电离辐射能量沉积在DNA分子上可损伤碱基、脱氧核糖和磷酸二酯键，当损伤未能正确修复时会引起体细胞突变，类型包括碱基置换，小片段插入缺失、拷贝数变化、染色体重排^[1-2]。这些突变引起的基因功能失调是电离辐射致癌效应的分子基础^[3-5]，深入研究电离辐射诱导的突变规律对理解辐射致癌效应具有重要的意义。

近十年来，以高通量测序为基础的全基因组突变检测技术日益成熟。有研究表明，1个肿瘤样本中存在着数千到数万个体细胞突变，从这些突变中可以提取到与某些致癌因素相关的特征，称为突变签名(mutational signatures)^[6-9]或突变印迹^[10]。

肿瘤的发生发展是多因素共同作用的多阶段发展过程，通过分析突变签名可知晓不同致癌因素的贡献度，从而明确肿瘤的发病机制。本文回顾了突变签名的研究历史、分析方法与生物学意义，全面总结了电离辐射诱导的突变签名的研究现状，以期为电离辐射致癌效应的机制研究提供参考。

一、突变签名

1. 历史回顾：全基因组突变签名分析始于2012年，来自英国剑桥大学桑格研究所的Nik-Zainal等^[11]采用非负矩阵分解(nonnegative matrix factorization，NMF)算法分析了21例乳腺癌样本的突变数据，发现了5种单碱基置换突变签名(single-base substitution signature，SBS)，其中之一是乳腺癌易感基因BRCA缺陷引起的特异性突变签名。2013年，Alexandrov等^[6]采集了30种不同肿瘤的506例全基因组和6 535例外显子测序数据，分析生成了21种SBS。2020年，他们进一步对全基因组泛癌分析(pan-cancer analysis of whole genomes)中的4 645例全基因组和19 184例外显子测序数据进行了系统分析，将SBS的类型增加到了49种，并新增了11种双碱基置换签名(doublet-base substitution signature，DBS)和17种小片段插入缺失签名(small insertion-and-deletion signature，ID)，通过分析部分突变签名的特征，可推测突变签名与致癌因素的相关性^[7]。体外细胞实验进一步揭示了外源性致癌因素^[12-13]和内源性DNA修复机制缺陷^[14-15]与突变签名的因果关系，为系统解析肿瘤病因提供了直接的实验证据。

近两年来，全基因组测序的肿瘤样本数量已经超过了1万例，突变签名种类也随之增多，并鉴定出了组织器官特异性的突变签名^[16]。截至2023年10月，COSMIC(Catalogue of Somatic Mutational in Cancer)网站提供的突变签名数据库更新到v3.4(https://cancer.sanger.ac.uk/signatures/)，收录了SBS、DBS、ID、拷贝数突变签名(copy number signature，CN)、结构变异突变签名(structural variation signature，SV)、RNA单碱基置换突变签名(RNA SBS)共6大类，并提供了SigProfiler软件工具供突变签名分析^[17]。Signal是另一个突变签名数据库(https://signal.mutationalsignatures.com/)，其特点是涵盖了组织器官特异性突变签名、基因编辑与致癌因素的细胞实验数据，并提供在线分析平台，用户上传突变文件后即可进行突变签名的解析^[18]。

2. 突变签名的分解方法：肿瘤体细胞突变是多种因素共同作用的结果，这些因素的作用强度与持续时间各不相同，诱导的突变签名也各不相同，两者之间是复杂的非线性关系。从数学的角度来看，突变签名的分解属于盲源分离问题^[19]。此处以SBS为例介绍突变签名的分析过程。DNA双链结构上胞嘧啶(cytosine，C)与鸟嘌呤(guanine，G)配对，胸腺嘧啶(thymine，T)与腺嘌呤(adenine，A)配对。分析SBS首先需建立相应的数学模型，考虑突变碱基的不同，SBS可分为6种，分别为：C > A、C > G、C > T、T > A、T > C、T > G，如再考虑突变位点两侧的碱基不同，就会产生4 × 4 × 6 = 96种，这种分类方法称为SBS-96通道法，接着按照SBS-96通道将体细胞突变数据转换成矩阵，最后通过NMF方法将其分解为两个较小的矩阵，分别表示不同致癌因素的突变签名和相应的强度^{[10, 19]}。

3. 突变签名的生物学意义：根据SBS在96个通道上分布的不同，可以将特定的SBS归因到某种致癌因素的暴露，如SBS1的特征是在NpCpG序列中C > T的突变，推测是甲基化C脱氨基转变为T，属于内源性突变过程。SBS1被发现广泛存在于各类肿瘤样本中，被认为属于类时钟(clock-like)突变签名^{[6, 8]}。个体的年龄越大，或是细胞分裂次数越多，其突变分解后SBS1越显著。SBS18的特征是C > A的突变，推测是8-氧代鸟嘌呤(8-oxoguanine，8-oxo-G)错配T导致的，由于8-oxo-G是氧自由基损伤DNA的产物，所以SBS18被认为是氧自由基损伤的突变签名。当8-oxo-G DNA糖基化酶或mutY DNA糖基化酶失活时，细胞不能有效切除8-oxo-脱氧鸟苷进行修复，导致SBS18明显增多，多见于结直肠癌与肾上腺皮质癌^{[18, 20-21]}。与SBS1、SBS18类似，很多突变签名可根据其特征归因至特定的致癌因素，但还有大量的突变签名的形成机制尚不明确^{[8, 16]}。

二、电离辐射诱导的突变签名

1. 细胞实验来源的突变签名：对体外培养细胞进行电离辐射照射，形成单克隆群体后进行全基因组二代测序分析，是得到电离辐射诱导的突变签名的常用方法，细胞实验周期较短、操作较易、数据一致性较高。缺点是部分永生化细胞不是二倍体，可能会影响突变检测的准确性，而且提取到的突变签名存在于电离辐射处理后的存活细胞，而不是电离辐射诱导的肿瘤细胞。

2019年，Kucab等^[12]综合报道了79种致癌环境因素在人诱导多能干细胞中产生的突变签名，其中包括了2 Gy γ射线的处理，细胞在照射后继续培养7 d，然后进行单克隆培养并测序分析。虽然数据显示γ射线诱导的微同源缺失水平升高，但未分离得到有效的突变签名，这可能与照射剂量较低、恢复时间较长、突变数量较少有关。Kageyama等^[22]采用医用直线加速器对食管癌KYSE-450细胞进行总剂量60 Gy的分割照射，每次照射剂量3 Gy，共20次，对存活的4个细胞克隆进行测序分析，分解得到的突变签名类似SBS3，与同源重组修复缺陷有关，是一类常见于BRCA基因突变的乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌的突变签名。

2. 动物实验来源的突变签名：通过建立电离辐射诱导肿瘤的小鼠模型，可以模拟人体内的肿瘤发生发展过程，是较为理想的实验模型，而且对小鼠全外显子突变的研究提示电离辐射诱发肿瘤的突变签名具有一定的特异性^[23-24]。COSMIC数据库中提供了小鼠的各类突变签名，其与致癌因素的关系和人类的数据类似，可用于分析电离辐射诱导的突变与致癌效应的关系。但是电离辐射难以在野生型小鼠中诱导肿瘤发生，最常用的动物肿瘤模型是p53基因缺陷型小鼠，一般需要数百天的时间才能诱发肿瘤。由于p53对于基因组稳定性具有重要的作用，其功能缺失可能会对突变签名分析产生影响。

在一项全外显子测序研究中，可诱导表达p53 shRNA的转基因小鼠下肢照射X射线30或40 Gy，然后诱导shRNA表达降低p53水平持续10 d，继续饲养269~604 d(中位时间449 d)，可在照射部位诱导产生软组织肉瘤，分析显示突变签名与DNA错配修复机制缺陷有关，是一类存在于微卫星不稳定性肿瘤样本的突变签名^[25]。Li等^[26]用0.5 Gy铁离子或γ射线全身照射p53缺失小鼠可诱发乳腺癌，对21例此样本的全基因组测序显示，不同传能线密度(linear energy transfer，LET)射线引起的单碱基置换突变数量差异没有统计学意义，突变大多数分布在非编码区。采用NMF法将突变分解后形成3类SBS，分别类似于人类的SBS18、SBS5与SBS3，其中SBS18水平在γ射线处理组显著高于铁离子处理组，可能与低LET辐射通过间接作用产生自由基损伤DNA有关。SBS5类似于SBS1，是类时钟突变签名，而SBS3与非同源末端连接修复机制缺陷有关，提示与电离辐射诱导的DNA双链断裂修复有关，这两种SBS在不同LET辐射处理组中并无差异。

造血干细胞是放射敏感性最高的细胞之一，电离辐射诱发的造血干细胞恶性转化与白血病的发生密切相关。在一项电离辐射诱导造血干细胞突变的研究中发现，小鼠全身照射后造血干细胞的SBS与氧自由基损伤有关，数据显示在空白对照组中SBS5占75%、SBS1占25%，两者均是类时钟突变签名，是随着年龄和细胞分裂次数增多自发形成的，而在照射组中SBS5的占比显著降低，取而代之的是SBS40，但SBS40的生物学意义尚不明确^[27]。

3. 人类肿瘤样本来源的突变签名：目前已经有海量的人类肿瘤样本全基因组测序数据，但电离辐射诱发的肿瘤样本仍然匮乏，比较常用的样本是放疗患者治疗后继发的二次肿瘤，但这部分人群是肿瘤原发患者，内源性基因组修复功能可能存在某些缺陷。而且由于目前没有明确的电离辐射诱发肿瘤的生物学标志，二次肿瘤与电离辐射的因果关系难以判断，一定程度上限制了数据分析的可靠性。Behjati等^[28]报道了12例发生在放疗照射野二次肿瘤的突变数据，结果显示共同的突变特征为小片段缺失和平衡倒位的数量增多，但没有提取到共有的SBS。Kim等^[29]研究了11例放疗诱导肉瘤的突变签名，并联合分析了上述Behjati等^[28]报道的9例肉瘤样本，发现SBS分类比例与原发肉瘤类似，但与非同源末端连接过程有关ID8的比例显著升高，提示放疗诱发的肉瘤具有特征性突变签名，可为鉴定放疗二次肿瘤提供线索。

Kocakavuk等^[30]采用了另外的策略，他们从胶质瘤纵向队列研究中选取了190例样本，对比分析了原发与放疗后复发胶质瘤的突变签名区别，还选取了3 693例放疗后转移性肿瘤样本进行分析，结果显示在与放疗有关的突变签名有SBS2、SBS13与ID8，前两者是与载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide，APOBEC)的胞嘧啶脱氨酶活性有关的突变签名，与DNA双链断裂修复有关，ID8是与非同源末端连接有关，还发现小片段的缺失突变数量与患者的预后有关。

1986年发生的切尔诺贝利核电站事故释放了大量放射性核素进入环境，流行病学调查发现儿童期¹³¹Ⅰ暴露人群的甲状腺乳头状癌发生率显著升高^[31]，这些肿瘤样本中可能会留有与¹³¹Ⅰ内照射相关的突变签名。Morton等^[32]对来自乌克兰的440例甲状腺乳头状癌样本进行分析，其中81例事故后出生的样本作为对照，数据显示70%的SBS、54%的ID为类时钟签名，与氧自由基损伤相关的SBS18只占0.9%，与DNA双链断裂修复有关的ID8与ID6占19.1%，SBS在不同剂量暴露组之间没有明显差异，ID8的份额随着剂量增高而增多，提示非同源末端连接修复产生的突变对甲状腺乳头状癌发生有一定的贡献。Goerlitz等^[33]收集了7例职业性²³⁹Pu暴露人员的肝癌样本，全外显子突变分析提取到4种签名，通过与COSMIC数据库对比发现可能与DNA错配修复和微卫星不稳定性有关。

三、小结与展望

分析电离辐射有关的突变签名是理解放射生物学效应的一条新途径。全基因组测序分析提取到的与电离辐射有关的突变签名中，氧自由基损伤签名是电离辐射通过间接作用损伤DNA的特征，同源重组与非同源末端连接修复签名反映的是DNA双链损伤修复过程，类时钟签名可能与电离辐射诱导的细胞衰老表型有关。

尽管突变签名研究领域取得了显著进展，但其理论体系与分析方法仍然存在一定局限性。例如，SBS-96通道法只考虑了突变位点上下游各一个碱基，以便于构建数学模型进行SBS的分解，而实际上单碱基置换突变可能涉及更多的因素，SBS-96通道法并不能完全反映突变形成的生物学过程。此外，最常用的NMF分解法是一种纯粹的数学方法，虽然可以分解得到超过100种SBS，但其中部分SBS尚不具备生物学意义。因此，进一步改进突变签名的理论模型，构建与生物学意义对应的突变签名分解方法是该领域亟待解决的问题^[34]。

吸烟与电离辐射均是明确认定的致癌因素，得益于吸烟相关及无关肺癌样本的来源充足，COSMIC数据库已收录了多个吸烟特有的突变签名，为肺癌的病因鉴定提供了证据支持^[7]。然而，由于电离辐射诱发肿瘤的复杂性，涉及电离辐射的类型、照射方式、照射剂量以及肿瘤病理类型的多样性，加之样本数量的限制，尚不能识别出统一的电离辐射突变签名。随着COSMIC数据库与分析流程的不断发展，特别是与DNA双链断裂修复紧密相关的ID、CN、SV分类体系的日益完善，有望从电离辐射诱导的突变数据中发掘出全新的特征，甚至可能参照吸烟突变签名，形成一类专属于电离辐射的突变签名，这将在基因组水平上拓展对电离辐射致癌效应的科学认识，有助于建立肿瘤发生与电离辐射暴露之间的因果关系及剂量效应关系，可为随机效应的防护提供重要的科学依据。

利益冲突  无

志谢 感谢江苏省高校优势学科建设工程项目对本研究的支持

作者贡献声明  王婷负责文献调研和论文撰写；俞苏桐、李婕、郭怡含协助论文修改；俞家华指导论文撰写与修改