利用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，然后进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。

(5) 蛋白酶解、iTRAQ标记及肽段分离：取上述样品依次加入二硫苏糖酸(DTT)和碘乙酰胺(IAA)，预冷丙酮沉淀蛋白，加入胰蛋白酶对样品酶解，采用美国赛默飞世尔公司C18固相萃取小柱对肽段进行脱盐，测量各样品肽段浓度后，采用iTRAQ法(美国应用生物系统公司)进行样品的同位素标记。标记后的肽段依次进行强阳离子交换色谱分级、高效液相色谱及质谱鉴定。

(6) 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析：取照射后3 d肺组织，通过TRIzol提取总RNA，反转录成cDNA。以SYBR Green试剂盒(上海碧云天生物技术公司)进行RT-PCR检测。引物由河南尚亚生物科技有限公司合成(表 1)。每组样品设3个复孔，以7500Fast RT-PCR仪(美国应用生物系统公司)进行扩增反应，按照2^-ΔΔCT计算每个基因对应的mRNA表达量。

表 1(Table 1)

表 1 目的基因的引物序列 Table 1 Primer sequences of target genes 目的基因 前引物序列(5′-3′) 后引物序列(3′-5′) GAPDH TGTGTCCGTCGTGGATCTGA TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG HSPA5 ACTTGGGGACCACCTATTCCT GTTGCCCTGATCGTTGGCTA EDEM1 CTACCTGCGAAGAGGCCG GTTCATGAGCTGCCCACTGA SOD1 AACCAGTTGTGTTGTCAGGAC CCACCATGTTTCTTAGAGTGAGG SOD2 CAGACCTGCCTTACGACTATGG CTCGGTGGCGTTGAGATTGTT P4HB TGCTGGTGGAGTTCTATGCC CTTCAGTTTTGCGGCAGCTT

表 1 目的基因的引物序列 Table 1 Primer sequences of target genes

4.数据分析与统计学处理：应用SPSS 22.0及GraphPad prism 7.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布者均使用 x±s表示。Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank法对比组间差异。应用UniProt数据库、Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4软件对质谱分析的肽质量指纹图谱和肽序列标签进行查库鉴定及定量分析。差异蛋白筛选标准为：比率＞1.2或＜0.83，且P＜0.05。对差异蛋白质集合进行基因本体论(GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析时采用Fisher精确检验，方差齐性检验采用Levene检验，对方差齐者组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。使用STING(http://string-db.org)预测蛋白质-蛋白质之间相互作用。然后，采用Cytoscape软件构建蛋白质相互作用网络(PPI)。利用CYTOHUBBA插件，以计算最大集团中心度(maximal clique centrality, MCC)算法寻找中心节点，选取排名前五的核心蛋白编码基因进行后续验证。两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

1.小鼠肺转移癌FLASH和常规照射后肿瘤控制情况：全肺照射后14 d，小鼠残余正常肺容量逐渐缩小。全肺照射后第28天，FLASH和常规照射组小鼠残余肺容量差异无统计学意义(P>0.05)；与转移癌组相比，FLASH和常规照射组残余肺容量差异有统计学意义(t=2.97，P < 0.05，图 1A)。当残余肺容量不足40%时，处死小鼠并统计生存率。FLASH和常规照射组小鼠生存率差异无统计学意义(P>0.05)；与转移癌组小鼠相比，FLASH和常规照射组小鼠生存率差异有统计学意义(t=3.28、3.07，P < 0.05，图 1B)。因此，FLASH照射对肺转移癌的控制情况和常规照射相同。

注：a与转移癌组比较，t=2.97，P < 0.05；b与转移癌组比较，t=3.28，P < 0.05 图 1 常规照射和FLASH照射对小鼠肺转移癌残余肺容量(A)与生存分析(B) Figure 1 Residual lung capacity (A) and survival rate (B) in mice with metastatic lung cancer following whole-lung FLASH and CONV irradiation

2.全肺照射后小鼠肺组织形态分析：如图 2所示，健康对照组小鼠肺组织镜下结构清晰正常，内皮细胞和上皮细胞形态规则，血管无扩张和充血，间质无渗出与增厚，未见明显炎性细胞浸润。与健康对照组相比，常规照射组小鼠肺组织肺泡壁增厚伴面积减少，肺间质增生，肺实质纤维化明显。FLASH照射组病理性损伤与常规照射组相比明显减轻。这表明FLASH照射较常规照射所致的肺损伤程度轻。

图 2 常规照射和FLASH照射在诱导小鼠肺组织纤维化中的差异HE染色×20 A. 健康对照组；B. FLASH照射组；C. 常规照射组 Figure 2 Differences in pulmonary fibrosis induction in mice between whole-lung FLASH and CONV irradiation HE staining × 20 A. Control group; B. FLASH group; C. CONV group

3.FLASH照射和常规照射蛋白质差异表达筛选：蛋白质谱分析显示，在接受全肺照射的小鼠血浆中共鉴定到蛋白质609个。其中，FLASH照射组与常规照射组相比，发生上调差异表达蛋白质有65个，下调差异表达蛋白质24个。FLASH照射组与健康对照组相比，49个差异表达蛋白质上调，27个下调。常规照射组与健康对照组相比，发生上调差异表达蛋白质有98个，出现下调差异表达蛋白质有54个。提示全肺照射所致肺损伤过程中差异蛋白以升高为主。

4.差异表达蛋白质GO功能富集分析：如图 3A所示，FLASH照射组与常规照射组相比，差异蛋白参与的显著上调生物学过程主要有应激反应、炎症应答等；细胞组分主要包括内质网、脂蛋白颗粒等；分子功能主要涉及脂质转运活性、转运活性等。发生显著下调的生物学过程主要有三磷酸腺苷(ATP)代谢过程、血管生成等；细胞组分主要包括呼吸链复合物、细胞外基质等；分子功能主要涉及细胞内配体-门控离子通道活性、细胞骨架结构体系等(图 3B)。

图 3 FLASH照射与常规照射后差异表达蛋白GO富集分析(前五位) A.上调；B.下调 Figure 3 GO enrichment analysis of differentially expressed proteins after whole-lung FLASH and CONV irradiation (Top five proteins) A. Up-regulated proteins; B. Down-regulated proteins

FLASH照射组与健康对照组相比，发生显著上调的生物学过程主要有对其他生物的防御反应、固有免疫应答等；细胞组分主要包括宿主细胞组分、内质网伴侣复合物等；分子功能主要涉及双链RNA结合、蛋白酶结合等。发生显著下调的生物学过程主要有ATP代谢过程、电子传递链等；细胞组分主要包括线粒体内膜蛋白复合体、核糖体亚单位等；分子功能主要涉及电子转移活性、核糖体结构组成等。

常规照射组与健康对照组相比，发生显著上调的生物学过程主要有对外界应激反应的调节、蛋白质水解等；细胞组分主要包括血液微粒，细胞外区域等；分子功能主要涉及酶调节活性、内肽酶调节活性等。发生显著下调的生物学过程主要有细胞粘附、免疫应答过程等；细胞组分主要包括细胞膜、跨膜区域等；分子功能主要涉及水解活性、肽活性等。

5.差异表达蛋白质KEGG通路富集分析：结果表明，未折叠蛋白应答、溶酶体途径等过程发生上调，代谢通路和氧化磷酸化等过程发生下调(图 4)。FLASH照射组与健康对照组相比，NOD样受体信号通路、蛋白酶体形成等过程发生上调，细胞外基质-受体互动通路和核糖体等过程发生下调。常规照射组与健康对照组相比，补体和凝血级联、类固醇生物合成等过程发生上调，紧密连接和细胞因子-细胞因子受体相互作用等过程发生下调。

图 4 FLASH照射与常规照射后差异表达蛋白KEGG通路分析(前10位) A.上调；B.下调 Figure 4 KEGG pathway analysis of differentially expressed proteins after whole-lung FLASH and CONV irradiation (Top 10 pathways) A. Up-regulated proteins; B. Down-regulated proteins

6.差异蛋白的PPI分析：应用STRING在线平台对差异蛋白编码基因进行聚类分析，结果显示部分差异蛋白编码基因之间存在多种相互作用关系(图 5A)。其中，FLASH照射组与常规照射组的前5个关键蛋白编码基因分别为HSPA5、P4HB、SOD1、SOD2、EDEM1(图 5B)。

注：B图中红色节点代表高得分的基因，黄色及橙色节点代表低得分的基因 图 5 差异蛋白编码基因PPI网络分析和核心基因的筛选 A. 差异蛋白编码基因的PPI网络分析；B. 核心基因的筛选 Figure 5 PPI network analysis of differentially expressed protein-coding genes and identification of hub genes A. PPI network analysis of differentially expressed protein-coding genes; B. Identification of hub genes

7.差异蛋白编码基因验证：采用RT-PCR技术检测各组小鼠肺组织中核心差异蛋白编码基因在mRNA水平的变化情况。结果表明，与FLASH照射组相比，常规照射组HSPA5、SOD1、P4HB、和EDEM1的mRNA水平升高，差异具有统计学意义(t=5.66~10.42，P＜0.05，图 6)。

注：a与常规照射组比较，t=5.66~10.42，P < 0.05 图 6 验证常规照射和FLASH照射后差异蛋白编码基因表达量 Figure 6 Expression validation of differentially expressed protein-coding genes following whole-lung CONV and FLASH irradiation

本研究通过构建小鼠肺转移癌模型证实FLASH照射具有和常规照射相同的肿瘤控制率，构建小鼠急性放射性肺损伤模型证实FLASH照射较常规照射能够减轻肺组织纤维化程度。并且采用血浆蛋白质组学手段，比较FLASH照射和常规照射过程中蛋白质的变化，发现脂质代谢、氧化磷酸化和未折叠蛋白应答等过程蛋白差异明显，这有利于揭示FLASH效应的分子机制。

放射性肺损伤可分为急性炎性渗出阶段和纤维化阶段^[6]。脂质代谢失调与放射性肺损伤的发生与发展密切相关^[7]。电离辐射通过间接作用所产生的活性氧攻击具有多不饱和脂肪酸的脂质，导致非酶促氧化过程，即脂质过氧化，从而诱导放射性肺组织损伤^[8]。Portier等^[9]采用超高效液相色谱-串联质谱技术定量分析了小鼠肺组织中37类氧化脂质的表达情况，结果显示FLASH照射后5 min小鼠肺组织中特异性氧化脂质表达水平降低，24 h基本恢复正常；氧化脂类的下调可能在FLASH效应中发挥重要作用。杨天宇等^[10]通过转录组学分析发现FLASH照射后小鼠肝脏组织的亚油酸代谢和花生四烯酸代谢较常规照射下调。蛋白组学具有检测直接、数据庞大的优势，但数据分析和挖掘极其重要。本研究采用MCC算法能够在整个蛋白质互相作用网络中获取节点的最大团中心性，结果显示全肺FLASH照射后小鼠血浆脂质代谢较常规照射下调。这种全局分析有利于更好地了解节点之间的相互关系和网络的整体结构。总之，上述研究初步证实了FLASH照射后正常组织中的生物活性脂质衍生物发生了变化，需要进一步的研究确定FLASH照射和常规照射如何影响脂质生物合成酶的转录和活性。

氧化磷酸化提供了用于生命活动(如组织的损伤与修复)的大部分ATP，维持机体代谢稳态^[11]。细胞氧化磷酸化水平受到组织内外环境中各种因素刺激的影响。接受全身照射的人急性淋巴细胞白血病小鼠移植癌模型显示FLASH照射敏感性与氧化磷酸化通路密切相关^[12]。小鼠肝脏组织接受FLASH照射后，氧化磷酸化水平较常规照射低下^[10]。本研究基于血浆蛋白组学证实小鼠全肺FLASH照射后氧化磷酸化水平较常规照射下调。可能的解释为电离辐射作为一种外源性刺激因素上调了组织的能量需求，增加了细胞代谢活跃度，从而改变了组织微环境，导致细胞氧需求增加^[13]。常规照射时由于持续氧供应，可满足细胞代谢的氧需要，故氧化磷酸化水平增加^[13-14]。FLASH照射由于瞬间消耗细胞内的部分氧分子，组织处于相对乏氧状态，故氧化磷酸化水平较常规照射下调^[15]。细胞乏氧会降低组织的辐射敏感性，因此，FLASH照射减轻正常组织放射损伤^{[1, 16]}。总之，FLASH照射后组织的氧化磷酸化水平较常规照射降低，有待从氧消耗调控氧化磷酸化的角度入手来进一步探索FLASH效应的分子机制。

内质网控制新生蛋白质的合成、易位、膜插入、N-糖基化、折叠和二硫键形成等^[17]。电离辐射后，机体正常组织在氧化应激等的刺激下，内质网内蛋白质合成与分解平衡受到破坏，产生内质网应激，进一步活化未折叠蛋白应答通路^[18]。FLASH照射后肝组织内质网蛋白质加工过程较常规照射上调^[10]。HSPA5编码的GRP78是位于内质网的一种重要的分子伴侣，在内质网腔内的蛋白质折叠和质量控制中发挥着关键作用，参与调控蛋白质合成与降解平衡，维持内质网稳态^[17]。而且，HSPA5是参与调控FLASH照射敏感性的核心基因之一^[12]。既往研究报道常规照射通过调控正常细胞未折叠蛋白应答通路中GRP78蛋白的功能，在促进正常组织修复和诱导正常组织放射损伤中发挥双重作用^[19-21]。低强度的内质网应激可激活未折叠蛋白应答通路，GRP78表达量上调，并与未折叠蛋白解离，抑制蛋白质合成、修饰与加工；同时，在EDEM1、P4HB等的协助下，抑制错误叠蛋白聚集、促进其降解，从而减轻内质网蛋白质负荷，恢复细胞稳态；高强度的内质网应激则过度激活未折叠蛋白应答通路，CHOP表达量上调，进而诱导细胞凋亡^[19]。在本研究中，富集分析表明FLASH照射后未折叠蛋白应答通路较常规照射后显著上调，且HSPA5、SOD1、EDEM1和P4HB为关键差异蛋白编码基因。这些差异蛋白能够减轻内质网应激或氧化应激水平，保护细胞免受应激反应的损伤，以维持自身稳态。总之，电离辐射后的应激作用在正常组织放射损伤过程中发挥重要作用，有待深入探讨。

值得注意的是，无论是FLASH或常规照射，生物体在电离辐射后会诱发一系列的反应，包括物理、化学和生物阶段。这些并非同时发生，而是一系列的连续事件，FLASH效应为超高剂量率照射后级联反应的结果^[1]。既往已对电离辐射的化学反应阶段进行了阐述^[22]。本研究中，重点关注电离辐射的生物应答阶段，尤其是初始应答阶段的基因转录及翻译过程。结果显示在FLASH和常规照射后，基因经历激活、转录及翻译等过程，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子，最终诱导不同的生物学效应。而且，不同的生物学过程，其最佳检测时间点有差异。因此，在进行FLASH效应的研究时，时间因素对生物效应的影响不可忽视，应摸索出最佳的检测时机。

综上所述，本研究证实常规照射和FLASH照射具有相同的肿瘤控制率，FLASH较常规照射显著减轻肺损伤。采用iTRAQ质谱技术，对接受全肺照射的小鼠血浆蛋白质进行研究，筛选出部分与FLASH照射减轻肺组织放射损伤相关的差异蛋白质及与之相关的信号通路。这将为进一步明确FLASH效应的生物学机制提供参考。

利益冲突  无

志谢 感谢瑞士洛桑大学附属医院放疗科团队对本文的指导与帮助，感谢埃帕兰日动物实验中心对本文提供的支持

作者贡献声明  罗辉、王刘祥、Ron Leavitt、Jackie Romero、Aymeric Almeida负责实验操作，数据整理分析及论文撰写；杨成梁、李娜、王雪楠、毛荣虎、马蕾杰、雷宏昌负责部分论文撰写及文献整理；葛红、Marie-Catherine Vozenin指导论文命题、构思及修订