2024, Vol. 44
2. 四川大学华西基础医学与法医学院, 成都 610041
2. West China School of Basic Medical Science and Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041, China
食管癌是我国高发的消化道肿瘤，目前已成为导致癌症相关死亡的第6大原因[1]。放疗作为食管癌临床治疗的手段之一，是许多不可手术切除肿瘤患者的治疗选择[2]。然而，其疗效往往都不是很理想。因此，亟需找到一种新的放射增敏途径，来提高食管癌的放疗效率。
三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)作为四氢生物蝶呤(BH4)体内从头合成途径的关键酶，在癌症进展中发挥重要作用[3-4]。GCH1的活性通过转录、转录后、翻译后修饰以及与GCH1反馈调节蛋白(GFRP)的相互作用进行调节[4-5]。研究发现，内皮细胞中，GCH1在丝氨酸81位点(S81)被磷酸化后，降低了GFRP的反馈抑制，并使其活性及BH4水平升高约30倍[6-7]。因此，突变GCH1的S81位点可能引起GCH1活性的显著抑制。前期实验已经证实，通过沉默在食管癌细胞中高表达的富含AU元件的RNA结合因子1(AUF1)，可以降低GCH1的表达，进而抑制食管癌细胞的生长并促进细胞凋亡[8]。然而，食管癌细胞的生长及其放射敏感性是否受到GCH1磷酸化水平的调控，目前还尚未见有研究报道。
因此，本实验通过构建并感染S81点突变模拟去磷酸化的GCH1腺病毒载体，探究GCH1磷酸化水平对食管癌生长及放射敏感性的影响，验证GCH1去磷酸化突变体GCH1-S81A提高食管癌放射敏感性的可能性，有望为食管癌的临床治疗提供新的思路。
材料与方法1. 主要试剂与仪器：人食管鳞癌细胞KYSE-150购于上海中乔新舟生物科技有限公司，阴性对照腺病毒载体(Ad-NC)、编码野生型GCH1腺病毒载体(Ad-GCH1)、以天冬氨酸取代S81模拟磷酸化的GCH1腺病毒载体(Ad-GCH1-S81D)、以丙氨酸取代S81模拟去磷酸化的GCH1腺病毒载体(Ad-GCH1-S81A)购于济南维珍生物科技有限公司，RPMI-1640培养基、胎牛血清、青链霉素购于上海VivaCell公司，CCK-8试剂盒、活性氧检测试剂盒购于上海碧云天生物科技公司，脂质过氧化荧光探针购于美国MCE公司，Annexin-V/FITC细胞凋亡检测试剂盒购于上海YEASEN生物科技公司，GAPDH抗体购于美国CST公司，FACL4、α-Tubulin和GPX4抗体购于英国Abcam公司，GCH1抗体购于美国Affinity公司，GCH1磷酸化抗体由成都Zen Bioscience公司提供，HRP标记山羊抗兔二抗购于上海碧云天生物科技公司。采用美国KUBTEC公司KUBTEC XCELL320生物辐照仪进行X射线照射。
2. 细胞培养及照射方式：KYSE-150人食管鳞癌细胞采用10% 胎牛血清及青、链霉素各100 U/ml的RPMI-1640培养基，在37℃、含5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。辐照仪能量为320 kV，射野大小20 cm × 20 cm，源靶距为50 cm，克隆实验照射剂量为2、4、6和8 Gy，其余实验均采用10 Gy X射线进行照射，剂量率为1.50 Gy/min。
3. 细胞感染：选取对数生长期的KYSE-150细胞，以2×105个/孔接种于6孔板中，待细胞汇合度达40%左右，换为无血清培养基，根据病毒感染复数值(MOI)计算所需病毒体积，根据前期实验结果，感染KYSE-150细胞最佳MOI为100。分别加入Ad-NC、Ad-GCH1、Ad-GCH1-S81D、Ad-GCH1-S81A腺病毒感染，感染体系为1 ml，6~8 h后更换为正常培养基，继续培养48 h后予以检测感染效率，并将稳定细胞系传代用于后续试验。
4. Western blot法检测相关蛋白表达：收集各组KYSE-150细胞，置于冰上用放射免疫沉淀法裂解缓冲液(RIPA)裂解15 min后刮取收集，将制备好的蛋白样品于10% SDS-PAGE凝胶中电泳分离，设置浓缩胶电压90 V，电泳30 min待蛋白Marker分离后，分离胶130 V继续电泳70 min，随后300 mA恒流转膜120 min至PVDF膜，5%脂奶粉室温封闭2 h，按比例稀释并加入相关一抗，4℃孵育过夜。Tris缓冲盐溶液+吐温(TBST)洗膜3次后加入按比例稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜3次后电化学发光(ECL)显影、曝光，以α-Tubulin及GAPDH为参照，采用ImageJ分析各蛋白表达水平。
5. CCK-8法检测细胞存活率：取对数生长期的KYSE-150细胞，按上述方法进行铺板感染，实验组分为空载病毒组、空载+照射组、GCH1去磷酸化组、GCH1去磷酸化+照射组、回补验证组、回补验证+照射组。其中回补验证组及回补验证+照射组中，Ad-GCH1-S81A与Ad-GCH1同时感染，病毒总量与其他组一致，比例为1∶1。形成稳定细胞株后，消化重悬，以7×103个/孔接种于96孔板中，每组设4平行复孔；铺板24 h后对各照射组给予10 Gy的X射线处理，继续培养24 h后按CCK-8试剂盒说明书对各组进行检测。使用酶标仪读取450 nm波长处吸光度(A)值，计算各组细胞存活率。
6. 细胞克隆实验检测放射敏感性：选取对数生长期的KYSE-150细胞，按分组要求(空载病毒组和GCH1去磷酸化组)予以对应腺病毒感染处理，形成稳定细胞株后，按X射线照射剂量分别将0、2、4、6和8 Gy以2 000、3 500、5 000、7 000和10 000个/孔接种于6孔板中，每组设4平行复孔。予以对应剂量的X射线照射，照射后更换培养液，继续培养10 d，至出现肉眼可见的细胞克隆团后终止培养。收板后用4%多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色30 min，只对≥50个细胞的克隆团予以计数，计算克隆形成率及辐射增敏率。
7. 流式细胞术检测细胞活性氧(ROS)含量、凋亡率及脂质过氧化水平：选取对数生长期的KYSE-150细胞，以1×105个/孔接种于12孔板中。按上述分组要求进行感染处理，每组设4平行复孔。感染48 h后对各照射组予以10 Gy的X射线处理，继续培养8 h后使用活性氧检测试剂盒，按照说明书对细胞进行处理；培养48 h后使用Annexin V-FITC/PE及脂质过氧化荧光探针并按照说明书对细胞进行染色。使用流式细胞仪检测细胞ROS水平、细胞凋亡水平及脂质过氧化水平，使用FlowJo软件进行数据分析。
8. 统计学处理：应用SPSS 23.0软件进行统计学分析，所有实验重复3次。经正态性检验实验数据符合正态分布采用x±s表示。采用配对t检验分析两组间差异，多组间比较经方差齐性检验采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1. 腺病毒感染效率检测：相较于空白对照组，空载病毒组中KYSE-150细胞GCH1及p-GCH1蛋白表达量均无明显差异。与空载病毒组相比，GCH1腺病毒感染后的各组KYSE-150细胞GCH1表达量均有上升；而在感染Ad-GCH1-S81A腺病毒去磷酸化后，KYSE-150细胞磷酸化蛋白p-GCH1表达量较野生GCH1组(Ad-GCH1)和GCH1磷酸化组(Ad-GCH1-S81D)均有下降[GCH1去磷酸化组vs. 野生GCH1组=(1.83±0.11) vs.(2.50±0.15)，t=9.35，P < 0.05；GCH1去磷酸化组vs. GCH1磷酸化组=(1.83±0.11) vs.(2.91±0.06)，t=16.57，P < 0.05，图 1]。结果表明Ad-GCH1-S81A腺病毒感染KYSE-150细胞后GCH1去磷酸化效果明显。
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注：1.空白对照组；2.空载病毒组；3.野生GCH1组；4.GCH1磷酸化组；5.GCH1去磷酸化组。a与野生GCH1组及GCH1磷酸化组相比，t=9.35，16.57，P < 0.05 图 1 Western blot检测Ad-GCH1-S81A腺病毒去磷酸化效率 A. Western blot检测条带；B. p-GCH1蛋白相对表达水平柱状图 Figure 1 Dephosphorylation efficiency of Ad-GCH1-S81A adenoviruses detected using the western blot A. Western blot bands; B. Bar chart showing the relative expression levels of p-GCH1 proteins |
2. GCH1-S81A突变联合电离辐射对细胞活性影响：与空载病毒+照射组相比，GCH1-S81A突变后的KYSE-150细胞，在受到10 Gy X射线照射后存活率明显降低[GCH1去磷酸化+照射组vs.空载+ 照射组=(65.60±0.76)% vs.(97.57±2.25)%，t=26.97，P < 0.05]；而在回补验证+照射组中，KYSE-150细胞存活率较去磷酸化+照射组有所上升[回补验证+照射组vs. GCH1去磷酸化+照射组=(75.09± 4.25)% vs.(65.60±0.76)%，t=4.40，P < 0.05，图 2]。结果表明GCH1-S81A突变联合电离辐射能够明显降低食管癌细胞存活率，而补充野生型GCH1能够一定程度提高照射后GCH1-S81A突变的细胞的存活率。
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注：1.空载病毒组；2.GCH1去磷酸化组；3.回补验证组。 a与空载+照射组相比，t=26.97，P < 0.05；b与GCH1去磷酸化+照射组相比，t=4.40，P < 0.05 图 2 CCK-8法检测不同剂量照射24 h后GCH1突变体对KYSE-150细胞存活率的影响 Figure 2 Impacts of GCH1 mutants on the survival rates of KYSE-150 cells after 24 h of 10 Gy X-ray irradiation detected using the CCK-8 assay |
3. GCH1-S81A突变对食管癌细胞放射敏感性的影响：随着辐射剂量的增加，空载病毒组KYSE-150细胞的克隆形成能力逐渐减弱，且GCH1-S81A突变后的细胞克隆形成能力在各照射剂量下(2、4、6、8 Gy)均弱于空载病毒组(图 3A)，并依据“单击多靶模型”拟合细胞存活分数曲线图[各照射剂量下GCH1去磷酸化组vs.空载病毒组=(0.66±0.03)vs.(0.87±0.05)；(0.35±0.03)vs.(0.51±0.03)；(0.19±0.03)vs.(0.39±0.02)；(0.04±0.01)vs.(0.13±0.02)；t=7.31、7.94、11.80、8.16，P < 0.05，图 3B]，通过计算获得放射增敏参数与增敏比(表 1)。与空载病毒组相比，GCH1去磷酸化组的D0、Dq的值均减小，SER为1.17。结果表明，GCH1-S81A突变可明显促进放射治疗中食管癌细胞的增殖抑制。
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注：GCH1.三磷酸鸟苷环化水解酶1 图 3 GCH1-S81A突变对KYSE-150细胞放射敏感性的影响 A. KYSE-150细胞克隆集落形成图片；B. KYSE-150细胞存活分数曲线 Figure 3 Impacts of GCH1-S81A mutants on the radiosensitivity of KYSE-150 cells A. Images showing the colony formation of KYSE-150 cells; B. Curves showing the survival fractions of KYSE-150 cells |
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表 1 GCH1-S81A对KYSE-150细胞的放射增敏性影响 Table 1 Impacts of GCH1-S81A on the radiosensitization of KYSE-150 cells |
4. GCH1-S81A突变联合电离辐射对细胞ROS生成影响：与空载病毒组相比，KYSE-150细胞受到10 Gy X射线照射后，ROS水平升高，具有统计学意义[空载+照射组vs.空载病毒组=(1.80±0.09)vs.(1.00±0.03)，t=17.89，P < 0.05]；而在GCH1-S81A突变去磷酸化后，去磷酸化+照射组的细胞ROS释放量明显高于空载+照射组[GCH1去磷酸化+照射组vs.空载+照射组=(9.45±0.05)vs.(1.80±0.09)，t=157.06，P < 0.05]。在回补验证+照射组中，细胞ROS水平明显低于GCH1去磷酸化+照射组，具有统计学意义[回补验证+照射组vs. GCH1去磷酸化+照射组=(6.80±0.06)vs.(9.45±0.05)，t=66.38，P < 0.05，图 4]。结果表明，GCH1-S81A突变能提高食管癌细胞受照射后的ROS水平，促进细胞氧化损伤；而在补充野生型GCH1提高其磷酸化程度后，能够一定程度抑制由GCH1-S81A突变联合电离辐射所引起的ROS增加。
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注：1.空载病毒组；2.GCH1去磷酸化组；3.回补验证组 a与空载病毒组相比，t=17.89，P < 0.05；b与空载+照射组相比，t=17.89，P < 0.05；c与GCH1去磷酸化+照射组相比，t=66.38，P < 0.05 图 4 流式细胞术检测10 Gy X射线照射8 h后GCH1-S81A突变体对KYSE-150细胞ROS水平的影响 Figure 4 Impacts of GCH1-S81A mutants on ROS levels in KYSE-150 cells after 8 h of 10 Gy X-ray irradiation detected using the flow cytometry |
5. GCH1-S81A突变联合电离辐射对细胞凋亡水平影响：相比于空载病毒组，KYSE-150细胞在受到10 Gy X射线照射后，凋亡水平明显升高，具有统计学意义[空载+照射组vs.空载病毒组=(11.54±0.26)% vs.(4.82±0.26)%，t=37.19，P < 0.05]。而在GCH1-S81A突变联合照射后，细胞凋亡水平明显高于空载+照射组，且差异具有统计学意义[GCH1去磷酸化+照射组vs.空载+照射组=(27.92± 0.26)% vs.(11.54±0.26)%，t=59.02，P < 0.05]。而在回补验证+照射组中，细胞凋亡水平较GCH1去磷酸化+照射组有明显降低，差异有统计学意义[回补验证+照射组vs. GCH1去磷酸化+照射组=(20.45±0.18)% vs. (27.92±0.26)%，t=30.62，P < 0.05，图 5]。结果表明，电离辐射能够诱导KYSE-150细胞发生凋亡，且在联合GCH1-S81A突变去磷酸化后促凋亡效果更加明显，GCH1-S81A突变具有放射增敏作用；而在补充野生型GCH1后，能够一定程度抑制由GCH1-S81A突变所引起的辐照后的KYSE-150细胞的凋亡。
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注：1.空载病毒组；2.GCH1去磷酸化组；3.回补验证组。 a与空载病毒组相比，t=37.19，P < 0.05；b与空载+照射组相比，t=59.02，P < 0.05；c与GCH1去磷酸化+照射组相比，t=30.62，P < 0.05 图 5 流式细胞术检测10 Gy X射线照射48 h后GCH1-S81A突变体对KYSE-150细胞凋亡率的影响 Figure 5 Impacts of GCH1-S81A mutants on the apoptosis rates of KYSE-150 cells after 48 h of 10 Gy X-ray irradiation detected using the flow cytometry |
6. GCH1-S81A突变联合电离辐射对细胞铁死亡相关蛋白表达量的影响：相较于空载病毒组，GCH1-S81A突变后GPX4表达量有所下降[GCH1去磷酸化组vs.空载病毒组=(0.79±0.02)vs.(1.00 ± 0.05)，t=4.55，P < 0.05]，且在联合照射后GPX4表达量低于空载+照射组[GCH1去磷酸化+照射组vs.空载+照射组=(0.69±0.04)vs.(0.98±0.04)，t=12.98，P < 0.05，图 6B]，而FACL4蛋白表达量仅在GCH1-S81A突变后有所上升[GCH1去磷酸化组vs.空载病毒组=(1.45±0.04)vs.(1.00±0.03)，t=18.58，P < 0.05，图 6C]。结果表明GCH1-S81A突变联合电离辐射可以降低食管癌细胞中GPX4水平，促进细胞铁死亡。
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注：1.空载病毒组；2.GCH1去磷酸化组；3.回补验证组。a与空载病毒组相比，t=4.55，P < 0.05；b与空载+照射组相比，t=12.98，P < 0.05；c与空载病毒组相比，t=18.58，P < 0.05 图 6 Western blot检测铁死亡相关蛋白的表达量 A. Western blot检测条带；B. GPX4蛋白相对表达水平柱状图；C. FACL4蛋白相对表达水平柱状图 Figure 6 Expression levels of ferroptosis-related proteins detected using the western blot A. Western blot bands; B. Bar chart showing the relative expression levels of GPX4 proteins; C. Bar chart showing the relative expression levels of FACL4 proteins |
7. GCH1-S81A突变联合电离辐射对细胞脂质过氧化水平的影响：为了对实验结果进行进一步验证，采用流式细胞术检测辐照后食管癌细胞脂质过氧化水平，反应其铁死亡程度(图 7)。与空载病毒组相比，KYSE-150受到10 Gy X射线照射后脂质过氧化水平明显升高[空载+照射组vs.空载病毒组=(2.63±0.02)vs.(1.00±0.01)，t=131.10，P < 0.05]，且在GCH1-S81A突变联合照射后，脂质过氧化水平高于空载+照射组[GCH1去磷酸化+照射组vs.空载+照射组=(3.76±0.02)vs.(2.63±0.02)，t=97.81，P < 0.05]；在回补验证+照射组中，细胞脂质过氧化水平较GCH1去磷酸化+照射组有所降低，差异有统计学意义[回补验证+照射组vs. GCH1去磷酸化+照射组=(3.27±0.02)vs.(3.76±0.02)，t=23.08，P < 0.05]。结果表明，GCH1-S81A突变可以促进食管癌细胞发生脂质过氧化，诱导细胞铁死亡，且在联合X射线照射后能够加剧这一现象；而在补充野生型GCH1提高其磷酸化程度后，能够一定程度抑制由GCH1-S81A突变联合电离辐射所引起的细胞铁死亡。
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注：1.空载病毒组；2.GCH1去磷酸化组；3.回补验证组。 a与空载病毒组相比，t=131.1，P < 0.05；b与空载+照射组相比，t=97.81，P < 0.05；c与GCH1去磷酸化+照射组相比，t=23.08，P < 0.05 图 7 流式细胞术检测10 Gy X射线照射48 h后GCH1-S81A突变体对KYSE-150细胞脂质过氧化水平的影响 Figure 7 Impacts of GCH1-S81A mutants on lipid peroxidation levels in KYSE-150 cells after 48 h of 10 Gy X-ray irradiation detected using the flow cytometry |
讨论
降低食管癌中的GCH1表达能够抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡。而在前期研究中，与直接敲低或抑制细胞中GCH1的表达及活性相比，利用腺病毒载体构建的过表达GCH1的食管癌细胞株更具稳定性和可控性，因此，选择通过构建可显著抑制GCH1活性的GCH1-S81A突变体来探究其对食管癌细胞放射敏感性的影响。GCH1活性受到GFRP的调节，过去的研究认为，GFRP结合GCH1的抑制作用是通过降低底物亲和力、抑制与底物结合产生的。近期报道，GCH1-GFRP复合物通过控制解离速率的非竞争性抑制机制起作用，研究发现，GFRP是一种支架蛋白，其与GCH1结合对GCH1整体构象没有显著改变，并不影响GCH1与底物相结合，只是影响产物转化[9-10]。GCH1-S81A突变后会增强其与GFRP的结合，因此，GCH1-S81A突变体可能会对食管癌细胞自身GCH1产生拮抗作用，其可能通过竞争性结合底物GTP，降低产物BH4的转化率，从而影响食管癌放射敏感性。本研究发现，在补充未被去磷酸化的GCH1后，GCH1-S81A突变对细胞造成的影响会被抑制，也验证了这一假设。
电离辐射能够诱导ROS积累，引起氧化应激导致细胞损伤[11]。而GCH1-BH4轴可以通过抑制一氧化氮合酶(NOS)解偶联，恢复NO水平以及抑制ROS的产生，起到辐射防护作用[12]。研究报道，食管癌细胞中ROS升高能够诱导内质网应激从而导致细胞死亡[13]；同时，高水平的ROS还能通过激活JNK信号通路以及抑制Nrf2的产生，促进食管癌细胞凋亡[14]。在本研究中发现，通过GCH1-S81A突变，能够提高食管癌细胞中ROS水平，促进肿瘤细胞凋亡，并且抑制了GCH1-BH4轴的辐射抵抗作用，提高其辐射敏感性。
GCH1-BH4通路同样被报道为是铁死亡的保护机制[15]。近年来，由于铁死亡在癌症治疗中的潜在作用，逐渐成为研究热点。谷胱甘肽-谷胱甘肽过氧化物酶4(GSH-GPX4)轴是铁死亡的主要防御机制，其主要通过GSH与GPX4的协同作用，消除细胞内积累的ROS，从而中止脂质氧化反应[16]。研究表明，GPX4抑制剂可以诱导食管癌细胞发生铁死亡，具有抗肿瘤作用[17]。而GCH1-BH4通路能够保护GPX4敲除细胞免于铁死亡，完全独立于GSH-GPX4轴发挥作用。GCH1衍生产物BH4作为强效抗氧化剂，其本身能够抑制细胞内脂质过氧化物产生并对抗铁死亡；另一方面，过表达GCH1的细胞能够选择性保护一些多不饱和脂肪酸(PUFA)链免于降解，从而抑制铁死亡的发生[15]。电离辐射能够降低BH4水平和生物利用度，这可能与BH4的氧化和诱导GCH1反馈调节蛋白(GFRP)表达从而抑制GCH1活性有关，为GCH1参与电离辐射诱导的细胞铁死亡提出可能[7]。本研究中，GCH1-S81A突变能够降低GPX4的表达，并促进其发生脂质过氧化，诱导食管癌细胞铁死亡，且在联合电离辐射后进一步加剧这种作用。这表明GCH1铁死亡保护作用可能还受其磷酸化水平调控，且GCH1/BH4轴可能并非完全独立GSH/GPX4轴发挥作用，两者可能相互影响。这一结果同时为GCH1-S81A突变能够提高食管癌放射敏感性提供了有力证据。
此外，铁死亡和细胞凋亡之间存在相互联系，铁死亡诱导剂与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)联合使用可以显著增强肿瘤杀伤效果[18]。另一项研究表明，经典的抑癌基因P53可以在某些条件下诱导铁死亡，MON-P53作为P53的一种新型复合物，当其被内化时，铁离子可以诱导芬顿反应，产生ROS。体内外研究发现，除了细胞凋亡外，在MON-P53处理过的细胞中还观察到明显的铁死亡，这不仅抑制了肿瘤细胞的生长，还延长了荷瘤小鼠的寿命[19]。而本研究发现GCH1-S81A突变体有相似的作用，能够同时促进受照的食管癌细胞凋亡与铁死亡，这种凋亡/铁死亡混合途径有望成为一种新的抗癌策略。
本研究揭示了GCH1磷酸化水平变化对食管癌进展的影响，还进一步验证了去磷酸化突变体GCH1-S81A提高食管癌放射敏感性的可行性，这为临床治疗以及开发相关放射增敏药物提供了新的思路。
利益冲突 无
作者贡献声明 徐霄鹏和戴军负责实验设计、实施研究、采集并整理数据、起草论文、统计分析；高昳、王坚、孙春堂参与部分实验和数据整理；刘鹏飞和张舒羽指导实验设计和论文修改
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