2023, Vol. 43
2. 南京医科大学康达学院附属涟水人民医院放疗科, 淮安 223400;
3. 扬州大学医学院临床学院 江苏省中西医结合老年病防治重点实验室, 扬州 225009
2. Department of Radiotherapy, Lianshui People's Hospital, Kangda College of Nanjing Medical University, Huai'an 223400;
3. School of Clinical Medicine, Medical College of Yangzhou University, Jiangsu Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Senile Diseases, Yangzhou 225009, China
放疗是肺癌等胸腔肿瘤的主要治疗手段，但临床应用受限于其对正常组织的损伤，如放射性肺损伤(radiation-induced lung injury，RILI)。RILI一般包括放射性肺炎和放射性肺纤维化两个阶段，RILI发病率较高，对患者的生活质量影响很大，可导致呼吸衰竭甚至死亡[1-2]。目前缺乏有效的治疗方式，主要依靠非特异性和改善症状的治疗，糖皮质激素及抗生素等是最常用的药物[3]，但不良反应较多且对损伤细胞无修复作用，因此积极地探寻更为有效的RILI治疗策略具有重要的临床意义。
消旋山莨菪碱(racanisodamine)是我国首先从茄科植物山莨菪中提取的生物碱，为毒蕈碱型M受体拮抗剂，常用于治疗有机磷中毒、感染性休克、肺动脉瓣闭锁不全以及胃溃疡等疾病用[4-5]。此外，消旋山莨菪碱可缓解博来霉素诱导的急性肺损伤小鼠体内氧化应激、炎症及细胞凋亡情况[6]，还可抑制炎症从而缓解脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的急性肺损伤大鼠模型[7]。消旋山莨菪碱对于丙三醇[8]、LPS[9]、横纹肌溶解[10]等诱导的急性肾损伤同样具有保护作用，但目前尚无研究探讨消旋山莨菪碱对于RILI的保护作用及其机制。本研究基于小鼠RILI模型探究消旋山莨菪碱对于RILI是否具有治疗作用，为临床治疗RILI提供新理论、新方法。
材料与方法1. 主要试剂：消旋山莨菪碱购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、IL-1β试剂盒购自杭州联科生物公司；Diff-Qick染色试剂盒购自北京索莱宝公司，细胞衰老相关半乳糖苷酶染色试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司；核因子E2相关因子2(Nrf2)抗体、p-Nrf2抗体、p62抗体购自武汉三鹰公司；化学发光辣根过氧化物酶(HRP)底物电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)试剂盒购自大连美仑公司。
2. 实验动物及分组：雄性C57BL/6小鼠20只，6~8周龄，体重16~18 g，购自南京集萃药康生物科技公司，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2018-0008。饲养环境：22℃~25℃，湿度55%~65%。适应喂养1周后，根据随机数表法分为4组：对照组(不接受辐照)、模型组(接受一次性18 Gy全肺辐照)、给药组(不接受辐照，但注射消旋山莨菪碱)、治疗组(接受一次性18 Gy全肺辐照并给予消旋山莨菪碱治疗)。每组5只，自由摄食饮水。给药组和治疗组照射前3天给予消旋山莨菪碱注射液腹腔注射(5 mg/kg)，辐照后每隔1天给药，直至实验结束。
3. 照射条件及RILI造模方法：利用10%水合氯醛经腹腔注射(0.35 ml/100 g)麻醉小鼠，将其四肢及头部充分拉伸后固定于特制的胸部照射装置上。将小鼠置于CT扫描床，行1.8 mm薄层扫描，后将所得图像传至加速器Eclipse计划系统便于后续肺部靶区勾画，针对肺部的靶区，采用美国瓦里安23-EX直线加速器进行6 MV X射线照射，源皮距100 cm，剂量率300 cGy/min，总照射剂量18 Gy。
4. 标本采集与处理：照射后6周处死小鼠，眼球取血，3 000 r/min，离心半径8.37 cm，4℃离心10 min，取上清，-80℃冻存备用。小鼠处死后暴露气管，采用自制软管采集肺泡灌洗液，回收的灌洗液4℃，1 500 r/min，离心半径8.37 cm，离心10 min，回收上清置于-20℃用于细胞因子检测，细胞沉淀进行Diff-Qick染色。左肺一半组织用4%多聚甲醛溶液固定，用于病理观察及免疫组化；另一半进行冰冻切片留作衰老相关染色。右肺组织置于-80℃留作RNA及蛋白提取。
5. 肺组织病理学观察及评分：取肺组织制作石蜡包埋切片，5 μm切片脱蜡后，苏木素-伊红(HE)染色，显微镜观察并作图像采集分析。肺损伤评分参照文献[11]：根据肺泡间隔增宽、肺泡腔内纤维化渗出的严重度、血管周围炎细胞浸润的程度进行分类评分，根据病变程度分为：0分，正常；1分，轻度；2分，中度；3分，重度；4分，极重度。合并各项后记分。
6. 酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清及肺泡灌洗液中炎症因子：取血清及肺泡灌洗液，TNF-α、IL-6、IL-1β按照试剂盒说明书检测，酶标仪450 nm波长检测吸光度(A450)值，根据标准曲线计算各因子表达。
7. Diff-Qick染色：根据试剂盒说明书进行，取肺泡灌洗液中的细胞沉淀，常规法制备细胞涂片，自然干燥，后用Diff-Quik Fixative固定20 s。Diff-QuikⅠ染色5~10 s。Diff-QuikⅡ染色10~20 s。显微镜下观察，二甲苯透明，封固、保存。
8. 细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase, SA-β-Gal)检测：按照试剂盒说明进行操作，肺组织冰冻切片，复温后用磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡洗涤组织3次，每次不少于5 min；加入适当体积的SA-β-Gal染色固定液，室温固定15 min；PBS浸泡洗涤组织3次；加入染色工作液，37℃孵育过夜，镜下观察拍照。
9. 组织免疫化学染色：取肺组织石蜡切片，脱蜡、水化和抗原修复，封闭60 min，去封闭液，用稀释的特定一抗作用60 min，4℃过夜；去除一抗，加入HRP标记二抗避光孵育60 min，镜下观察拍照。
10. Western blot检测相关蛋白：按照试剂盒说明提取肺组织总蛋白，BCA法测定浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、湿法转膜、脱脂牛奶封闭。一抗Nrf2、p-Nrf2 1 ∶2000稀释，p62 1 ∶3 000稀释，4℃过夜后二抗(1 ∶10 000稀释)室温孵育1 h，按照ECL化学发光试剂盒说明操作，ImageJ软件分析条带灰度值。
11. 统计学处理：利用GraphPad Prism8进行实验数据分析。数据符合正态分布，以x±s表示。组间比较采用独立样本t检验，多组数据比较经方差齐性检验后，采用单因素ANOVA方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1. 各组小鼠体重变化：对照组小鼠精神状态良好、饮水及进食量均正常，体重增加；模型组小鼠自辐照后第5~7天出现精神变差，饮水及进食量减少；第14天逐渐出现皮肤欠光泽，甚至背部区域脱毛现象，治疗组与模型组情况相似。与模型组比较，治疗组至第6周体重增加，差异具有统计学意义[(27.59±0.66)g vs. (28.83±0.60)g，t=3.09，P < 0.05]。
2. 肺组织病理学改变及评分：HE染色显示，对照组小鼠肺组织的肺泡壁较薄，肺泡结构清晰，毛细血管完整，无充血及水肿，也无炎症细胞浸润，给药组与对照组相似(图 1B)；模型组小鼠肺组织以渗出性病变为主，肺组织间质明显水肿，肺泡隔增大，支气管周围出现炎性细胞浸润(图 1C)；治疗组可见少许炎性细胞浸润，肺组织间质稍有水肿，肺泡壁毛细血管略充血，肺泡壁轻度增厚，整体较模型组明显减轻(图 1D)；与模型组相比，治疗组的HE评分降低，差异具有统计学意义(7.4±0.55 vs. 4.4±0.55，t=8.66，P < 0.01)。
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图 1 各组小鼠肺组织病理形态的改变 HE染色 ×100 A. 对照组；B. 给药组；C. 模型组；D. 治疗组 Figure 1 The pathological changes in lung tissue of mice at 6 weeks post-irradiation HE staining ×100 A. Control group; B. Racanisodamine group; C. Model group; D. Treatment group |
3. 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)及全身炎症情况：Diff-Qick染色细胞显示，与对照组相比，模型组小鼠BALF中细胞明显增多(t=15.20，P < 0.01，图 2A、2B、图 3A)；蛋白浓度升高(t=10.53，P < 0.01，图 3B)，TNF-α显著升高(t=36.13，P < 0.01，图 3C)；而消旋山莨菪碱可以显著减少BALF中的细胞数量(t=10.70，P < 0.01，图 2D、图 3A)、蛋白浓度(t=6.75，P < 0.01，图 3B)及炎性细胞因子分泌(t=8.21，P < 0.01，图 3C)。此外，与模型组相比，治疗组小鼠血清中TNA-α、IL-6、IL-1β等细胞因子的表达分泌明显减少(t=8.17、6.54、4.58，P < 0.01，表 1)。
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图 2 各组小鼠肺泡灌洗液(BALF)的改变 Diff-Qick染色 ×100 A. 对照组；B. 给药组；C. 模型组；D. 治疗组 Figure 2 The changes of bronchoalveolar lavage fluid at 6 weeks post-irradiation Diff-Qick staining ×100 A. Control group; B. Racanisodamine group; C. Model group; D. Treatment group |
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注：1. 对照组；2. 给药组；3. 模型组；4. 治疗组；a与对照组比较，t=15.20、10.53、36.13，P < 0.01；b与模型组比较，t=10.70、6.75、8.21，P < 0.05 图 3 各组小鼠肺泡灌洗液(BALF)中细胞、蛋白浓度及炎症因子改变 A. 浸润性细胞数；B. 蛋白浓度；C. TNF-α Figure 3 The changes of bronchoalveolar lavage fluid at 6 weeks post-irradiation A. Infiltrated cells; B. Protein concentration; C. TNF-α |
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表 1 4组小鼠照射6周后血清炎症因子的表达(pg/ml，x±s) Table 1 Expression of serum inflammatory factors in each group at 6 weeks post-irradiation (pg/ml, x±s) |
4. 肺组织细胞衰老：SA-β-gal活性的测定是鉴定细胞衰老最常用的方法之一。与对照组相比，模型组C57BL/6小鼠肺组织上皮细胞SA-β-gal活性明显增强(图 4A)，细胞衰老明显，而治疗组SA-β-gal活性明显降低(图 4D)，提示消旋山莨菪碱可以减少肺组织的细胞衰老。
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图 4 各组小鼠肺组织细胞衰老情况 SA-β-Gal染色 ×400 A. 对照组；B. 给药组；C. 模型组；D. 治疗组 Figure 4 Cell senescence in the lung tissues of four group of mice SA-β-Gal staining ×400 A. Control group; B. Racanisodamine group; C. Model group; D. Treatment group |
5. 肺组织Nrf2表达：Nrf2是抑制细胞衰老的重要靶标之一。免疫组织化学染色结果显示，与模型组相比，治疗组Nrf2的表达增强(图 5)。Western blot也显示，Nrf2及磷酸化Nrf2的蛋白表达增加(t=6.42、7.30，P < 0.01)，说明Nrf2入核量增加。此外，还发现治疗组与自噬相关的p62表达降低，差异具有统计学意义(t=4.62, P < 0.01)，见图 6。
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图 5 消旋山莨菪碱对Nrf2活性的影响 免疫组织化学染色 ×100 A. 对照组；B. 给药组；C. 模型组；D. 治疗组 Figure 5 Effect of racanisodamine on the activity of Nrf2 Immunohistochemistry ×100 A. Control group; B. Racanisodamine group; C. Model group; D. Treatment group |
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注：1. 对照组；2. 给药组；3. 模型组；4. 治疗组；a与模型组比较，t=6.42，P < 0.01 图 6 消旋山莨菪碱对Nrf2、p-Nrf2及p62蛋白表达的影响 A. Western blot检测Nrf2、p-Nrf2、p62蛋白表达；B. Nrf2蛋白相对表达量 Figure 6 Effect of racanisodamine on the protein expressions of Nrf2, p-Nrf2 and p62 A. NRF2, p-NRF2 and p62 were detected by Western blot; B. Relative protein expression of Nrf2 |
讨论
RILI是照射后涉及多种细胞、细胞因子及信号通路的复杂网状动态反应过程。辐照导致肺泡屏障功能损伤，促炎性、促纤维化及促血管生成的细胞因子大量产生，使得一种非正常修复性的组织反应长期存在，最终导致慢性放射性肺损伤的发生[12]。
消旋山莨菪碱在急性肺损伤、急性肾损伤等疾病中也具有治疗前景，而其作用的发挥与其抗炎、抗氧化能力密切相关[8-10]。但目前尚无研究报道消旋山莨菪碱在RILI中的保护作用及其机制。本研究中，发现消旋山莨菪碱可以减轻RILI小鼠的肺组织及全身炎症，减少BALF中炎性细胞浸润及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β分泌，RILI的急性反应阶段，上述细胞因子的持续分泌与DNA损伤及氧化压力有关，也与细胞衰老有关[13]。免疫细胞在肺部内稳态的调节过程中发挥了重要作用，辐照导致肺部免疫细胞特别是组织内原巨噬细胞大量减少，刺激免疫系统吸引外周循环系统的炎性细胞进入损伤部位，进一步导致免疫系统的调节失衡。本研究发现，消旋山莨菪碱可以减少BALF中浸润性炎性细胞的数量、蛋白浓度及TNF-α分泌，进一步说明了消旋山莨菪碱对炎症的缓解。
近年来，电离辐射导致的细胞衰老在RILI发生发展中的作用越来越受到广泛关注。SA-β-gal活性的测定是鉴定细胞衰老最常用的方法之一[14]。此外，衰老细胞表现出一种分泌多种细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶及生长因子的表型，称为衰老细胞相关分泌表型(senescence associated secretory phenotype, SASP)，包括IL-1、IL-6、TNF-α、CXCL1、CCL2、MMPs等。SASP因子常被作为细胞衰老的间接证据用于衰老细胞的鉴定[15]。本研究中，辐照组SA-β-gal染色阳性细胞比例增加，说明辐照导致了肺组织的细胞衰老，而消旋山莨菪碱可减少SA-β-gal染色阳性的细胞比例，提示消旋山莨菪碱可减轻辐照导致的细胞衰老。衰老细胞可通过多种机制促进RILI的发展，比如诱导肺泡表皮干细胞耗竭、诱导慢性氧化应激及炎症、破坏正常组织结构及功能[16-18]。目前，抑制细胞衰老和延缓机体衰老的分子靶标包括FoxO、SIRT和Nrf2等。其中，Nrf2是体内主要的氧化应激应答因子之一，其结合到抗氧化反应元件(antioxidant response elements, AREs)后以转录激活的形式激活多种抗氧化剂细胞保护性基因的表达[19]；此外，Nrf2还可能与NF-κB相互作用以调节TNF-α等炎症因子的表达[20]。Nrf2通路与细胞衰老相关疾病密切相关[21-22]，而Nrf2通路在RILI中也具有重要的保护作用[23-25]。Li等[26]研究发现，p62-Keap1-Nrf2通路的激活可通过抑制铁死亡发挥对RILI的保护作用。本研究中，消旋山莨菪碱增强了小鼠肺组织Nrf2的表达，促进了Nrf2的入核，减少了肺组织炎症因子分泌及增强肺组织抗氧化能力，结合上述SA-β-gal染色结果可以推测，消旋山莨菪碱很可能激活了Nrf2，从而抑制了细胞衰老，最终缓解了RILI。此外，本研究发现消旋山莨菪碱在激活Nrf2的同时，p62的表达减少，而p62蛋白是一种自噬底物蛋白，其表达水平通常与细胞内自噬水平成反比[27]。p62还能与Keap1竞争性结合Nrf2，促进Nrf2与Keap1的解离，从而促进Nrf2的表达，这也提示本研究中消旋山莨菪碱对于Nrf2的激活很可能与Keap1的p62依赖性自噬降解有关，但仍需更多实验验证。
综上，本研究发现消旋山莨菪碱可以减轻RILI，且这一作用可能与Nrf2通路的激活及减少的细胞衰老有关。该发现可能为RILI的深层发病机制及寻找RILI的新治疗策略提供理论依据。本研究还存在一定的缺陷，如动物辐照剂量及干预时间点单一，缺乏RILI在小鼠体内的进行性发展过程及相应的鉴定指标。此外，对于肺组织衰老细胞的来源鉴定及消旋山莨菪碱激活Nrf2的深层分子机制(抑制其降解或促进其表达)还需进一步实验验证。
利益冲突 研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突，排名无争议
作者贡献声明 郭浩淳、陈佳佳负责小鼠饲养及模型建立，免疫组织化学及蛋白印迹实验，并撰写论文；濮娟负责论文审阅；丁洲、郁汉旭协助小鼠模型建立时的靶区划定；董磊参与论文修改；张海军、王万鹏指导实验设计及论文修改
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