2024, Vol. 44
随着核能与核技术利用的快速发展和不断扩大，大规模核辐射事件发生的概率也随之增加[1]，在大规模放射性紧急情况下，剂量估计对于过度照射人群的健康风险评估和治疗计划具有重要意义[2]。生物剂量学是指通过生物终点或生物标记物的变化来估算电离辐射照射后的剂量[3]，可用于大规模辐射事件中疑似受照者的初步分类以及生物剂量重建[4-5]，当物理剂量无法提供或不足时，生物剂量法是估计个人所受辐射剂量的基本工具[6]。
在众多用于生物剂量测定的细胞遗传学终点中，双着丝粒染色体测定法(dicentric chromosome assay, DCA)是辐射生物剂量估计的首选方法，由于其辐射暴露的高特异性和极低的基线频率，一直以来都被认为是生物剂量学的金标准[7]，同时也是国际标准组织(ISO)和国际原子能机构(IAEA)建议用于紧急情况的方法[8-9]。DCA已被用于评估暴露于放射性事故后的人员辐射剂量，包括日本东海村[10]、切尔诺贝利[11]及福岛核事故[12]等。然而，传统DCA主要依靠人工分析，其检测费时费力、通量低，在应急情况下用于剂量测定具有挑战性[13]，因此对于涉及大量人员的紧急情况，双着丝粒体(dicentrics, dic)的自动化分析便成为首选[14]。近年来，世界各地的生物剂量学实验室采取了大量努力，以提高DCA在大规模放射或核伤亡事件中的应用。本文介绍了双着丝粒染色体自动分析检测方法的研究进展，为国内同行开展基于双着丝粒染色体指标估算生物剂量研究提供参考。
一、双着丝粒染色体半自动分析研究 1、基于吉姆萨染色的dic半自动分析随着自动图像分析技术的发展，出现了商品化的可以进行快速DCA的全自动染色体扫描分析系统，其中具有代表性的为Metafer(MetaSystems，德国)[14]。基于该系统，自动双着丝粒染色体评分(automatic dicentric scoring, ADS)方法被开发并获得了广泛应用。该方法通过使用机器学习图像处理技术在中期图像中自动化dic识别来简化DCA过程[15]，自动化过程包括中期分裂像查找(MSearch软件)、高分辨率图像捕获(AutoCapt软件)和dic自动评分(DCScore软件)，由于自动评分系统的误报率较高[16-17]，为了精确估计吸收辐射剂量，人工验证便成为不可避免的步骤，因此产生了术语半自动分析(semi-automated analysis)[18]。
法国辐射防护与核安全研究所(IRSN)为最早研究ADS的机构之一。2009年，Vaurijoux等[19]借助DCScore软件构建了“ADS剂量-效应曲线”，并利用达喀尔事故中46名受照者的样本进行测试，研究发现，在相同的灵敏度下，使用ADS进行自动检测可以比人工评分快3倍。在实际事故中，ADS对500~1 000个细胞的分析比人工评分在相似的时间内对受害者进行了更精确的分类[20]，证明ADS方法可用于分诊，并代替人工评分法用于个人剂量估计。Vaurijoux等[21]和Gruel等[22]的模拟实验表明，该方法不仅能够估算局部照射，当分析足够的细胞数时还具有区分不同程度暴露的能力，可用于大规模核辐射事件发生时的人员分类。近年来，ADS方法已在全球多个国家推广并获得广泛应用[15-18, 23-26]。在MULTIBIODOSE项目[23]框架内，已经在6个欧洲生物剂量测定实验室建立了半自动dic评分方法，这项工作的结果表明，半自动化的dic评分可作为大规模辐射事故中的高通量筛选工具。
国内基于dic半自动分析剂量估算的研究较少。戴宏等[25]基于DCScore软件构建了dic半自动识别的剂量-反应曲线，研究发现该方法可使工作量减少96%，速度提高约7倍，但验证结果发现，在0.25 Gy剂量点的偏差高达52%，剂量-效应曲线还需进一步地优化。此外，该团队还利用3梯度扫描系统对120、480和960个细胞进行了快速剂量估计[26]，用这一概念提高了染色体扫描和分析速度，减少了估计辐射剂量所需的拍摄图像数量。韩林等[17]也基于Metafer系统建立了基于60Co γ射线离体照射人外周血的dic半自动分析剂量-效应曲线，并与人工分析进行比较，结果证明dic半自动分析可将生物剂量估算效率提高6倍以上，同时也提出，在一定的照射剂量范围内，DCScore全自动检测dic估算的剂量用于临床分诊是可行的。
由于半自动评分提升效率的幅度有限，且染色体中期质量对其剂量估计的可靠性和准确性非常关键[1, 14]，研究者们对该技术进行了不同形式的改进和优化。Balajee等[27]基于半自动评分方法，开发并优化了一种小型化的高通量DCA(mini-DCA)技术，该技术仅仅利用指尖采集50~100 μl全血样本，在包含96个容量为1.4 ml的条形码管的多管基质中进行，可以快速处理大量样品，在不影响剂量估计准确性的同时将样品处理时间减少了4倍。Ryan等[14]基于Metafer系统，对半自动及全自动dic检测进行了优化和验证。通过测试中期细胞选择的各种灵敏度来确定染色体质量和中期细胞数量，建立了多个图像训练库进行机器训练，以提高dic分析算法的特异性。该研究清楚的证明，当选择适合的灵敏度时，自动化模式和半自动化模式估计的辐射剂量仅相差0.03 Gy，自动化模式和半自动化模式之间的差异无统计学意义。
半自动评分方法的优点在于其在估计辐射剂量方面的性能与人工DCA相当，能够显著减少评分时间和人员的观察疲劳，并提高通量[16]，但由于仍需要额外的人工干预来纠正假阳性结果，其提升效率的幅度有限，此外，该方法需要更多的细胞，对中期染色体扩散质量要求更高[27]。DCScore算法的另一个局限在于其不能区分双着丝粒染色体和多着丝粒染色体[14, 27]。因此，DCScore算法的进一步改进和完善，Metafer系统中期图像寻找算法的改进，染色体制备技术的发展，将是推动基于Metafer系统的dic全自动分析技术的有效策略，能够助力其实现真正意义上的全自动、快速剂量估算。
2、基于端粒和着丝粒染色的dic半自动分析传统的姬姆萨(Giemsa)染色分析是生物剂量测定最常用的方法，其染色程序短、简单且成本低，但染色体畸变的鉴定和评分比较困难且耗时[28]。利用荧光原位杂交(FISH)技术可以敏感、轻松和准确地对异常染色体进行评分，但该分析技术中应用的探针非常昂贵，并且杂交时间较长，通常超过12 h[28]。端粒和着丝粒(telomere and centromere, TC)染色，即PNA-FISH克服了Giemsa染色和FISH的缺点，其杂交时间短，成本低且易于识别染色体畸变[28]。
M′kacher等[29]使用Cy-3标记的肽核酸(PNA)探针进行端粒染色，使用FITC标记的PNA探针进行着丝粒染色，改进了DCA及所有不稳定染色体畸变的检测方法，该方法还可以消除均匀染色或仅着丝粒染色无法检测到的假阳性[29-30]。与此同时，研究者还开发了一种荧光图像自动化分析系统(TCScore)，实现了TC染色后的自动化评分，并将基于Giemsa的DCScore检测与TCScore检测进行比较，发现TCScore检测到95%的人工评分的dic，而DCScore仅为50%，说明基于PNA-FISH的dic检测比基于Giemsa染色法的灵敏度和准确性更高[30-31]。与依赖于Giemsa染色的传统技术相比，该方法缩短了分析时间，同时大大提高了精度，且减少了对高水平评分员的需求[29]。在2016年开展的RENEB(欧洲生物和物理回顾性剂量测定网络)和EURADOS(欧洲辐射剂量组)实验室间比对[32]中，常规DCA半自动分析与DCA-TC法进行了比较，研究指出，TC染色的引入不仅使dic和着丝粒环的评分更加可靠和稳健，而且还允许检测不同类型的无着丝粒断片，从而精确计算DNA双链断裂(DSB)的数量，该比较也证实了DCA-TC方法的准确性和可靠性。
综上，通过将TC染色纳入“金标准”技术，正常染色体及其他畸变的鉴定得到了极大的改善，且该技术显著减少了传统DCA法中劳动密集型和耗时的缺点[33]。值得一提的是，该研究中玻片扫描、图像采集仍然依赖于Metefar系统。端粒和着丝粒染色的引入使得该系统在灵敏度方面取得了显著的提高[33]。
二、双着丝粒染色体全自动分析研究 1、基于传统机器学习方法的dic自动分析加拿大Rogan小组开发了自动双着丝粒染色体识别软件(automated dicentric chromosome identifier，ADCI)[34-36]，该软件使用图像处理技术从完整中期细胞中提取有效染色体，并使用基于机器学习(machine learning, ML)的算法来识别着丝粒、区分dic与单着丝粒染色体及其他对象，计算生物剂量学校准曲线并自动进行辐射剂量估计。ADCI算法和软件实现了完全自动化的辐射生物剂量测定，处理速度快并且无需人工参与，该软件显著减少了手动验证dic的必要性，并加速了剂量估计[34-36]。
样品中期图像质量及机器学习算法的不足是影响该软件分析准确性的主要因素[36-38]。基于此，该研究小组对图像选择模型和剂量估计的准确度方面进行了持续改进。Liu等[37]研究并测试了一套基于形态学的滤波器，通过图像分割和过滤方法，可以去除次优中期细胞图像并消除假阳性(false positive, FP)dic，与以前版本的ADCI产生的结果相比，在大范围的辐射暴露水平下，包含这些滤波器的FP dic率降低了约55%，大大提高了dic分类精度。之后，Li等[38]确定了基于该滤波器的最佳图像选择模型，应用该模型后，使用未知暴露样本产生的估计剂量在物理剂量的0.5 Gy以内。为了改进ADCI区分全身暴露和局部暴露的能力，Shirley等[39]描述了一种改进的受污染泊松分布法，但仍然需要进一步研究来降低FPs的影响。此外，通过使用超级计算机简化剂量估计[40]，高性能ADCI(high-performance ADCI, ADCI-HT)在潜在的大规模伤亡辐射事件中能够提供及时和可行的剂量估计。
ADCI的这些改进确保了对急性辐射暴露的及时、可重复和准确的剂量评估。该方法的局限性在于，图像选择模型无法过滤所有的FPs，无法达到与人工相同的整体精度，特别是对于可变质量的标本[38, 40]。并且该软件的中期图像仍然需要MetaSystems的AutoCapt模块，无法完全独立运行[1]。
国内研究者针对dic自动识别的研究较少。北京航空航天大学研究团队提出了一种基于机器学习算法的双着丝染色体自动识别算法[41]，采用了分水岭分割算法对细胞图像进行分割，提取单独的染色体图像，随后采用聚类算法对dic进行自动识别并计数。这种自动识别算法采用的机器学习算法为简单聚类，在大剂量辐射下，算法识别准确率(真阳性率)仅75.6%，在低剂量下，错误分割导致识别精度较低(30%~40%)[41]。
2、基于成像流式细胞术的dic自动分析近年来，研究者们在dic快速、高通量识别方面做了很多改进，但都依赖于显微镜分析，并且受到玻片制备、图像获取和人工评分时间的限制。通过流式细胞术实现样品分析的自动化可以改进这些问题。然而，传统流式细胞仪的灵敏度不足以可靠地检测单着丝粒和dic之间的差异，也不足以区分dic与染色体聚集体或碎片。成像流式细胞仪(IFC)是一种可以自动成像和分析处理过的血液样本以寻找辐射损伤标志物的技术，借助该技术可以解决传统流式细胞术遇到的一些缺点，对荧光标记的染色体进行快速、自动化地分析。因此，针对IFC修改基于显微镜的生物剂量测定技术，有望实现高通量生物剂量测定[42]。
Beaton等[43]与Beaton-Green和Wilkins[44]开发了一种基于成像流式细胞术分析染色体损伤进行生物剂量测定的方案。从全血样本中分离外周血单核细胞(PBMC)，并用植物血凝素(phytohemagglutinin, PHA)和秋水仙胺培养。孵育48 h后，分离染色体，用荧光染料染色DNA，并用着丝粒探针标记，从而鉴定单个染色体。此外，通过使用扩展景深(extended depth of field, EDF)选项，可以将视野中的所有染色体聚焦，斑点计数功能允许自动计数每条染色体上的着丝粒数量，并量化dic频率，由此，可以生成校准曲线并进行生物剂量估计。为了提高方法的敏感性和特异性，Beaton-Green等[45]对分离染色体悬浮液的制备和图像分析方法进行了整体改进，以产生更高质量的可评分染色体，主要包括，将加入秋水仙胺的时间由培养开始修改为最后4 h加入，降低了其对淋巴细胞的细胞毒性，改善了染色体小而紧密的问题；通过使用无RNA酶的移液器和试管，减少了样品的降解，使得染色体在溶液中更加稳定(5~6周)；将DNA染色剂修改为DRAQ5，与PI和Hoechst 33258相比，导致的噪声和与邻近通道的串扰最少，同时针对DRAQ5门控策略也进行了相应的修改。
利用IFC自动检测dic可以消除玻片制备、图像获取和人工评分时间的限制，并允许悬浮样品在处理后立即进行分析，大大节省了分析时间[42, 45]。此外，自动样品处理系统的开发将有可能增加对大量样品的自动化分析，以实现高通量生物剂量测定[42]。其局限性在于，与典型的自动和半自动评分一样，其假阳性背景水平高于人工评分，如传统DCA法检测的染色体畸变本底值为0.05%~0.1%，而成像流式细胞术检测的结果为3%[43]，且由于IFC-DCA的终点是每个染色体群体的dic频率，因此无法区分局部暴露。未来，需要进一步的工作来优化样本制备及图像分析等技术，以降低假阳性率[43]。
3、基于高通量机器人平台的dic自动分析美国哥伦比亚大学研究人员研制了快速自动化生物剂量测定工具RABiT-Ⅱ(the second-generation Rapid Automated Biodosimetry Tool Ⅱ, RABiT-Ⅱ)[46]，RABiT-Ⅱ使用商用高通量筛选(high throughput screening, HTS)系统，由机器人、液体处理设备和成像仪组成，采用96孔板自动制备样品，能够实现批量检测。随后，研究人员基于RABiT-Ⅱ开发了全自动多孔板DCA测定平台[47]，从样品装载到染色体评分，所有操作均由RABiT-机器人系统、平板成像仪和定制软件FluorQuantDic完成，无需人工干预。该检测平台仅需30 μl血样，使用肽核酸(PNA)或桥接核酸(BNA)探针进行着丝粒染色，并修改了传统的着丝粒FISH染色程序，简化了图像处理，将培养结束后细胞的处理分析时间由传统FISH的2 d缩短至3 h，并且由于其在多孔板中进行，可以同时检测大量样品，增加DCA的通量，潜在地允许在不使用经验丰富的细胞遗传学评分者的情况下，比传统技术提供的dic分析能力高出几个数量级。为了评估剂量-反应估算的准确性，将RABiT-Ⅱ DCA与传统DCA进行比较，发现RABiT-Ⅱ DCA在1 Gy时相对偏差较大(63%)，在高于3 Gy以后能够较准确地估算剂量(15%以内)[47]。
RABiT-Ⅱ DCA能够在更短的时间内完成着丝粒FISH染色和测量，实现快速高通量的剂量估算，在大规模辐射事故下有更明显的优势和应用价值。其局限性在于，RABiT-Ⅱ DCA对双中心的筛选侧重于单个染色体，而不是分析整个中期分裂相，因此无法提供关于辐射剂量分布不均匀性的信息，不能确定非均匀照射的局部剂量[47]。此外，由于分辨率较低，该系统在低剂量下的假阳性较高，因此还需要进一步优化评分算法、实验方案等，提高剂量估算的准确性[47]。
4、基于深度学习的dic自动分析深度学习(deep learnning, DL)是一种强大的机器学习形式，使用多层神经网络结构从原始输入数据中逐步提取更高级别的特征[48]。自2012年以来，深度学习在图像分类方面表现出极高的性能[49]。由于医学数据的稀缺性和可变性，人工制作的特征和阈值往往不能很好地泛化医学图像[49]，深度学习系统则可以在没有任何领域专家干预的情况下从数据中提取特征和学习决策阈值。在生物剂量学领域，深度学习已被应用于核型分析且准确率较高[50-52]，但dic的检测仍然是一个持续存在的问题，因为它处理的是结构上的微小差异，由于标记数据的缺乏和实验室和批次之间数据的变化，这一差异一直具有挑战性[49]。
卷积神经网络(CNN)是目前最先进的图像处理算法，可用于分类、分割和检测。在数据充足的情况下，CNN在图像分析方面优于传统的计算机视觉算法。近年来，CNN技术被应用于染色体分类，Wadhwa等[49]提出了基于InceptionResnetv2(CNN的一种)的深度学习dic分类方法。首先将图像作为输入，通过YOLOv4进行处理以检测和提取单个染色体，通过基于InceptionResnetv2的分类器接受或拒绝图像，接受的染色体通过另一个基于InceptionResnetv2的分类器进行分类，将可分析的染色体分类为单着丝粒染色体或dic，并根据最终的染色体计数接受或拒绝图像。测试结果证明，该系统对dic鉴定的准确率可以达到94.33%。
北京航空航天大学研究团队提出了基于吉姆萨染色自动显微成像的两阶段卷积神经网络dic图像高精度自动识别算法[53]。采用基于K-Means的自适应图像分割和分水岭分割算法对黏附染色体团块进行自动分割。第一阶段CNN用于识别所有染色体图像中的双着丝粒染色体图像，第二阶段CNN用于特异性识别双着丝粒染色体图像。这种两阶段的CNN识别方法可以有效地检测出隐藏着丝粒、扩展不良且长臂缠结及三着丝粒染色体的图像。新型两阶段CNN方法染色体识别准确率99.4%，灵敏度为85.8%，有效降低了FP dic的频率。据统计，新型自动识别方法分析100张中期细胞图像大约需要1 500s，可比手动检测快20倍，显著提高了生物剂量评估的速度[53]。但该团队的研究也存在不足，主要表现在算法较为简单，仅采用两个简单的8层网络分布识别dic；数据集存在较大偏差，在验证两阶段CNN的识别性能时发现223个dic，其中42个被错误识别，实际识别准确率只有85%不到，且由于训练库中只有两百多个dic，训练出的算法在实际应用中的性能很难保证。
韩国辅项科技大学开发了一种基于深度学法方法的DCA自动剂量估算系统(deep learning-based automated dose estimation system, DLADES)[54-55]。该系统由3个阶段组成。在第1阶段，使用基于深度学习技术的图像滤波神经系统(image filtering neural network, IFNN)对用于剂量估计的原始染色体图像进行初始滤波，其滤波精度达到了99%；在第2阶段，引入基于深度学习的目标检测算法——特征金字塔网络(feature pyramid network, FPN)来识别和计数染色体，用于计数和识别的神经网络的准确率超过了97%和90%；在第3个阶段，使用该系统构建了剂量响应曲线并进行剂量估计，结果表明在剂量超过1 Gy后所得的估算结果与实际照射值相比误差较小(1.29%~6.50%)。据报道，DLADES对患者的剂量估计时间在20 min内，而专家通常需要大约2~3 d，证明了DLADES具有良好的精度和计算效率[54-55]。该研究的局限性在于，DLADES在低剂量下准确性较低，原因包括用于计数的神经网络检测dic时产生的假阳性相对较多；建立剂量-反应曲线时使用的样品数量不足，导致存在偏差；以及验证数据不足导致的不确定性。未来，需要获得足够的数据来提高和验证所提出方法的准确性。
三、展望近年来，在开发用于大规模伤亡事件后的高通量生物剂量测定方法方面付出了很多努力。虽然已经提出可使用新兴技术，包括基因表达、蛋白质和代谢组学标记物等来进行快速分诊，但这些方法都不够准确，无法有效地对受照人群进行辐射剂量分类，DCA法仍然是估计个体暴露首选的生物剂量计[40]。针对dic的自动检测已经做了很多工作，但大多数生物剂量实验室仍然使用传统或者半自动系统进行常规程序。基于图像处理及机器学习的自动检测方法已经被成功地应用于dic检测，由于不同的成像设备、不同的处理方法，往往特定于单一实验室，无法推广应用。新的方法也被尝试应用于dic检测，如基于端粒和着丝粒染色法、基于深度学习的算法来实现dic的精准智能识别等。未来，结合商业化的自动接种及收获系统、全自动细胞遗传扫描系统、人工智能分析系统、细胞遗传信息管理系统，将有望建立从样本制备、图像采集到dic自动分析及剂量估计的全流程生物剂量自动估算平台，真正实现自动化、智能化、高通量的生物剂量测定，为潜在的大规模伤亡事件提供及时和可行的剂量估计。
利益冲突 无
作者贡献声明 孟倩倩负责起草论文、修订论文；张忠新、任越负责文献调研与整理；张睿凤负责审核论文
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