核技术在能源、医药等领域带来巨大利益的同时，也带来了环境、职业、健康等方面的风险。在不可控的因素下，一旦发生核或辐射应急事故以及恐怖主义事件时，极可能涉及职业人员或大规模人群照射。在这种情况下需要及时对受照人员或人群进行辐射生物剂量估算。胞质分裂阻断微核法是一种适用于放射工作人员职业健康检查中微核检查和急性全身外照射的生物剂量估算方法^[1-3]。微核自动化分析可以做到大批量生物剂量估算^[4-5]。本研究运用Metafer玻片扫描软件的人工智能彩色微核自动分析模块，建立基于微核率的剂量-效应曲线，可快速有效地估算辐射受照人员的生物剂量，为伤员的分类、诊断和治疗提供有力保障。

1. 主要仪器和试剂：人工智能彩色微核分析系统(P-2040-012-MS，德国蔡司公司)；恒温培养箱(PIF200，英国Carbolite公司)；人外周血细胞培养基(CM-P-50，上海乐辰生物科技有限公司)；细胞松弛素B(C6762，美国Sigma公司)。

2. 样本采集：实验室作为放射性职业体检微核检测实验室，按照随机数字表法抽取一批2023年体检放射工作人员，共77人(男48人，女29人，年龄21~60岁)。无菌条件下使用肝素钠抗凝管采集志愿者肘静脉血，每人1管，每管平均2 ml血样。

建立微核曲线采集血样情况。招募4名成年健康志愿者(男2人，女2人，年龄20~35岁)，纳入标准：非放射工作人员，无烟酒嗜好，半年内无有毒有害化学物质接触史、无射线接触史、无急慢性疾病史，近一个月无病毒感染史。无菌条件下使用肝素钠抗凝管采集志愿者肘静脉血，每人8管，每管平均1.5 ml血样。排除标准：未成年人，白细胞数量异常者，有遗传性疾病史，近半年接受过CT照射者。本研究经重庆市疾病预防控制中心伦理委员会审核批准(审批号：KY-2023-004-1)，招募者均签署知情同意书。

3. 离体照射条件：委托中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所，采用γ射线辐照仪照射建立剂量-效应曲线的抗凝血样，照射剂量分别为0、0.25、0.5、1、2、3、4和5 Gy，剂量率为0.74 Gy/min；验证剂量-效应曲线抗凝血样的照射剂量分别为1.70和3.80 Gy，剂量率为0.84 Gy/min。照射后将样本放于37℃恒温培养箱中静置2 h修复。

4. 细胞培养与制备：依照GBZ/T 328-2023《放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞细胞微核检测方法与受照剂量估算标准》^[6]，将采集的静脉血0.5 ml加入人外周血细胞培养基中，轻轻摇匀，(37±0.5)℃恒温培养。培养至44 h，加入细胞松弛素B，使其终浓度为6μg/ml，继续培养至66 h收获细胞。

5. 微核的分析：本方法选用蔡司(Carl ZEISS，德国)提供的Metafer软件，采用牛津大学计算机视觉组合Google DeepMind公司研发的深度卷积神经网络(visual geometry group net，VGG)深度卷积神经网络^[7]训练方法，该网络深度有16层，共包含参数约1.38亿。

该人工智能彩色识别微核程序是运用VGG-16网络训练法建立卷积神经网络(CNN)模型。将扫描的淋巴细胞图片输入图库中，用CNN模型进行检测，包括去掉单核、多核、杂质和其他，筛选出包浆完整的单核和双核细胞，并识别出单核和双核中的微核及其数量。将这些检测后的图像数据由完全监督的方式进行输出展示，得到5个类别，包括有微核的单核细胞、无微核的单核细胞、有微核的双核细胞、无微核的双核细胞，以及杂质或其他。最后统计出单核细胞和双核细胞结果，包括细胞数、微核数、微核细胞率(×10^-3)、微核率(×10^-3)、淋巴细胞转化率(LTR，%)。从扫片开始全程无需人工干预。

实际操作中，系统会自动完成每个视野的扫描和分析，10倍镜头下每视野图片处理时间为2.5 s。自动结果出来后，使用系统搭配的快速分类键盘进行人工单双核、微核的复核和修正。经过自动分析和人工复核的微核数据为最终检测结果。

6. 剂量-效应曲线拟合：对于低传能线密度γ射线诱导的微核与受照射剂量之间的剂量-效应关系以拟合二次多项式为宜，按照式(1)进行拟合：

式中, y为微核率，10^-3；a、b为回归系数；c为本底微核率，10^-3；D为吸收剂量，Gy。

7.统计学处理：对于低传能线密度辐射，将双核细胞数和微核数输入国际原子能机构(IAEA)推荐的CABAS软件，拟合二次多项式剂量-效应曲线。

1. 软件辅助分析与人工分析微核结果比较：随机选取本实验室职业健康检查微核玻片77张，进行软件辅助分析与人工分析两种方法比较。软件辅助分析和人工分析分别用时14 h(机器扫描10 h，人工复核4 h)和3 d(每天工作8 h)；微核异常检出率分别是6.5%和5.2%，异常检出效率提高1.4倍。

2. 双核细胞和微核纳入情况：4名成年健康志愿者的样本经过自动系统检测，其微核的真阳性率47%、假阳性率53%。人工再依照《GBZ/T 328- 2023放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞细胞微核检测方法与受照剂量估算标准》确定纳入双核细胞和微核，具有代表性的假阳性微核实例详见图 1。

注：A、B绿色标记内为主核上的树突，未与主核完全分开，没有各自的完整核膜，不是微核；C、D、E绿色标记内是染料着色，没有核物质的完整核膜，颜色较浅，结构疏松，都与胞核质感颜色不同；F微核置于胞质外，不能确定是否为该细胞微核，不统计为该双核细胞的微核 图 1 假阳性微核的双核细胞 Figure 1 Binuclear cells with false positive micronuclei

3. 细胞松弛素B阻断法微核分析结果：随着照射剂量的增加，微核率和微核细胞率增高。而随着剂量增高，细胞中出现2个及以上微核的细胞数也相应增加，因此，微核率与微核细胞率之间的差距也逐渐增加(表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 细胞松弛素B阻断法微核分析结果 Table 1 Micronucleus analysis results of the cytochalasin B blocking micronucleus method 剂量点 (Gy) 计数细胞数 含不同微核数的细胞数 微核细胞数 微核数 微核细胞率 (×10-3) 微核率 (×10-3) 0 1 2 3 4 5 6 0 43 650 43 190 402 38 6 8 4 2 460 560 10.54 12.83 0.25 20 730 20 382 304 36 6 2 0 0 348 402 16.79 19.39 0.50 12 182 11 786 358 30 6 2 0 0 396 444 32.51 36.45 1.00 11 724 11 058 598 54 10 2 0 2 666 756 56.81 64.48 2.00 4 618 3 904 598 106 4 6 0 0 714 846 154.61 183.20 3.00 1 988 1 338 496 116 26 12 0 0 650 854 326.96 429.58 4.00 1 480 892 360 154 52 20 0 2 588 916 397.30 618.92 5.00 1 018 442 350 158 52 14 2 0 576 888 565.82 872.30

表 1 细胞松弛素B阻断法微核分析结果 Table 1 Micronucleus analysis results of the cytochalasin B blocking micronucleus method

4. 剂量-效应曲线拟合：将照射剂量、双核细胞数和微核数等数据导入CABAS软件，基于每细胞微核数，拟合出0~5 Gy剂量范围内，微核率与照射剂量间的剂量效应的回归方程为y=0.0321D²+0.0237D+0.01271(R²=0.998)。其中，y为每细胞微核数；D为吸收剂量，Gy(图 2)。

图 2 0 ~ 5 Gy范围内60Co γ射线照射微核率与剂量间的剂量效应曲线 Figure 2 Dose-response curve between the frequency of micronuclei and the irradiation dose of 60Co γ-rays within a dose range of 0-5.00 Gy

5. 剂量-效应曲线验证：将实验室制备的2张盲样标本玻片进行人工智能彩色微核识别，系统设置分析2 000个有效细胞，再人工审核确认数据后，将微核率带入拟合的剂量-效应曲线进行生物剂量估算。曲线估算剂量均值分别为1.88和4.14 Gy，详见表 2。估算剂量与实际照射剂量进行比较，相对偏差均＜20%，说明该拟合曲线可以较准确地估算受照剂量。

表 2(Table 2)

表 2 微核率剂量-效应曲线验证 Table 2 Verification of the dose-response curve of the frequency of micronuclei 剂量点 (Gy) 分析细胞数 微核数 微核率及其95% CI(×10-3) 估算剂量均值及其 95%CI(Gy) 相对偏差 (%) 1.7 2 000 342 171(152.88~189.12) 1.88(1.752~2.004) 10.67 3.8 2 000 1 322 661(625.37~696.63) 4.14(4.014~4.260) 8.91

表 2 微核率剂量-效应曲线验证 Table 2 Verification of the dose-response curve of the frequency of micronuclei

辐射或大规模核事故发生后，可能会使相关人员或成千上万人暴露在未知和可变剂量的辐射之下^[8]。需要对大量的人员进行快速分类诊断，确保将最佳的医疗资源用到需要的人员身上^[9-10]。在不能进行物理剂量估算的情况下，生物剂量评估起到重要的作用^[11-12]。因此，针对应急突发事故，迫切需要建立快速和高通量的生物剂量检测技术，满足大规模的需求，有效指导分级诊断和治疗^[13]。同时，生物剂量估算新技术的完善不仅可以尽快消除大规模恐慌，还可以评估暴露后癌症及其他非癌疾病的风险^[14]。

生物剂量估算的方法主要有胞质分裂阻断微核、双着丝粒体和早熟染色体凝集-环这三种方法^[15]。首先，相较于后两种方法，胞质分裂阻断微核法制片和检测方法简单，通过对技术人员短期培训后即可掌握，因此使用微核自动分析系统在应对发生应急辐射或大规模核事故时对受照者的剂量分类有很好的实用价值。其次，由于间期细胞中的微核可以相对可观的评估，只要实验人员在胞质分裂阻断微核法中确定双核细胞的数量和所有样本中微核细胞率发生率，就可以相对快速对载玻片进行评分，并实现自动化。自动扫描一张微核玻片时间约8 min，分析2 000个双核细胞即可估算出剂量。所以自动化仪器辅助分析微核生物剂量估算法有推广空间。

胞质分裂阻断微核法分析常用的有显微镜视觉分析、流式细胞仪、激光扫描细胞或图像分析等。人工显微镜视觉分析面临许多局限性。一是常规体检双核细胞分析最低需要1 000个有效细胞，每样本分析细胞数量大，且一次性检测对象人数多，常规放射工作人员职业健康检查机构很难保质保量完成。二是核应急事故发生时，人工检测双核细胞和估算剂量时效性差，可能耽误受照人员分级诊断和治疗^[16]。流式细胞术、激光扫描和图片分析涉及到细胞悬液或载玻片的各种染色，常规使用姬吉姆萨染色和DNA特异性染色。使用恰当的荧光染色剂可以消除与未使用DNA特异性染色剂相关的颗粒或伪影，甚至还可以鉴定微核的内容物。但DNA特异性染料技术最大的问题是成本费用高，容易给放射体检机构和放射单位造成经济负担，现阶段高成本技术得不到普及推广。

本实验室人工智能软件辅助微核分析系统，适用于经济性姬姆萨染色，是扫描图像分析中的一种^[17]。理论上实验室确定制片细胞的浓度范围，在背景之上给出重复的和浓度相关的微核增加率，就可以证明该分析系统的灵敏度和动态范围，并实现自动化分析，作为目前市面上广泛推广的一种微核辅助分析技术，该系统自动扫描不间歇，不占用人工时间，可极大地提高微核检测时间；同时软件辅助微核检出率高于人工分析，2022年未使用该软件，重庆市放射工作人员微核异常率0.8%，2023年本实验室目前检测微核异常率4.26%，实践说明该软件微核检出率更高。

根据《OECD 487体外哺乳动物细胞微核试验》中指出，微核自动化分析是可行的^[18]。但国内微核剂量曲线目前还以人工镜下阅片结果为准，未见人工智能辅助分析的剂量曲线发表。本实验室在微核自动分析系统运用基础上，拟合胞质分裂阻断微核法的微核率与照射剂量标准曲线，并通过比较拟合曲线估算的剂量和真实受照的剂量，本实验室胞质分裂阻断微核生物剂量检测体系可以使用。该系统不仅提高了本实验室放射生物实验检测能力，还为本辖区核应急救援事业提供了有力的技术保障。

利益冲突  无

作者贡献声明  吴梦云负责实施研究、论文撰写；李炜负责指导实验；张华东负责论文修改；袁方负责材料支持；谭秀洪负责实验技术