中华放射医学与防护杂志  2024, Vol. 44 Issue (11): 903-908   PDF    
引用本文
吴双, 李志慧, 洋雯茜, 董国福, 王长振. 超高剂量率与常规剂量率脉冲电子线对秀丽隐杆线虫的影响[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2024, 44(11): 903-908, DOI: 10.3760/cma.j.cn112271-20240320-00096.
超高剂量率与常规剂量率脉冲电子线对秀丽隐杆线虫的影响
吴双1,2 , 李志慧2 , 洋雯茜2 , 董国福2 , 王长振2     
1. 南华大学衡阳医学院 军事科学院研究生协同培养基地, 衡阳 421001;
2. 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所, 北京 100850
收稿日期: 2024-03-20
通信作者: 王长振, Email: wangcz2002@aliyun.com
[摘要] 目的 利用模式生物-秀丽隐杆线虫研究超高剂量率脉冲电子线对机体的影响。方法 将成年期野生型株系(N2)线虫同步化后培养至L4期, 随机分为对照组(SHAM组)、常规剂量率组(CONV组)和超高剂量率组(UHDR组)。CONV组和UHDR组辐射剂量均为3 Gy(脉冲电子线照射, 剂量率分别为0.3和200 Gy/s)。辐照结束后, 计数每组产卵量; 照后3、6和10 d时, 分别检测线虫发育、运动能力和存活时间。结果 照后第3天时, CONV组和UHDR组线虫体长均明显短于SHAM组(t=4.81、4.83, P < 0.05), 体宽差异无统计学意义(P>0.05)。第6和10天时, 与SHAM组相比, CONV组体长和体宽均明显减小(t=3.18~ 3.63, P < 0.05);而UHDR组体长明显增加(t=-9.85、-2.87, P < 0.05), 体宽差异无统计学意义(P>0.05)。与CONV组比较, 第6和10天时, UHDR组体宽明显增加(t=-4.43、-3.37, P < 0.05)。与SHAM组相比, 照后第6天, CONV组和UHDR组头部摆动、身体弯曲次数均明显下降(t=2.91、3.52、3.97、2.71, P < 0.05);第10天, 3组运动能力均较弱且差异均无统计学意义(P>0.05)。与SHAM组相比, CONV组和UHDR组产卵量均显著降低(t=1.72、5.54, P < 0.05), 但UHDR组线虫产卵量显著高于CONV组(t=-5.99, P < 0.05)。与SHAM组相比, CONV组线虫寿命明显缩短(χ2=8.49, P < 0.05), 而UHDR组线虫存活时间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CONV电子射线可导致秀丽线虫发育受损、运动能力降低、产卵量减少和寿命缩短, 但在相同剂量下UHDR脉冲电子射线引起的损伤程度较轻。
[关键词] 超高剂量率    电子线    秀丽线虫    发育    寿命    
Effects of pulsed electron beams with ultra-high dose rate and conventional dose rate on Caenorhabditis elegans
Wu Shuang1,2 , Li Zhihui2 , Yang Wenxi2 , Dong Guofu2 , Wang Changzhen2     
1. Hengyang Medical School, Graduate Collaborative Training Base of Academy of Military Sciences, University of South China, Hengyang 421001, China;
2. Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Science, Academy of Military Science, Beijing 100850, China
Corresponding author: Wang Changzhen, Email: wangcz2002@aliyun.com
[Abstract] Objective To explore the effects of ultra-high dose rate pulsed electron beams on Caenorhabditis elegans (C. elegans). Methods The adult wild-type strain (N2) of C. elegans was synchronized and cultured to L4 stage, and then randomly divided into control group (SHAM group), conventional radiotherapy dose rate group (CONV group) and ultra-high dose rate radiation group (UHDR group). The CONV and UHDR groups were exposed to 3 Gy of the pulsed electron beam at dose rates of 0.3 and 200 Gy/s, respectively. After irradiation, the egg-laying capacity of each group was assessed, and the developmental progress, motility, and survival rates each were evaluated at day 3, 6, and 10. Results On the 3rd day post-irradiation, both the CONV and UHDR groups showed shorter body lengths compared to the SHAM group (t=4.81, 4.83, P < 0.05), with no significant differences in body width (P>0.05). On the 6th and 10th days, the CONV group showed a significant reduction in both body length and width compared to the SHAM group (t=3.18-3.63, P < 0.05), whereas the UHDR group displayed a significant increase in body length (t=-9.85, -2.87, P < 0.05) with no significant change in body width. When comparing the UHDR group to the CONV group on day 6 and 10, a significant increase in body width was observed (t=-4.43, -3.37, P < 0.05). Motor activity, including head swinging and body bending, significantly decreased in the CONV and UHDR groups compared to the SHAM group on day 6 (t=2.91, 3.52, 3.97, 2.71, P < 0.05), with no significant differences among the three groups by day 10 (P>0.05). Egg-laying capacity significantly reduced in both irradiated groups compared to the SHAM group (t=1.72, 5.54, P < 0.05), while the UHDR group exhibited higher fecundity than the CONV group (t=-5.99, P < 0.05). Lifespan was significantly shortened in the CONV group compared to the SHAM group (χ2=8.49, P < 0.05), whereas the survival time of the UHDR group was not significantly differ from that of the SHAM group (P>0.05). Conclusions Exposure to a conventional electron beam result in developmental delays, reduced mobility, decreased fecundity, and a shortened lifespan in C. elegans. However, only slight side effects were observed when C. elegans were exposed to an ultra-high dose rate pulsed electron beam at the same dosage.
[Key words] Ultra-high dose rate    Electron beams    Caenorhabditis elegans    Development    Life span    

放疗是肿瘤治疗的重要手段，但会不可避免地对肿瘤周围的正常组织造成损伤，导致一系列不良反应和并发症。超高剂量率(ultra-high dose rate, UHDR)放疗是一种新兴的放疗技术，其在极短的时间内给予超高剂量辐射，可产生FLASH效应，即在杀死肿瘤细胞的同时，显著降低对正常组织的损伤。研究表明，相对于常规剂量率(conventional dose rate, CONV)辐射，UHDR辐射增加了正常组织和肿瘤组织之间的差异反应[1-3]。Favaudon等[4]利用UHDR电子线照射C57BL/6J小鼠肺肿瘤和裸鼠皮下移植瘤，发现与CONV电子线相比，UHDR控制肿瘤效果相当，但可显著降低小鼠肺纤维化程度。其他相关研究也表明，UHDR脉冲辐射相较于CONV辐射更有利于保护正常组织[5-6]。

秀丽隐杆线虫作为模式生物有较多优势，如生命周期短、体积小(约1 mm)、易于观察等[7-8]，在辐射对发育、运动、学习和衰老等研究中发挥重要作用[9-10]。此外，线虫基因组DNA序列与人类同源度较高，是研究免疫机制的天然模型[11-12]。这种模型生物体可在简单实验条件下进行操作，其光学透明的身体，更有利于机体氧化应激、氧含量等指标的可视化检测[13]。因此，建立UHDR脉冲辐射FLASH效应模型，对于其效应阈值及机制研究具有一定意义。但是，目前UHDR与CONV辐射对线虫影响差异研究较少。据此，本研究以野生型株系(N2)秀丽线虫为研究对象，观察CONV及UHDR辐射对其个体发育、运动能力、产卵率和寿命的影响，为深入研究UHDR辐射暴露对生物的影响提供新的模型。

材料与方法

1. 秀丽线虫的培养：N2秀丽线虫，由美国线虫遗传中心(Caenorhabditis Genetics Center, CGC)提供。实验时将同步发育至L1期的线虫转移至含有E.coil OP50的90 mm线虫生长培养基(nematode growth medium, NGM)中，置于20℃生化培养箱内培养。

2. 线虫的同步化：培养秀丽线虫至成虫体内卵较多时，用M9 buffer冲洗线虫至离心管中，待线虫静置沉淀，去除上清液，此步骤重复3~5次直至上清液透明。向离心管中加入现配现用的线虫裂解液(8 mol/L NaClO 400 μl，10 mol/L NaOH 80 μl，均购自上海国药集团化学试剂有限公司)定容至5 ml，快速剧烈振荡6 min致线虫裂解。1 200 r/min，离心半径167.7 mm，离心1 min，弃上清，保留沉淀，加入5 ml M9 buffer重复离心3次获得虫卵。将虫卵置于35 mm不含食物的NGM培养皿中，于20℃生化培养箱培养16 h，此时线虫为L1期。将L1期线虫接种到涂有线虫食物的90 mm培养基上，待晾干后，将培养皿倒置于20℃生化培养箱培养。

3. 实验分组及脉冲照射条件：将同步化后发育至L1期的线虫(2 000±100)只/皿接种到NGM培养基上，培养至L4期时随机分为对照组(SHAM组)、常规剂量率组(CONV组)和超高剂量率组(UHDR组)。本研究采用清华大学工程物理系电子线UHDR垂直测试平台进行CONV电子射线和UHDR电子射线照射，能量为6 MeV，源靶距分别为100和80 cm，射野为8.2 mm×8.2 mm，两种射线剂量均为3 Gy，平均剂量率分别为0.3和200 Gy/s，采用美国Ashland公司的GafchromicTMEBT3胶片测定实际辐射剂量，保证整体剂量的准确性，具体参数见表 1。

表 1 超高剂量率和常规剂量率照射参数 Table 1 UHDR and CONV irradiation parameters

4. 线虫个体发育检测：在辐射后的第3、6、10天测量线虫体长、体宽，每组随机选取40只线虫，使用日本尼康SMZ1500立体变焦显微镜结合NIS元素F4.0软件(日本Nikon公司)拍照保存。利用UOPView 2.0(重庆澳浦光电公司)数码显微图像处理分析系统对图像进行像素测量分析。

5. 运动能力的测定：在照射后第3、6、10天，每组随机选取10只，将线虫转入没有食物的NGM培养基上，使其自由活动2 min以适应环境，使用尼康SMZ1500显微镜结合NIS元素F4.0软件，分别测定其头部摆动、身体弯曲次数，每只观察记录时长均为10 s。线虫头部从一侧摆向另一侧后再摆动回来定义为1次头部摆动。在线虫向前爬行时，完成1个“S”形运动计为1次身体弯曲。

6. 产卵量统计：照射后每组即刻随机挑取9只线虫，平均转移到3个新的涂有菌液的35 mm NGM培养皿上(照射前1 d在平板中央滴加20 μl菌液)，置于20℃的培养箱中。每隔24 h将线虫转移到新的培养皿中，直到线虫停止产卵，把线虫挑出后，计数线虫产卵的数量。实验进行3次重复。

7. 线虫寿命观察：从每组中选出100只线虫转到含有OP50的90 mm NGM板上进行寿命分析。每天统计存活和死亡的个数，直到所有线虫均死亡。线虫L1期计为第0天，成虫在产卵期每天转移到新鲜NGM板上，在第7天后，每隔1天转移一次。用铂金线轻轻刺激时，不动的线虫则被评为死亡。

8. 统计学处理：采用GraphPad Prism 9.0软件对实验数据进行处理，数据符合正态分布，以x±s表示，采用独立样本t检验进行两组间比较，生存曲线采用Log-rank(Mantel-Cox)统计分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

结果

1. 不同剂量率电子射线对N2线虫生长发育的影响：辐射后体长和体宽实验结果见图 1。体长检测结果显示，照后第3天，CONV组和UHDR组线虫体长均明显短于SHAM组(t=4.81、4.83，P＜0.05)。第6和10天时，与SHAM组相比，CONV组体长明显较短(t=3.63、3.63，P＜0.05)；与SHAM和CONV组相比，UHDR组体长明显增加(t= -11.84~-2.87，P＜0.05)，见图 1A。体宽检测结果显示, 照后第3天，各组间体宽差异无统计学意义(P>0.05)。照后第6和10天，与SHAM组相比，CONV组体宽明显较短，差异有统计学意义(t=3.38、3.18，P＜0.05)；UHDR组与SHAM组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但与CONV组比较，体宽明显增加(t= -4.43、-3.37，P＜0.05)(图 1B)。

注：SHAM. 对照组；CONV. 常规剂量率组；UHDR. 超高剂量率组。a与同一时间SHAM组比较，t=4.81、4.83、3.63、-9.85、3.63、-2.87、3.38、3.18，P＜0.05；b与同一时间CONV组比较，t=-11.84、5.70、-4.43、-3.37，P＜0.05 图 1 CONV和UHDR脉冲电子射线辐射对线虫体长(A)和体宽(B)的影响 Figure 1 Effects of CONV and UHDR pulsed electron beam irradiation on body length (A) and body width (B) of C.elegans

2. 不同剂量率电子射线对N2线虫运动能力的影响：线虫运动能力结果如图 2所示，照后第3和10天，与SHAM组相比，辐射组头部摆动和身体弯曲次数差异均无统计学意义(P>0.05)；照后第6天，与SHAM组相比，CONV组和UHDR组头部摆动和身体弯曲次数均明显降低(t=2.91、3.52、3.97、2.71，P＜0.05)。

注：SHAM. 对照组；CONV. 常规剂量率组；UHDR. 超高剂量率组。a与同一时间SHAM组比较，t=2.91、3.52、3.97、2.71，P＜0.05 图 2 CONV与UHDR电子线照射对线虫运动能力的影响  A. 头部摆动次数；B. 身体弯曲次数 Figure 2 Effects of CONV and UHDR electron beam irradiation on the motility of C. elegans A. Number of head swings; B. Number of body bends

3. 不同剂量率电子射线对N2线虫生殖能力的影响：SHAM组、CONV组、UHDR组平均产卵量分别为247、207、233个/只，与SHAM组相比，CONV组N2线虫总产卵量明显下降(t=5.54，P＜0.01)；UHDR组N2线虫总产卵量呈下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。与CONV组相比，UHDR组N2线虫总产卵量明显增多，差异有统计学意义(t=-5.99，P＜0.01)。

4. 不同剂量率电子射线对N2寿命的影响：生存曲线结果如图 3所示，线虫照后第11天出现死亡，第19天全部死亡。与SHAM组相比，CONV组N2线虫存活时间明显缩短(χ2=8.49，P＜0.01)，UHDR组N2线虫存活时间呈下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。

注：SHAM. 对照组；CONV. 常规剂量率组；UHDR. 超高剂量率组。CONV组与SHAM组比较，χ2=8.49，P＜0.05 图 3 CONV与UHDR电子射线暴露对N2线虫寿命的影响 Figure 3 Effect of CONV and UHDR electron beam irradiation on the lifespan of N2 nematodes of C. elegans

讨论

目前，UHDR脉冲辐射应用于肿瘤治疗还需要解决FLASH效应阈值和生物学机制的问题。一方面，大多数研究认为，产生FLASH效应，平均剂量率通常>40 Gy/s，但剂量率并不是唯一的决定因素，其他如脉宽、重频等射线参数同样重要。明确效应阈值及各参数最优化组合是其临床应用的前提，需要完成大量动物实验，现有动物模型通常难以进行大规模筛查。另一方面，UHDR脉冲辐射产生FLASH效应的生物学机制尚未完全阐明。领域内关于其机制的解释主要是氧耗竭学说[14-15]、免疫学说[16]等，但都不能合理解释FLASH效应，其问题主要在于缺乏适合的体内检测手段以及直接的实验证据。上述问题在一定程度上限制了UHDR脉冲辐射的转化应用。

UHDR脉冲辐射的FLASH效应特征，使其能够尽可能增加肿瘤照射剂量而提升患者疗效，因而在放疗领域有巨大潜力，成为该领域研究的热点。近年来，开展了大量研究，但其产生FLASH效应的阈值参数问题一直未根本解决，现有生物效应机制假说也存在诸多疑点，仍需大量实验研究予以充分解释和证明，建立合适的实验模型是解决上述问题的路径之一。

秀丽隐杆线虫已被证明是辐射生物研究的理想模式生物[17-18]。鉴于其特殊优势以及FLASH效应研究的需求，本研究通过检测UHDR脉冲电子射线照射后线虫的个体发育、运动能力、产卵率、寿命等指标，建立了UHDR脉冲辐射FLASH效应模型。线虫体长体宽可以直接反馈线虫的整体发育，运动能力可直接反映线虫抵御外界压力的能力[19]。线虫体型调节受到环境因素和神经系统的影响[20]。辐射作为一种应激源，可能会引发线虫体内的一系列应激反应，如激活某些保护性途径或信号通路，从而影响生长发育。体长、体宽和运动次数的检测结果显示，与常规电子线相比，UHDR脉冲辐射对线虫的损伤较小。产卵量可直接反映机体生殖能力，而在无脊椎动物模型中，生殖功能常被视为最为敏感的辐射生物效应指标，其对辐射的敏感性可能与生物体内的衰老机制相关联[21]。产卵量统计结果表明，相比于常规电子线，UHDR脉冲电子射线对线虫的生殖功能损伤较小，这与Pawelke等[22]发现高剂量率电子射线能保护斑马鱼胚胎的发育相互验证。寿命是线虫辐射损伤的评价终点，本研究发现，与常规剂量率照射不同，相同剂量的UHDR脉冲辐射线虫寿命无明显变化。

综上所述，常规放疗低剂量率辐照线虫会抑制其生长发育、降低运动行为能力、损害生殖系统和缩短寿命，而UHDR脉冲辐射对线虫造成整体损伤更轻，这与临床研究中UHDR照射相较常规剂量率照射能减轻不良反应相符[23]。鉴于秀丽隐杆线虫在大规模实验筛查和分子指标检测的优势，本研究建立的秀丽线虫UHDR脉冲辐射FLASH效应模型为探索UHDR脉冲辐射研究提供了新的参考。

利益冲突  全体作者没有任何利益冲突，未接受任何不当的职务或财务利益

作者贡献声明  吴双、李志慧负责实验操作、数据整理分析、论文撰写；洋雯茜负责部分数据及文献整理，协助论文撰写；董国福、王长振指导论文修改

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