2024, Vol. 44
程序性细胞死亡分子1(programmed death receptor 1，PD-1)及其配体1(programmed death receptor-ligand 1，PD-L1)免疫检查点的阻断治疗在改善多种类型肿瘤患者的预后方面起着至关重要的作用[1]。PD-1在调节性T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和肿瘤相关巨噬细胞等免疫细胞中均有表达，是多种免疫检查点抑制剂的靶点，例如：已经批准使用的纳武利尤单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)[2]。这些抗PD-1治疗，加上针对其配体PD-L1的治疗，日益成为肿瘤免疫治疗的支柱。针对PD-(L)1的单克隆抗体与免疫检查点结合，可以阻止PD-1和PD-L1结合，从而重新激活先天免疫反应。这种免疫检查点抑制剂的使用提高了患者的存活率[3-4]，然而只有平均1/3的患者对免疫检查点抑制剂单药治疗产生反应[5-6]。因此，筛选最有可能从免疫治疗中受益的患者是目前临床亟需解决的关键问题。
一、免疫组织化学(IHC)技术与PD-(L)1分子成像互补使用检测PD-(L)1表达在筛选肿瘤患者采用PD-1/PD-L1阻断治疗的过程中，PD-L1表达水平作为筛选的主要生物学指标，IHC是检测其表达的主要方式，目前主要使用Dako22C3、Dako28-8、SP142和SP263这4种方法检测。但由于IHC检测抗体方法及阳性评判标准的不一致等，导致PD-L1表达检测结果不准确[7]。
Broos等[8]结果显示，在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者中，需要4次或更多的活检，IHC才能准确评估PD-L1表达，由此带来安全上的不确定性。然而PET成像技术，可以非侵入性评估PD-(L)1，显示整个肿瘤负荷的表达，可更有效地进行疗效预测。IHC与PD-(L)1分子成像互补使用检测肿瘤PD-(L)1表达，将为患者带来更大的临床获益。
二、PD-(L)1 PET示踪剂在临床前及临床转化中的研究PD-(L)1探针主要包括两类：大分子量探针(核素标记完整单克隆抗体)和小分子量探针(抗体片段、纳米抗体及多肽等)，见表 1。核素标记的大分子单抗，如：89Zr-Atezolizumab、89Zr-Nivolumab等相关试验结果表明，示踪剂显示了特异性结合和检测不同水平的PD-(L)1表达的能力。PD-(L)1 PET示踪剂的临床前研究结果令人鼓舞，目前PD-(L)1 PET示踪剂已进入临床研究，这些研究探索了分子成像的各个方面，包括探针的安全性、生物分布、以及量化PD-(L)1表达水平的能力等。
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表 1 靶向PD-(L)1分子探针分类及应用 Table 1 Classification and application of molecular probes targeting PD-(L)1 |
1. PD-1靶向核素分子探针2015年，Natarajan等[9]首次报道了一种基于抗体的示踪剂，用PET/CT进行显像。将抗鼠PD-1单克隆抗体与DOTA(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-N，N′，N″，N'''-tetraacetic acid，1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N'''-四乙酸)在赖氨酸位点耦联，用Copper-64进行放射性标记，黑色素瘤荷瘤小鼠用于PET/CT显像，体内生物分布显示24 h肿瘤摄取率最高(9.37±0.09)%ID/g，肿瘤肌肉比11.0，肿瘤血池比0.8。并且通过阻断实验证明了64Cu-DOTA-anti-mouse-PD-1的特异性结合。
Niemeijer等[10]在2018年使用89Zr-Nivolumab探针对13例晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者进行了分子成像。在肿瘤活检中，显示PD-1表达阳性的肿瘤组织89Zr-Nivolumab摄取高于PD-1表达阴性的肿瘤组织(Median SUV peak：7.0 vs. 2.7，P < 0.05)。这项研究证明89Zr-Nivolumab在临床试验中的安全性和可行性，并证明89Zr-Nivolumab的摄取与肿瘤组织中PD-1表达相关，但该结论仍需要更多临床数据的支持。
PD-1靶向药Pembrolizumab是一种人源化IgG4单克隆抗体，在治疗晚期黑色素瘤、NCSLC中取得成功[11]。两篇论文评价了89 Zr-Pembrolizumab用于PD-1 PET显像[12-13]，这些研究报告了89Zr-Pembrolizumab与89Zr-Nivolumab相似的生物分布：一项研究包括12例NSCLC患者，患者接受了两次89Zr-Pembrolizumab PET扫描[12]。第1次扫描是在Pembrolizumab治疗前进行，使用2 mg的89Zr-Pembrolizumab，在示踪剂注射后7天进行成像。第2次注射89Zr-Pembrolizumab是在给予治疗性Pembrolizumab单抗200 mg剂量的当天，7d后进行PET扫描。在脾脏和肿瘤病灶中，第2次示踪剂摄取低于2 mg 89Zr-Pembrolizumab单独剂量，这表明PD-1结合位点出现了一定饱和，证明了89Zr-Pembrolizumab与PD-1的特异性结合；另一项89Zr-Pembrolizumab研究是在PD-1抗体治疗前对18例转移性黑色素瘤或NSCLC患者进行了PET扫描，使用5 mg和10 mg的蛋白剂量进行示踪剂剂量研究[13]。6例患者在示踪剂注射后第2、4和7天进行扫描，最佳成像结果是在总蛋白质剂量为5 mg，注射后第7天实现的。在该研究中，高 89Zr-Pembrolizumab肿瘤摄取与抗PD- 1治疗反应相关，示踪剂摄取在NSCLC和黑色素瘤病变之间没有差异，生物分布结果与89Zr-Nivolumab研究相似，但是该研究的不足仍然是样本量不足，需要大样本临床数据支持。
2. PD-L1靶向核素分子探针
(1) 抗体：Heskamp等[14]首次选择特异性抗人PD-L1的鼠源性单克隆IgG1抗体PD-L1.3.1，并与DTPA(diethylene triamine pentoacetic acid, 二乙烯三胺五乙酸)结合，用于对荷瘤小鼠的SPECT/CT成像。随后，Josefsson等[15]开发了基于SPECT的PD-L1示踪剂，通过DTPA与抗鼠PD-L1抗体结合，[111In]In-DTPA-anti-PD-L1显示出对PD-L1的高亲和力：KD=(8.3 ± 3.2)nM。为了加快临床前研究到临床研究的转化，Truillet等[16]设计了抗体C4，该抗体对人和鼠PD-L1都具有高亲和力(EC50分别为9.9、5.2 nM)，将89Zr标记的C4注射到PDX模型中，发现在药物注射后48 h肿瘤摄取达峰值，并且在肝脏、肾脏、脾脏中也有大量蓄积。
目前为止，多种PD-L1靶向分子示踪剂已经进入临床试验阶段。3种已批准的治疗性抗PD-L1抗体：Atezolizumab，Durvalumab和Avelumab已进行放射性标记，正在评估用于患者的PET显像。Bensch等[17]采用正电子核素89Zr对PD-L1靶向单克隆抗体Atezolizumab进行放射性标记获得分子探针89Zr-Atezolizumab，并对22例晚期的非小细胞肺癌(NSCLC)、膀胱癌和三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)患者进行治疗前后的PET/CT显像。这项研究证实了示踪剂在淋巴组织的摄取，并且该研究发现了分子探针在肿瘤病灶内的不均匀摄取，检测了肿瘤原发灶及转移灶内的PD-L1表达状态。
此后发表了两项使用89Zr-Durvalumab的研究[18-19]。Smit等[18]在两个成像时间点对13例NSCLC患者进行 89Zr-Durvalumab PET评估。患者在免疫治疗前接受2 mg 89Zr-Durvalumab蛋白剂量的PET显像，然后在给予第1次750 mg治疗性durvalumab剂量的同一天进行第2次示踪剂显像。研究发现，第2次示踪剂肿瘤病灶、脾脏、骨髓和肝脏的摄取低于第1次，表明结合位点出现一定程度的饱和。发现注射示踪剂后的第5天是图像采集的最佳时间，示踪剂生物分布与89Zr-Atezolizumab的生物分布相似。
PD-L1靶向抗体CX-072是一种蛋白酶激活抗体，可在体内被存在于肿瘤微环境中的蛋白酶激活。Kist de Ruijter等[20]对肿瘤患者进行全身89Zr-CX-072 PET显像，8例晚期肿瘤患者接受了扫描。示踪剂注射后，第7天肿瘤病灶摄取量最高，其中4例患者在扁桃体和淋巴结中观察到摄取，在脾脏中摄取量(SUVmean：8.6)低于 89Zr-Atezolizumab和89Zr-Durvalumab的报道。
核素标记完整抗体制备简单，结合力强，但是完整抗体的分子量大，显像所需时间长，这增加了在临床应用中的难度。
(2) 纳米体：纳米体的分子量为12~15 kDa，重量只有常规抗体的十分之一，因此肿瘤摄取速度快，肿瘤穿透率高。Lv等[21]开发了抗PD-L1纳米体Nb109，将其与p-SCN-Bn-NOTA耦联，表面等离子体共振研究显示Nb109、68Ga-NOTA-Nb109和NOTA-Nb109都对人PD-L1有很强的结合力。荷瘤小鼠在68Ga-NOTA-Nb109注射后1小时显示出高肿瘤肌肉比(11.03 ± 0.36)。Broos等[22]开发了一个由37个纳米体组成的库，筛选出4个与PD-L1有高结合力的纳米体(C3、C7、E2、E4)，这些纳米体通过与99Tcm-tricarbonyl络合进行放射标记，随后进行生物分布的检测。
(3) Adnectin：Adnectin是基于人第10个纤维连接蛋白Ⅲ型结构域的蛋白家族，是一类人工合成的蛋白质，能与生物靶点高特异性结合。分子量约为10 kDa，它们能迅速靶向组织，与抗体相比能在更短的时间内提供更高的成像对比度，高稳定性和无二硫键的特性使其成为开发无创显像剂的候选药物。
临床转换中使用的第1个Adnectin示踪剂是18F-BMS-986192[10]，18F标记的抗PD- L1 Adnectin，用于对10例晚期NSCLC患者进行显像。研究发现，对于非CNS病变，IHC检测肿瘤PD-L1表达≥50%的病变18F-BMS-986192摄取明显高于PD-L1表达 < 50%的病变(Median SUVpeak：8.2 vs. 2.9，P < 0.05)。Nienhuis等[23]首次使用18F-BMS-986192对8例转移性黑色瘤显像，结果显示18F-BMS-986192可以预测免疫治疗引起的病灶体积变化，并且18F-BMS-986192可在注射1 h后获得PET显像，为检测PD-L1的表达提供更方便的影像学方法。
(4) 多肽：与前面描述的示踪剂相比，肽的分子量更低，较低的分子量使血液和非靶器官的清除速度更快。Chatterjee等[24]从被报道的肽库中选取了利于螯合并且与PD-L1有高度亲和力的小分子多肽WL12，通过与DOTA螯合并用放射性核素64Cu进行标记，产生了新的小分子探针64Cu-WL12。De Silva等[25]在64Cu-WL12研究的基础上，利用一种便于获取且半衰期更短的放射性核素68Ga对WL12进行标记并进行PET显像。
随后，一项使用68Ga-NOTA-WL12的前瞻性、Ⅰ期临床试验在9名NSCLC患者中进行[26]。研究发现，68Ga-NOTA-WL12生理示踪剂摄取主要见于肝脏、脾脏、和肾脏。结果显示肿瘤摄取(SUVpeak)和PD-L1 IHC结果之间存在强烈的正相关(r = 0.93，P < 0.05)。68Ga-NOTA-WL12和18F-FDG PET研究提示，治疗前PD-L1 PET显像结果可以预测免疫治疗疗效。
(5) Affibodies：Affibodies是一种由58个氨基酸构成的新型配体，其分子量约6 kDa，具有高亲和力和特异性结合的特征，稳定性高，是设计理想示踪剂的候选药物之一。这些有利特征促使Rubins等[27]设计出PD-L1结合示踪剂NOTA-ZPD-L1_4，用[18F]AlF和68Ga标记NOTA- ZPD-L1_4，并分别在PD-L1+的LOX荷瘤小鼠和PD-L1-的SUDHL6荷瘤小鼠体内进行研究，结果显示示踪剂在PD-L1+肿瘤中的摄取量比在PD-L1-肿瘤中高25倍。除小鼠实验外，还在恒河猴体内监测了生物分布，结果表明示踪剂能快速地从血液中清除，肾脏摄取量高，肝脏摄取量低，并在淋巴结和脾脏中蓄积。研究提示18F和68Ga标记的PET示踪剂的开发可能会增加示踪剂在临床中的使用[27]。
三、PD-(L)1型PET示踪剂需要解决的关键问题在开发PD-(L)1 PET分子探针时要研究其生物分布、代谢情况，监测其辐射剂量，评估其安全性和量化检测PD-(L)1表达水平的潜力。
PD-(L)1型示踪剂的筛选核素标记完整单抗分子探针具有良好的亲和性，制备简单，可以观察单抗在机体内的完整代谢过程，但由于分子量大导致肿瘤穿透性差、生物半衰期长、显像所需时间长(通常需要2~7 d)，这导致在临床应用中比较困难。
低分子量探针分子量相对较小，肿瘤穿透性更强，可被肿瘤快速摄取，从血液、背景组织中清除快，实现注射当天显像，临床优势明显；不足是制备复杂，稳定性较差，低分子量核素探针的亲和力相比特异性单抗较弱，缺乏良好的肿瘤血池比。
放射性核素的选择分子示踪剂上的放射性核素的半衰期需要与分子靶结合所需的时间相适应，同时保持适当的放射性水平以允许合理的成像分辨率[28]。对于低分子量探针，如Adnectin，显示出从血液到组织的分布十分快速，采用半衰期短的同位素是合适的，其成像通常发生在示踪剂注射期间或之后数小时，例18F-BMS-986192 PET显像在注射后1小时进行评估。然而抗体89Zr-Durvalumab的PET显像最好是在示踪剂注射后5至7 d完成，这使得在临床使用中比较困难，并且示踪剂最终的显像反映的是平均靶点密度，很难评估靶点密度的快速变化[10]。
四、展望PD-(L)1免疫治疗已经在临床中普遍应用，而目前筛选获益患者的方法如IHC、微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)、错配修复缺陷(defective mismatch repair，dMMR)等均不能对疗效进行精确预测，因此这仍是一个亟需解决的重要问题。PD-(L)1靶向核素分子探针可以无创、重复检测全身包括肿瘤及其他组织PD-1/PD-L1的表达水平，监测治疗过程中患者PD-(L)1表达的变化，有望成为筛选PD-(L)1治疗获益患者的重要手段。评估PD-(L)1 PET示踪剂在检测PD-(L)1表达方面的临床试验正在招募或正在进行中，目前对于PD-(L)1 PET示踪剂的研究已扩展到NSCLC、乳腺癌、肾癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、黑色素瘤等。
分子成像有望在体内量化PD-(L)1在肿瘤和健康组织中的表达，评估药物的药代动力学和药效学[29]，会在未来的药物开发中发挥更大的作用。PD-(L)1靶向核素分子成像可用于早期临床试验，通过评估受体结合和生物标记物积累，帮助更全面地了解免疫治疗的作用机制[30]。总之，PD-(L)1分子成像是通过提供基于PD-(L)1表达水平来诊断、选择和监测患者的一种非侵入性动态技术，为改善肿瘤患者预后提供了机会，并将为免疫疗法的发展提供帮助。
利益冲突 无
作者贡献声明 蒙茜负责研究实施、论文撰写；孙洪福负责统计分析；黄伟负责课题设计、研究指导、论文修改
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