放射治疗联合程序性死亡受体1 (PD-1)抑制剂被证实可以增强抗肿瘤效果^[1]。然而，胸部照射可能引发心脏损伤。局部晚期非小细胞肺癌患者放疗后两年内，≥3级的心脏不良事件发生率达11%~23%^[2]。乳腺癌患者的心脏平均辐射剂量每增加1 Gy，重大冠状动脉事件的发生率升高7.4%，且这一风险可持续至放射治疗后30年^[3]。PD-1抑制剂可能引发免疫性心肌炎，进而加剧放射性心脏损伤^[4]。尽管近两年来，放射治疗联合PD-1抑制剂在肺癌、食管癌治疗中的应用日渐增多，但关于心脏损伤的相关临床数据却仍然匮乏^[5]。

细胞焦亡通过介导细胞死亡及炎症参与各种心血管疾病^[6]。然而，它在放射治疗联合PD-1抑制剂引起的心肌损伤中的作用及机制仍不清楚。本研究通过建立小鼠动物模型，探究PD-1抑制剂是否通过促进细胞焦亡加剧放射性心肌损伤，并期望为防治放射性心肌损伤提供新的治疗策略。

抗小鼠PD-1(RMPI-14，美国Bio X Cell公司)，抗消皮素D(GSDMD)抗体(EPR19828，英国Abcam公司)，抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)抗体(M025280，上海艾比玛特公司)，抗凋亡相关斑点样蛋白(ASC)抗体(AP68548，江苏百远生物公司)，抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(R1210-1，杭州华安生物公司)，组织RNA提取试剂盒、快速反转录试剂盒、SYBR Green qPCR预混液(RN002plus、RT001、QP002，上海奕杉生物科技有限公司)，小鼠白介素1β(IL-1β)、白介素18(IL-18)酶联免疫吸附实验试剂盒(MLB00C、DY7625-05，美国R&D SYSTEMS公司)；直线加速器(Synergy，瑞典Elekta公司)，实时荧光定量PCR仪(CFX96Toch，美国Bio-Rad Laboratories公司)，便携式彩色多普勒超声仪(VINNO6LAB，苏州飞依诺科技有限公司)。

SPF级雄性C57BL/6小鼠20只，6~8周龄，体质量20~25 g，购自长沙天勤生物技术有限公司[动物许可证号：SCXK(湘)2019-0014]。小鼠适应性喂养1周后按随机数字表法分为健康对照组、PD-1抑制剂组、单纯照射组、照射联合PD-1抑制剂组，每组5只。

小鼠麻醉后仰卧位固定于直线加速器下，通过小鼠体表心脏搏动范围，使心脏置于射野中心，胸前垫0.5 cm蜡模，6 MV X射线20 Gy垂直照射，照射野2 cm × 2 cm，源皮距100 cm，剂量率6 Gy/min。分别于照射后第1、3、5、7、9天予PD-1抑制剂组及照射联合PD-1抑制剂组腹腔注射抗小鼠PD-1(5 μg/g)+0.5 ml磷酸盐缓冲液(PBS)^[7]；同时，健康对照组及单纯照射组注射等体积PBS。

采用VINNO6LAB多普勒超声，频率23 MHz经胸超声检查，每只小鼠至少记录10个连续且完整的心动周期图像。计算左室射血分数(LVEF)、每搏输出量(SV)、左室缩短率(FS)及左室后壁收缩期厚度(LVPWs)。

固定于10%多聚甲醛的心脏组织经脱水、石蜡包埋、切片(5 μm)制备病理切片，常规进行HE及Masson染色、封片，数字切片扫描仪对切片进行图像采集。HE染色后每张标本按简单随机抽样法选取3个不重复视野观察小鼠心肌组织病理变化；Masson染色后每张标本随机选取3个不重复视野，采用Image J软件进行半定量分析，计算心肌胶原容积分数(CVF)^[8]，$\mathrm{CVF}=\frac{\text { 视野中胶原面积 }}{\text { 视野总面积 }} \times 100 \%$。

小鼠眼球摘除取血，血液室温静置30 min后，15 000 × g离心10 min，提取上清即得血清；30 mg心脏组织加入蛋白裂解液，冰浴下超声匀浆。分别将血清、心肌匀浆液及不同浓度的标准品加入已包被好检测抗体(IL-18、IL-1β)的酶标板，参照说明书进行检测抗体孵育、洗涤、二抗孵育和显色反应。酶标仪测定吸光度(A)值，A = A_{450 nm}-A_{570 nm}。用标准品浓度及对应吸光度A制定标准曲线，代入样本A计算样本浓度(pg/ml)。

20 mg心脏组织加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂，冰浴下超声匀浆，冰上裂解后提取上清，二喹啉甲酸(BCA)法测蛋白浓度。将等量蛋白行凝胶电泳、转印、洗膜、封闭、一抗4℃孵育过夜、二抗孵育、洗膜，电化学发光法显影。以GAPDH为对照，采用Image J软件量化条带灰度值。一抗稀释比：Caspase-1(1∶2 000)、ASC(1∶2 000)、GSDMD(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)。

取小鼠心脏组织10 mg，参照试剂盒说明书提取总RNA并反转录合成cDNA，以cDNA为模板依照条件(95℃预变性5 min；95℃变性15 s、60℃退火延伸30 s，循环40次。)在PCR仪上进行基因片段扩增；以GAPDH为内参，采用2^-ΔΔCt法计算基因相对表达量。引物序列：GAPDH (正向：5′ GGTTGTTCTCCTGCGACTTCA3′;反向：5′ TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC3′),Caspase-1(正向：5′ CAAGGTGATCATTATTCAGGC3′,反向：5′ GCATCCGTTAAGAAATCCTC3′),GSDMD(正向：5′ CGATGGGAACATTCAGGGCAGAG3′,反向：5′ ACACATTCATGGAGGCACTGGAAC3′);ASC(正向：5′ GTCCCTGCTCAGAGTACAGCC3′,反向：5′ ACGAACTGCCTGGTACTGTCC3′)。

采用双酶(0.1%Ⅱ型胶原酶、0.01%透明质酸酶)消化法消化30 mg心脏组织制备细胞悬液，加完全培养基中和消化酶，过细胞筛去除杂质，1 000 × g离心5 min后得细胞沉淀。加入红细胞裂解液裂解红细胞，用PBS清洗、1 000 × g离心5 min、重悬细胞。细胞悬液内加入CD45+、CD3+、CD8+、CD4+ T抗体避光孵育30 min后运用流式细胞仪检测。采用FlowJo_V10软件分析数据。

采用SPSS 23.0软件进行数据分析，数据符合正态分布，以x±s表示。两组数据比较采用独立样本t检验，多组间比较方差齐采用单因素方差分析，Tukey检验进一步进行两两比较，方差不齐采用Dunnett的T3检验。P<0.05为差异有统计学意义。

PD-1抑制剂组LVEF、FS、SV、LVPWs与健康对照组的差异均无统计学意义(P>0.05)；与健康对照组比较，单纯照射组LVEF、SV降低，LVPWs增加(t =3.80、7.04、-5.92, P<0.05)；与单纯照射组比较，照射联合PD-1抑制剂组的LVEF、FS、SV下降(t=4.50、27.93、3.11, P<0.05)，LVPWs相似(P>0.05，表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 小鼠左心功能改变情况(x±s) Table 1 Changes in the left ventricular function of mice (x±s) 组别 只数 LVEF(%) FS(%) SV(μl) LVPWs(mm) 健康对照组 5 89.14±6.65 55.46±9.54 76.20±8.79 1.34±0.16 PD-1抑制剂组 5 87.09±2.64 45.76±6.32 70.00±15.81 1.33±0.94 单纯照射组 5 76.29±3.69a 48.62±0.98 38.00±8.37a 1.97±0.17a 照射联合PD-1抑制剂组 5 60.67±6.83b 29.04±1.00b 24.20±5.31b 1.94±0.47 注：LVEF. 左室射血分数；FS. 左室缩短率；SV. 每搏输出量；LVPWs. 左室后壁收缩期厚度。a与健康对照组比较，t=3.80、7.04、-5.92, P<0.05；b与单纯照射组比较, t=4.50、27.93、3.11，P<0.05

表 1 小鼠左心功能改变情况(x±s) Table 1 Changes in the left ventricular function of mice (x±s)

健康对照组心肌细胞呈长条状，排列整齐，边界清晰，胞质为红色，细胞核为深蓝色；PD-1抑制剂组心肌排列整齐，边界清晰，未见心肌纤维水肿、坏死；单纯照射组小鼠心肌细胞排列紊乱，局部可见部分心肌纤维水样变性，细胞肿胀，胞质疏松淡染；照射联合PD-1抑制剂组的心肌排列更加紊乱，心肌纤维水肿更重，心肌间质见淋巴细胞浸润(图 1)。

注：黑色箭头指示心肌细胞水肿、空泡化，红色箭头指示淋巴细胞浸润 图 1 照射1个月后小鼠心肌组织改变HE染色×400 A. 健康对照组；B. PD-1抑制剂组；C. 单纯照射组；D. 照射联合PD-1抑制剂组 Figure 1 Changes in myocardial tissue of mice after one month of radiation HE staining ×400 A. Control group; B. PD-1 inhibitor group; C. Radiation group; D. Combined group treated with both radiation and PD-1 inhibitor

Masson染色显示，健康对照组及PD-1抑制剂组胶原纤维呈蓝色, 散在分布于心肌细胞间，未见异常胶原纤维堆积；单纯照射组可见心肌间质及血管周围分布蓝染纤维，较健康对照组增多；照射联合PD-1抑制剂组可见心肌结构排列紊乱，蓝色的胶原纤维沉积较单纯照射组更为明显(图 2)。心肌组织胶原蛋白半定量分析显示，健康对照组、PD-1抑制剂组、单纯照射组、照射联合PD-1抑制剂组的CVF值分别为(1.82±0.36)%、(2.11±0.20)%、(2.88±0.27)%、(3.81±0.57)%，组间比较发现PD-1抑制剂组与健康对照组CVF值差异无统计学意义(P>0.05)，单纯照射组CVF较健康对照组增加(t=4.71，P<0.05)、照射联合PD-1抑制剂组CVF高于单纯照射组(t=2.9，P<0.05)。

注：黑色箭头指示胶原纤维沉积 图 2 照射1个月后小鼠心肌组织纤维化情况Masson染色×100 A. 健康对照组；B. PD-1抑制剂组；C. 单纯照射组； Figure 2 Myocardial fibrosis in mice after one month of radiation Masson staining ×100 A. Control group; B. PD-1 inhibitor group; C. Radiation group; D. Combined group treated with both radiation and PD-1 inhibitor

如图 3所示，蛋白免疫印迹检测显示，单纯照射组Caspase-1、Caspase-1 p20、GSDMD、GSDMD-N、ASC蛋白表达量较健康对照组升高(t=9.04、11.05、4.23、9.20、6.14，P<0.05)，照射联合PD-1抑制剂组上述蛋白表达量也比单纯照射组升高，差异具有统计学意义(t=3.14、3.22、8.83、20.29、2.79，P<0.05)。RT-qPCR显示照射联合PD-1抑制剂组的Caspase-1、GSDMD、ASC的mRNA表达水平均高于单纯照射组，差异具有统计学意义(t = 3.09、2.91、2.53，P<0.05，表 2)。

图 3 心肌组织焦亡相关蛋白表达 Figure 3 Expression of pyroptosis-related proteins in myocardial tissue

表 2(Table 2)

表 2 小鼠心肌内焦亡相关蛋白mRNA表达(x ± s) Table 2 mRNA expression of pyroptosis-related proteins in myocardium of mice (x ± s) 组别 只数 Caspase-1 GSDMD ASC 健康对照组 4 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 PD-1抑制剂组 4 1.40±0.34 1.83±0.79 1.22±0.24 单纯照射组 4 2.48±0.26a 2.36±0.43a 2.48±0.26a 照射联合PD-1抑制剂组 4 5.28±1.79b 4.93±1.71b 5.28±1.79b 注：Caspase-1.半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1；GSDMD. 消皮素D；ASC. 凋亡相关斑点样蛋白。a与健康对照组比较，t=11.49、6.30、4.24, P < 0.05；b与单纯照射组比较，t=3.09、2.91、2.53, P<0.05

表 2 小鼠心肌内焦亡相关蛋白mRNA表达(x ± s) Table 2 mRNA expression of pyroptosis-related proteins in myocardium of mice (x ± s)

健康对照组、单纯照射组、照射联合PD-1抑制剂组血清及心肌组织中的IL-18、IL-1β的表达水平都逐渐升高。健康对照组与PD-1抑制剂组血清及心肌中的IL-18、IL-1β表达差异均无统计学意义(P>0.05)；与健康对照组比较，单纯照射组血清中的IL-18、IL-1β表达均升高(t=4.24、7.24，P<0.05)，心肌组织中的IL-18、IL-1β表达也升高(t=5.08、3.86，P<0.05)；照射联合PD-1抑制剂组血清及心肌组织中的IL-18、IL-1β表达也都高于单纯照射组(t=7.58、3.46、8.24、3.75, P<0.05，表 3)。

表 3(Table 3)

表 3 小鼠血清及心肌组织内炎性因子表达(pg/ml，x ± s) Table 3 Expression of inflammatory factors in serum and myocardium of mice (pg/ml, x ± s) 组别 只数 IL-18 IL-1β 血清 心肌 血清 心肌 健康对照组 4 63.25±17.96 120.12±10.09 81.75±21.05 15.70±3.04 PD-1抑制剂组 4 78.48±23.01 119.02±5.72 91.56±30.27 17.55±7.80 单纯照射组 4 244.06±83.41a 165.79±14.88a 177.70±16.09a 23.60±2.74a 照射联合PD-1抑制剂组 4 835.48±131.81b 231.48±34.99b 454.32±65.22b 29.30±1.32b 注：a与健康对照组比较，t=4.24、5.08、7.24、3.86, P<0.05；b与单纯照射组比较，t=7.58、3.46、8.24、3.75, P<0.05

表 3 小鼠血清及心肌组织内炎性因子表达(pg/ml，x ± s) Table 3 Expression of inflammatory factors in serum and myocardium of mice (pg/ml, x ± s)

PD-1抑制剂组CD3+、CD8+ T淋巴细胞百分比与健康对照组间的差异无统计学意义(P>0.05)；与健康对照组比较，单纯照射组的心肌中CD3+、CD8+T淋巴细胞百分比增加(t=5.71、3.94，P<0.05)；照射联合PD-1抑制剂组与单纯照射组的CD3+T淋巴细胞百分相似(P>0.05)，但照射联合PD-1抑制剂组的CD8+ T淋巴细胞百分比较单纯照射组显著增加(t=3.29，P<0.05)，各组的CD4+ T淋巴细胞的差异无统计学意义(P>0.05，表 4)。

表 4(Table 4)

表 4 不同处理组小鼠心肌组织内不同T淋巴细胞浸润比例(%，x ± s) Table 4 Proportions of T lymphocyte infiltration in myocardium of mice in each group (%, x ± s) 组别 只数 CD3+ CD4+ CD8+ 健康对照组 3 4.14±1.48 10.17±2.97 18.57±3.55 PD-1抑制剂组 3 9.37±6.39 10.41±8.52 22.00±5.05 单纯照射组 3 9.99±0.98a 12.68±7.14 38.33±7.92a 照射联合PD-1抑制剂组 3 11.04±2.63 11.67±3.35 54.70±4.01b 注：a与健康对照组比较，t=5.71、t=3.94，P<0.05；b与单纯照射组比较, t=3.29，P<0.05

表 4 不同处理组小鼠心肌组织内不同T淋巴细胞浸润比例(%，x ± s) Table 4 Proportions of T lymphocyte infiltration in myocardium of mice in each group (%, x ± s)

放射治疗联合PD-1抑制剂已在肺癌、食管癌等胸部肿瘤治疗中展现出良好的应用前景，是目前临床研究的热点。除疗效外，不良反应也是关注的焦点。目前，放射治疗联合PD-1抑制剂所致心脏不良反应的报道较少。本研究根据文献报道，采用20 Gy单次照射构建小鼠放射心肌损伤模型^[9]。探讨PD-1抑制剂是否通过焦亡途径加重放射性心肌损伤。心肌损伤是动态变化的过程，多个时间点观察更有意义，前期研究发现PD-1抑制剂可加重心脏照射后1个月的急性炎症反应^[10]。心肌焦亡是一种促炎性死亡，为此，本研究选择1个月作为观察时间点。同时，更佳的时间点仍需进一步探索。本研究发现，与健康对照组相比，单纯应用PD-1抑制剂并未造成明显心脏损伤；小鼠心脏20 Gy照射后1个月可出现心脏损伤，多普勒超声提示心脏功能减退，Masson染色可观察到心肌纤维化；照射联合PD-1抑制剂的心脏功能减退和心肌纤维化更为明显，表明PD-1抑制剂可以加重放射性心肌损伤。

PD-1抑制剂通过活化T淋巴细胞发挥抗肿瘤效应及介导免疫性损伤^[11-12]。本研究发现，心脏照射联合PD-1抑制剂组小鼠心肌中CD8+T淋巴细胞百分比显著增加，然而CD4+T淋巴细胞变化不明显，表明PD-1抑制剂可能通过活化CD8+T淋巴细胞加重放射性心肌损伤。Du等^[13]也发现CD8+T淋巴细胞而不是CD4+T淋巴细胞在放射治疗联合PD-1抑制剂所致心肌损伤中起关键作用。CD8+T淋巴细胞在抗肿瘤治疗中起着重要的作用，封闭CD8+T淋巴细胞虽可减轻心脏不良反应，但势必也会降低抗肿瘤治疗的疗效。

PD-1抑制剂可促进心肌免疫炎症反应，进而加重小鼠放射性心肌损伤^[10]。细胞焦亡是一种促炎性死亡方式，与心血管疾病、自身免疫性疾病密切相关^[14]。研究显示，PD-1抑制剂可通过经典焦亡途径介导小鼠心肌损伤；辐射可通过NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路介导骨髓源性巨噬细胞焦亡^{[7, 15]}。本研究结果显示，照射联合PD-1抑制剂组的Caspase-1、GSDMD及其活性剪接体Caspase-1 p20、GSDMD-N表达水平较单纯照射组显著升高。文献报道，藏红花素可抑制NLRP3/GSDMD通路，从而逆转免疫检查点抑制剂相关性心肌炎^[7]。Jiang等^[16]研究显示，在抑制PD-L1的同时抑制GSDMD，可增加荷瘤小鼠体内CD8+ T淋巴细胞浸润、增强PD-L1抑制剂的疗效。这些研究结果提示PD-1抑制剂可能通过Caspase-1/GSDMD通路介导细胞焦亡加重放射性心肌损伤，抑制焦亡可能为减轻放射性心肌损伤提供新的思路。

活化的Caspase-1能促进IL-1β和IL-18的切割成熟；同时Caspase-1也能切割GSDMD诱导膜孔开放，诱发细胞焦亡，释放IL-1β、IL-18等炎症因子，扩大免疫炎症反应。本研究发现，心脏照射联合PD-1抑制剂组血清及心肌内IL-18、IL-1β含量明显增加。IL-18、IL-1β作为强有力的炎症启动因子，对宿主的感染及损伤防御反应至关重要；此外，IL-1β通过加重慢性炎症、促进肿瘤血管生成及肿瘤细胞转移、诱导肿瘤微环境内的免疫抑制来推动肿瘤发展^[17]。阻断IL-1β可逆转乳腺癌小鼠的免疫抑制、诱导肿瘤消退，并增强抗PD-1抗体的活性^[18]。使用小干扰RNA抑制IL-18可降低小鼠的肿瘤负荷^[19]。IL-18、IL-1β有可能成为不影响抗肿瘤效应的情况下减轻放射联合PD-1抑制剂所致心肌损伤的干预靶点。

综上所述，PD-1抑制剂可能通过Caspase-1/GSDMD促进细胞焦亡进而加重放射性心肌损伤，阻断GSDMD通路有助于减轻PD-1抑制剂联合放疗所致的心肌损伤。

利益冲突  无

作者贡献声明  赵沙沙负责实验操作、数据整理、起草论文；吴碧波负责实验操作及论文修改；柏杰负责数据分析；王刚、刘瑶、王羽协助部分实验操作；胡银祥指导实验；欧阳伟炜、卢冰指导论文修改；苏胜发负责课题设计，指导论文撰写