造血干/祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs)是具有自我复制能力和多能性的血液干细胞，其功能正常是移植成功的关键^[1-2]。在经典的造血系统发育图谱中最顶层是长期造血干细胞(long-term hematopoietic stem cell, LT-HSC)，它可以产生所有血细胞，LT-HSC每次不对称分裂时会产生一个与自己本身一样的细胞，和一个短期造血干细胞(short-term hematopoietic stem cells, ST-HSC)或是多能祖细胞(multipotent progenitor, MPP)^[3-5]。HSPCs在发育过程中表面标记在不断变化，通常利用Lin^-c-Kit⁺Sca1⁺(LSK)代表HSPCs从而进行研究^[6]。

造血系统对电离辐射高度敏感，造血组织损伤出现时间早、症状严重、恢复困难，是所有类型急性放射病的共性以及病理生理基础。HSPCs作为所有血细胞的来源，其损伤修复对于放射造血损伤的救治具有重要意义。研究表明，电离辐射会造成骨髓HSPCs的活性氧(ROS)水平升高、DNA损伤增加、凋亡增加，以及克隆形成能力下降。胎肝HSPCs与成体骨髓HSPCs由于处于不同生态位及不同发育阶段，其特性存在多种差异，比如胎肝HSPCs增殖更加旺盛，处于S期细胞增多，ROS水平明显高于骨髓HSPCs等。但目前关于电离辐射对两种不同来源的HSPCs的影响，鲜见系统研究。本研究对电离辐射后胎肝和骨髓来源HSPCs中细胞凋亡、ROS水平、体外集落形成能力、DNA损伤情况进行了系统分析，并探讨了两种HSPCs体内重建能力，为深入探索不同来源HSPCs应对放射损伤应激的分子机制奠定了基础。

1. 实验动物及受照条件：遗传背景为CD45.1的C57BL/6J雄性小鼠(SPF级)、C57BL/6J雌性小鼠(SPF级)饲养在军事医学研究院SPF级实验动物中心，合格证号: SYXK(军)2012-0065。实验小鼠8周龄，体重20~23 g。按随机数表法，将12只小鼠分为骨髓组(BM)和胎肝组(FL)，每组6只，全身⁶⁰Co照射，照射剂量依次为4.5、5.0 Gy，间隔30 min，吸收剂量率为61.28 cGy/min。c-Kit⁺细胞分为0、5、10 Gy组，接受单次⁶⁰Co照射后培养12 h检测，吸收剂量率为71.61 cGy/min。

2. 主要试剂与仪器：M3434培养基购自加拿大Stemcell公司；红细胞裂解液购自深圳达科为公司；葡萄糖、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼(FCCP)、鱼藤酮(Rotenone) 购自美国Sigma公司；Cell-Tak^TM细胞组织黏合剂购自美国Corning公司；Brdu粉剂购自美国Sigma公司；流式计数微球(BEADS)、ROS检测试剂、RPMI 1640培养基购自赛默飞公司；c-Kit⁺细胞分选试剂盒、FVS 510、Sca1 BV605、c-Kit PE、CD48 APC、CD150 PECY7、CD45.1 FITC、CD45.2 PE、Ly6G FITC、Ly6C PECY7、B220 PECY7、CD3 APC、CD11b ef450、CD4 BV421、CD8 PECY7、BrdU FITC、DAPI 355、Gr-1 APC、F4/80 PECY7生物耦联素抗体、Gr-1、Ter119、B220、CD3、CD4、CD8、CD5、APC-H7生物素-链霉亲和素偶联抗体均购自美国BioLegend公司；寡霉素(Oligomycin)，抗霉素A(Antimycin A)购自英国Abcam公司；Seahorse XFe24细胞代谢动态分析仪购自美国安捷伦公司；流式细胞仪和流式分选仪购自美国BD公司；倒置相差显微镜及成像系统购自日本Olympus公司。

3. 骨髓细胞与胎肝细胞制备：取8周龄小鼠股骨和胫骨，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲出骨髓，800 × g离心5 min收集细胞。加入1 ×红细胞裂解液，室温裂解红细胞5 min，再次离心收集细胞，过45 μm细胞筛制成单细胞悬液备用；取见栓怀孕14.5 d孕鼠，取出胚胎用解剖针将胎肝分离，用2 ml注射器研磨胎肝，过45 μm细胞筛，制成单细胞悬液后续处理同骨髓细胞。

4. 细胞凋亡检测：收集培养后的细胞，800 × g离心5 min，弃上清后，用500 μl结合缓冲液重悬，标记Annexin-V和7-AAD抗体，避光孵育15 min后流式检测。

5. ROS检测：骨髓细胞和胎肝细胞用RPMI 1640培养基重悬，每样本加入0.5 μl CellROXUNSCEA ^Ⓡ Deep Red，室温避光孵育30 min，用PBS清洗，800 × g离心5 min后，用PBS重悬标记流式抗体，避光孵育15 min，清洗重悬后，标记1 μl SYTOX ^Ⓡ Blue Dead抗体，标记15 min后上机检测，流式检测使用FITC和APC通道。

6. 骨髓集落能力形成能力检测：流式分选c-Kit⁺细胞，按照8 000个细胞/孔加入600 μl M3434培养基，接种到12孔细胞板中，37℃、5% CO₂细胞培养箱培养8 d，倒置显微镜下观察集落形成情况，细胞数≥ 50为阳性集落。

7. γ-H2AX免疫荧光染色：细胞甩片，4%多聚甲醛固定，Triton X-100通透30 min，5%牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h，加入PH2AX一抗4℃过夜染色，Tritc二抗染色1 h后加入4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染液，染色15 min，50%甘油封片，荧光显微镜下观察。

8. 细胞周期检测：用生理盐水配置BrdU溶液，实验前1 d按照10 μg/g体重腹腔注射BrdU，实验当天小鼠尾静脉注射BrdU，2 h后进行检测。

9. 胎肝和骨髓HSPCs体内重建能力检测：受体小鼠照射后6 h分选LSK细胞移植，一组移植骨髓细胞(骨髓组)，一组移植胎肝细胞(胎肝组)，将供体细胞与竞争骨髓细胞按照1 ∶1的比例混合后共移植2 × 10⁶细胞。移植后12周处死，检测各谱系分化情况。

10. 线粒体压力检测：检测细胞外氧气消耗速率(oxygen consumption rate, OCR), 按照Seahorse XFe24细胞代谢动态分析仪操作步骤进行，葡萄糖、谷氨酰胺和丙酮酸钠使用浓度分别为1、2、10 mmol/L，pH为7.40 ± 0.05。线粒体压力测试剂分别注射2 μmol/L寡霉素(Oligomycin)，1.75 μmol/L FCCP，R&A包括1 μmol/L抗霉素(Antimycin)和1 μmol/L鱼藤酮(Rotenone)。实验结果按照Seahorse提供的数据计算线粒体压力测试相关指标。

11. 统计学处理：数据经正态性检验符合正态分布用x±s表示。流式图采用FlowJo软件分析，实验数据采用Graphpad 7.0软件处理和图形绘制，组间比较采用双侧t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

1. 照射后胎肝HSPCs与骨髓HSPCs中ROS水平检测：结果如图 1所示，照射后12 h骨髓HSPCs中ROS水平有一定升高，而胎肝HSPCs的ROS水平显著高于骨髓HSPCs(t=68.72、18.89，P＜0.05)，并且呈剂量相关效应，说明照射后胎肝HSPCs和骨髓HSPCs发生氧化应激损伤，并且相较于骨髓HSPCs，胎肝HSPCs氧化应激损伤更重。

注：同一时间胎肝组与骨髓组ROS水平比较，与BM相比，at=68.72、18.89，P＜0.05 图 1 胎肝HSPCs和骨髓HSPCs中ROS的平均荧光强度 Figure 1 Average fluorescence intensity of ROS level in FL- and BM-derived HSPCs

2. 照射后胎肝HSPCs与骨髓HSPCs的DNA损伤比较：利用免疫荧光检测细胞内γ-H2AX形成Foci的数量来评估DNA损伤程度，结果如图 2所示，在受照后12 h胎肝组形成Foci的数量明显多于骨髓组(t=2.27、2.03，P＜0.05)。照射剂量为5 Gy时，胎肝组形成Foci数量>12个的比例有30%，而骨髓组只有12%；在照射剂量为10 Gy时，胎肝组Foci数量>12个的比例达到了52%，骨髓组仅有30%，表明胎肝HSPCs经过照射后DNA损伤更加严重。

注：γ-H2AX用PH2AX (红色) 染色，细胞核用Hoechst33342 (蓝色) 染色，与骨髓组相比，at=2.27、2.03，P＜0.05 图 2 照射后胎肝HSPCs和骨髓HSPCs的DNA损伤比较  A. 每个细胞形成Foci数量; B. 5 Gy照射裂痕细胞所占比例；C.10 Gy照射裂痕细胞所占比例; D. 0、5、10 Gy照射后胎肝和骨髓细胞γ-H2AX染色 Figure 2 Comparison of DNA damage in FL- and BM- derived HSPCs after irradiation  A. Number of Foci formed per cell; B. Distribution of foci number per cell with 5 Gy irradiation; C. Distribution of foci number per cell with 10 Gy irradiation; D. γ-H2AX staining of fetal liver and bone marrow cells after 0, 5, 10 Gy irradiation

3. 照射后胎肝HSPCs与骨髓HSPCs细胞凋亡分析：结果如图 3所示，不同剂量照射下胎肝组的凋亡比例显著高于骨髓组(t=16.21、12.27，P＜0.05)，并且随着照射剂量的增加凋亡比例显著上升，说明电离辐射促进胎肝HSPCs凋亡的作用更明显。

与骨髓组凋亡比例比较，at=16.21、12.27，P＜0.05 图 3 照射后胎肝和骨髓HSPCs细胞凋亡比较 Figure 3 Apoptosis analysis of FL- and BM-derived HSPCs after irradiation

4. 照射后胎肝HSPCs与骨髓HSPCs集落形成能力比较：每组接种8 000个c-Kit⁺进行集落形成能力实验。结果如图 4所示，随着照射剂量增加，两组细胞的集落形成能力均显著降低(t=12.41、15.67、9.46，P＜0.05)，胎肝细胞在5 Gy照射剂量下形成的集落数量明显减少，在10 Gy照射剂量下完全不能形成集落，而骨髓细胞在受到10 Gy照射时还可以形成少量集落，表明电离辐射对胎肝HSPCs克隆形成能力的抑制更加严重。

注：与骨髓组相比，at=12.41、9.46，bt=15.67，P＜0.05 图 4 不同剂量照射后胎肝和骨髓c-Kit+集落数量比较 Figure 4 Comparison of the number of fetal liver and bone marrow c-Kit+ colonies after different doses of irradiation

5. 胎肝HSPCs与骨髓HSPCs体内重建能力比较：移植是评估HSPCs体内功能的金标准。分选胎肝及骨髓中LSK细胞，与竞争细胞混合移植经过致死剂量照射的受体小鼠。取移植后12周的受体小鼠外周血进行嵌合率检测，结果显示胎肝组的嵌合率显著低于骨髓组(t=5.84，P＜0.05)，表明胎肝HSPCs在体内重建造血的能力低于骨髓HSPCs(图 5)。

注：1. B细胞；2. 中性粒细胞；3. 单核细胞；4. 巨噬细胞；5. T细胞。与骨髓组相比，at=5.84、3.82、3.16，P＜0.05; bt=7.63、9.28，P＜0.05; ct=13.84、13.58、9.68，P＜0.05; dt=2.96、2.52、2.89、3.36，P＜0.05 图 5 胎肝与骨髓HSPCs体内重建能力检测  A. 嵌合率；B. 外周血谱系分化比例；C.骨髓谱系分化比例；D.脾脏谱系分化比例；E. 供体来源LSK、MPP、LT-HSC、ST-HSC细胞数；F. 供体来源LSK细胞周期分析；G. 供体来源LT-HSC细胞周期分析 Figure 5 In vivo reconstitution ability assay of FL- and BM- derived HSPCs  A. Chimerism rate; B. Proportion of differentiation in each spectrum of peripheral blood; C. Proportion of differentiation in each spectrum of bone marrow; D. Proportion of differentiation in each spectrum of spleen; E. Number of donor-derived LSK, MPP, LT-HSC, and ST-HSC cells; F. Cycle analysis of donor-derived LSK cells; G. Cycle analysis of donor-derived LT-HSC cells

以B220⁺代表B细胞、以CD3⁺代表T细胞，以CD11b⁺Ly6G⁺代表中性粒细胞、以CD11b⁺Ly6C⁺代表单核细胞、以CD11b⁺F4/80⁺代表巨噬细胞，对外周血、骨髓、脾脏中的谱系进行分析。结果表明外周血中各谱系分布两组无明显差异(P＞0.05，图 5)；胎肝组骨髓、脾脏中性粒细胞、单核细胞等髓系细胞的比例，明显高于骨髓组，表明移植的胎肝HSPCs具有明显的髓系分化倾向(图 5)。

进一步分析了两组小鼠骨髓中供体来源的HSPCs数量。结果显示，胎肝组骨髓LSK、MPP、ST-HSC的细胞数显著低于骨髓组(t=3.82、3.60、2.98，P＜0.05)，LT-HSC细胞数两组差异无统计学意义(P＞0.05)，进一步说明胎肝HSPCs重建能力低于骨髓组(图 5)。

对供体来源HSPCs的细胞周期进行了分析。结果显示，无论是在LSK中还是在LT-HSC中，胎肝组S期比例显著高于骨髓组(t=2.89，P < 0.05)，与骨髓HSPCs相比，胎肝HSPCs更多处于增殖期(图 5 F-G)。

6. 胎肝HSPCs与HSPCs骨髓线粒体呼吸能力比较：有研究显示，线粒体呼吸的过度旺盛是造成造血干/祖细胞辐射敏感性增强的重要原因，因此本研究对比了胎肝HSPCs与骨髓HSPCs线粒体呼吸能力进行检测，结果如图 6所示。胎肝细胞与骨髓细胞最大呼吸能力差异无统计学意义(P＞0.05)；呼吸储备能力胎肝组低于骨髓组(t=5.53，P＜0.05)；基础呼吸能力、质子泄漏、三磷酸腺苷(ATP)产生、耦联效率均高于骨髓细胞(t=39.19、6.64、9.33、7.10，P＜0.05)。该结果表明胎肝HSPCs具有更高水平的基础代谢，ATP产生更高，线粒体呼吸更旺盛。

注：1. 基础呼吸；2. 最大呼吸能力；3. 呼吸储备能力；4. ATP产生；5. 质子泄漏；6. 耦联效率。与骨髓组c-Kit+相比，at=39.19，P＜0.05; bt=5.53、6.64、7.10，P < 0.05; ct=9.33, P < 0.05 图 6 胎肝和骨髓c-Kit+细胞线粒体压力测试实验  A. 线粒体压力测试实验经典海马曲线；B. 对海马曲线OCR的定量分析 Figure 6 Mitochondrial stress test in FL and BM c-Kit+ cells  A. Classical hippocampal curve of mitochondrial stress test; B. Quantitative analysis of the OCR of the hippocampal curve

造血干细胞是造血系统的基础，具有产生所有成熟血细胞的功能，其功能的正常行使对于造血系统稳定的维持是必需的。电离辐射对造血干细胞的影响可能是致命的，可导致氧化应激，DNA损伤等，从而引起造血干细胞耗竭死亡。

胎肝HSPCs由于其发育特点大多数处于代谢活跃，增殖旺盛阶段。有研究表明，放射可特异靶向增殖旺盛的细胞，释放ROS，引起DNA损伤断裂，最终导致细胞死亡^[7-8]。本研究发现相较于骨髓HSPCs，胎肝HSPCs受到电离辐射后ROS水平升高，凋亡增加，集落形成能力降低。免疫荧光染色的结果显示照射后胎肝HSPCs会形成更多的Foci，DNA损伤更重。由此推测强大的DNA损伤修复能力对于胎肝HSPCs的功能维持可能更为必要。事实上，有研究报道，特定DNA损伤修复分子的敲除对胎肝HSPCs比对成体骨髓HSPCs具有更显著的影响^[9]。在胎肝中敲除Fancd2基因会导致集落形成减少，LT-HSC数量显著减少，凋亡增加和DNA损伤升高，以及HSPCs功能下降，但是在成体骨髓中敲除Fancd2只影响了HSPCs的体内与体外功能，对其数量的影响并不明显^[9]。成年小鼠骨髓中静止的HSPCs对DNA损伤具有抵抗力，而增殖性HSPCs在电离辐射时容易发生细胞死亡^[10]。这些研究表明，胚胎期HSPCs更容易被射线、抗肿瘤药物等诱导损伤，必要的防护对于胚胎发育具有重要作用。

在移植过程中，受体经过照射后，释放多种炎症因子，如IL-6β、TNF-α、IL-1、IL-8等^[11]，ROS水平升高^[12]，因此，机体处于高度应激的环境。本研究移植结果显示，胎肝来源的HSPCs移植后嵌合率更低，细胞周期S期比例增加，谱系分化倾向于髓系分化，提示胎肝HSPCs对ROS及炎症因子的攻击更加敏感，导致胎肝来源的HSPCs移植后分化更倾向于髓系分化。而骨髓HSPCs大部分处于静止期，对于移植的应激环境具有一定抵御能力。

有研究表明，线粒体活动的过度旺盛会导致HSPCs对电离辐射更加敏感。SCR-3是一种维持HSC的必需因子，在敲除SCR-3的小鼠骨髓细胞中发现HSPCs的线粒体氧化磷酸化增加，产生的ROS水平增加，从而导致HSPCs稳态被打破，不稳定的HSPCs对于电离辐射更加敏感^[13]。本研究分选胎肝及骨髓的c-Kit⁺细胞进行线粒体压力检测发现，胎肝的c-Kit⁺细胞有着更高的基础呼吸，ATP产生更多，质子泄漏与耦联效率更高，说明胎肝HSPCs的线粒体活动更加旺盛，这一现象可能是造成胎肝HSPCs对电离辐射更加敏感的原因。

本研究在以往对电离辐射影响造血干细胞功能的基础上，全面比较了不同发育阶段的HSPCs的放射敏感性，为深入了解胎肝HSPCs和骨髓HSPCs应对放射应激损伤的具体机制奠定了基础。

利益冲突  无

作者贡献声明  高雅萌负责实验和论文撰写；赵珂、赵雄伟、吕志春、李思雨、武云强、孙慧颖、高慧英、向慎思参与实验操作；李长燕提供研究思路和指导论文修改